王志芳 潘琪 張賓 徐展瓊 方永奇 王南卜

神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerative diseases,ND)是一類由于大腦和脊髓的神經(jīng)元細(xì)胞變性、丟失而引起的一類不可逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,以發(fā)作遲緩和選擇性神經(jīng)元的功能障礙為特征,主要包括阿爾茨海默癥(alzheimer disease,AD)、帕金森氏病(parkinson’s disease,PD)和肌萎縮性側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)[1]?，F(xiàn)在對于ND以藥物治療為主,如多奈哌齊改善AD患者的認(rèn)知功能[2];左旋多巴緩解PD運(yùn)動(dòng)功能障礙等[3]。天南星科植物的干燥根莖石菖蒲已經(jīng)被證實(shí)對ND相關(guān)疾病具有緩解作用。石菖蒲及其揮發(fā)油對AD[4-6]和PD[7-8]模型動(dòng)物都具有緩解癥狀改善病理狀態(tài)的作用,通過分析石菖蒲中何種成分對ND的治療發(fā)揮主要作用有助于推動(dòng)石菖蒲治療ND的機(jī)制研究。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)原理篩選出石菖蒲治療ND的主要靶點(diǎn),結(jié)合已發(fā)現(xiàn)的石菖蒲中揮發(fā)油類物質(zhì)是開竅醒神作用的主要有效成分[9]。探討石菖蒲治療ND的潛在分子機(jī)制與信號(hào)通路,為今后研究石菖蒲治療ND提供更深層次的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 石菖蒲主要有效成分與靶點(diǎn)收集

以“Acorus tatarinowii Schott”為關(guān)鍵詞,通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)TCMSP(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform)數(shù)據(jù)庫(http:// ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)、Pubmed和中國知網(wǎng)已發(fā)表的文獻(xiàn)收集石菖蒲的有效成分與靶點(diǎn)。并篩選出符合口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,血腦屏障通透性(blood brain barrier,BBB)≥-0.3,類藥性指數(shù)篩選(drug like index,DL)≥0.10條件的成分,導(dǎo)入TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取相應(yīng)靶點(diǎn),并用Uniprot數(shù)據(jù)(https://www.uniprot.org/)以物種名稱“Homo sapiens”為物種名稱,篩選已經(jīng)驗(yàn)證的靶點(diǎn)作為石菖蒲的有效成分或靶點(diǎn)。

1.2 神經(jīng)退行性疾病靶點(diǎn)的收集

以“Alzheimer disease”“Parkinson’s disease”“amyotrophic lateral sclerosis”為關(guān)鍵詞,通過geneCards(https://www.genecards.org/),OMIM(https://www.omim.org/),TTD(https://ngdc.cncb.ac.cn/)三大數(shù)據(jù)庫收集疾病靶點(diǎn),OMIM數(shù)據(jù)庫和TTD數(shù)據(jù)庫未設(shè)置篩選條件,gene Cards數(shù)據(jù)庫設(shè)定相關(guān)性評分(Relevance score)>10為篩選靶點(diǎn)。整合以上數(shù)據(jù)庫獲得的靶點(diǎn),將得到的靶點(diǎn)基因名稱用Uniprot數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化成相對應(yīng)的基因名稱,合并去重得到ND最終相關(guān)靶點(diǎn)蛋白。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

利用R語言獲得石菖蒲活性成分靶點(diǎn)和ND靶點(diǎn)交集靶點(diǎn)的韋恩圖,其共有靶點(diǎn)作為石菖蒲治療ND的潛在作用靶點(diǎn),借助String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl),以物種為“Homo sapiens”,最小相互作用閾值為0.9作為條件,獲得蛋白—蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)關(guān)系后,通過Cytoscape_v3.8.0繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。然后將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscape 3.8.0中,通過NetworkAnalyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治?以degree, betweenness centrality,average shortest path length和closeness centrality這四個(gè)參數(shù)為參考標(biāo)準(zhǔn),通過degree排序,選取分值大于2倍平均分的基因作為關(guān)鍵靶點(diǎn),篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn),以橫坐標(biāo)為每個(gè)靶點(diǎn)的度值,將這些靶點(diǎn)使用R 4.0.3進(jìn)行圖片繪制。

1.4 GO功能分析和KEGG通路富集分析

將石菖蒲和ND的交集基因列表導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫,并應(yīng)用R 4.0.3進(jìn)行功能富集和主要通路分析。使用Bioconductor生物信息軟件包,以P<0.05和qvalue<0.05為篩選條件,對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO(Gene ontology)生物過程富集分析與京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析,將得到的結(jié)果用ggplot2包繪制成氣泡圖及柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 石菖蒲有效成分及靶點(diǎn)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫平臺(tái)檢索得到石菖蒲有效成分105個(gè),根據(jù)OB≥30%,BBB≥-0.3,OL≥0.10的篩選條件,獲得有效成分24個(gè)。在Pubmed或中國知網(wǎng)檢索得到的文獻(xiàn)證實(shí)β-細(xì)辛醚(beta-asarone)、甲基丁香酚(Methyleugenol)、欖香素(Elemicin)是石菖蒲的重要成分[10]。因此,共獲得石菖蒲活性成分27個(gè),具體見表1。用Uniprot數(shù)據(jù)庫將蛋白名稱轉(zhuǎn)換為基因名,得到靶基因43個(gè)。

表1 石菖蒲部分活性成分基本信息表

2.2 神經(jīng)退行性疾病相關(guān)靶點(diǎn)

將geneCards,OMIM,TTD三大數(shù)據(jù)庫收集得到AD、PD和ALS的疾病靶點(diǎn)合并去重后,分別為15357、658、204個(gè),三種疾病合并去重后共收集基因15929個(gè)。

2.3 石菖蒲—活性成分—共同靶點(diǎn)—神經(jīng)退行性疾病網(wǎng)絡(luò)圖

將石菖蒲有效成分靶點(diǎn)和ND靶點(diǎn)輸入R語言的“Venn Diagram”包獲得二者相關(guān)韋恩圖(圖1),獲得交集靶點(diǎn)41個(gè),獲取候選化合物中與交集靶點(diǎn)相關(guān)的活性成分。將篩選后的石菖蒲的主要活性成分(表1)的MOLID及對應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape_v3.8.0,生成石菖蒲可視化活性成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)包括石菖蒲、石菖蒲有效成分、ND及相關(guān)靶點(diǎn),連線表示節(jié)點(diǎn)之間的聯(lián)系。見圖2。

圖1 石菖蒲治療ND的藥物—疾病共同靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 石菖蒲治療ND的“藥物—活性成分—共同靶點(diǎn)—疾病”

2.4 石菖蒲和神經(jīng)退行性疾病靶蛋白相互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

將石菖蒲-ND的共有靶點(diǎn)借助String數(shù)據(jù)庫,獲得PPI網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)中有41個(gè)節(jié)點(diǎn),142條邊,平均度值為6.93。將PPI進(jìn)行拓?fù)浞治?選取分值大于2倍平均分的基因作為關(guān)鍵靶點(diǎn),以橫坐標(biāo)為每個(gè)靶點(diǎn)的度值,總共篩選出個(gè)18關(guān)鍵靶點(diǎn),見圖3。 將度值由高到低排序,其中原癌基因蛋白(Proto-oncogene c-Fos,Fos)、乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinest-erase ,ACHE)、溶質(zhì)載體家族6成員4(Solute Carrier Family 6 Member 4, SLC6A4)、腎上腺素能α1B受體(Adrenergic, alpha-1B-, receptor, ADRA1B)、腎上腺素能α2A受體(Adrenergic, alpha-2A-, receptor, ADRA2A)、單胺氧化酶B(Monoamine Oxidase B, MAOB)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2基因(Prostaglandin G/H synthase 2, PTGS2)、腎上腺素能α1A受體(Adrenergic, alpha-1A-, receptor, ADRA1A)等的度值排名較靠前,見表2,提示這些靶點(diǎn)可能是治療此類疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖3 石菖蒲治療ND的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 石菖蒲與神經(jīng)退行性疾病靶點(diǎn)的功能和通路富集分析

將石菖蒲治療ND的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO 的生物過程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)、細(xì)胞組分(cell component, CC)富集,引用String數(shù)據(jù)庫,將校正值P<0.05的項(xiàng)目進(jìn)行篩選,交集靶點(diǎn)總共富集到364條生物過程,91項(xiàng)分子功能相關(guān),43項(xiàng)細(xì)胞組成相關(guān),并繪制成柱狀圖,見圖4。結(jié)果表明,主要涉及到了前的有G蛋白偶聯(lián)的胺受體活性、腎上腺素受體活性、兒茶酚胺結(jié)合、類固醇激素受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等。

圖4 石菖蒲治療ND的潛在作用靶點(diǎn)的GO分析

將石菖蒲治療ND的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析,引用String數(shù)據(jù)庫,將校正值P<0.05的項(xiàng)目進(jìn)行篩選,總共富集到28條信號(hào)通路,繪制成柱狀圖和氣泡圖,見圖5。結(jié)果提示,神經(jīng)活性配體—受體相互作用通路、鈣信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路和唾液分泌通路富集到了較多的基因且其富集因子較高。

圖5 石菖蒲治療ND的潛在作用靶點(diǎn)的KEGG信號(hào)通路富集分析

3 討論

ND的致病因素非常多樣,現(xiàn)有藥理研究阻斷一個(gè)或兩個(gè)途徑不能明顯減少神經(jīng)元全面的功能障礙和損失。且此類疾病伴隨的病理變化通常是不可逆的,在患者出現(xiàn)認(rèn)知或運(yùn)動(dòng)障礙等臨床癥狀時(shí),病程往往已到中晚期,此時(shí)介入治療不能從根本上逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元的損傷。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為ND屬于中醫(yī)“癡呆”“顫證”“偏癱”等范疇,為本虛標(biāo)實(shí)之證,病因主要因?yàn)楦鞣N致病因素導(dǎo)致痰濁上蒙清竅,當(dāng)采用化痰開竅醒神的治療方法。如ALS病因可由于外感溫濕邪毒等致臟腑虧虛、肌肉筋脈失養(yǎng)[11]。王永炎院士認(rèn)為氣血虧虛,痰、濁和瘀是AD的病因[12]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),具有芳香開竅作用的中藥對AD和PD等神經(jīng)退行性疾病的治療和基礎(chǔ)研究,可以有效的改善患者癥狀的臨床作用[13]。所以,在治療方面應(yīng)以清熱化痰息風(fēng)、活血化瘀息風(fēng)為主。石菖蒲具有化濁祛痰、開竅寧神的作用,常用于ND的治療。

在本研究的石菖蒲主要成分靶點(diǎn)和ND相關(guān)靶點(diǎn)中,交集靶點(diǎn)達(dá)到41個(gè),提示石菖蒲治療ND可能是多成分、多靶點(diǎn)共同作用的結(jié)果,如別香樹烯、白菖油萜 、異紫花前胡內(nèi)酯、佛手苷內(nèi)酯、β-細(xì)辛醚、甲基丁香酚、欖香素等成分都具有開發(fā)成治療ND藥物的潛在市場。前期研究發(fā)現(xiàn),從石菖蒲中提取的β-細(xì)辛醚可激活PINK1-Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬而影響AD的病理,改善APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)和認(rèn)知障礙[14],發(fā)揮快速抗AD的作用[15]。 在β-細(xì)辛醚對PD模型大鼠作用效果的研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng)β-細(xì)辛醚聯(lián)合左旋多巴可增PD大鼠的強(qiáng)紋狀體中多巴脫羧酶表達(dá)及兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶、酪氨酸羥化酶水平,提高紋狀體中多巴胺水平,具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[16]。

根據(jù)石菖蒲和ND的共有靶點(diǎn)預(yù)測主要涉及的基因蛋白有FOS、ACHE、SLC6A4、ADRA1B、ADRA2A、MAOB、PTGS2、ADRA1A等靶點(diǎn)可能是治療此類疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),石菖蒲揮發(fā)油可抑制炎性痛大鼠L4～6段脊髓中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK1/2)、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)和Fos表達(dá)[17],且海馬、下丘腦FOS的表達(dá)可影響幼齡仔鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力[18]。AChE和Aβ聚集抑制劑具有神經(jīng)保護(hù)作用,可被作為治療阿爾茨海默病的先導(dǎo)化合物[17]。SLC6A4的表達(dá)跟神經(jīng)的生理功能關(guān)系密切[19],其表達(dá)異常會(huì)導(dǎo)致小鼠腦內(nèi)5 -羥色胺的表達(dá)水平,從而影響小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力[20]。ADRA2B的一種常見遺傳多態(tài)性導(dǎo)致位于該蛋白第三個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)上的三種谷氨酸缺失,與情緒事件增強(qiáng)的記憶形成有關(guān)[21]。在交集靶點(diǎn)涉及的通路中神經(jīng)活性配體—受體相互作用通路、鈣信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路等信號(hào)通路中,主要涉及神經(jīng)的傳遞和突觸的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān),影響記憶能力和運(yùn)動(dòng)能力[22]。

綜上所述,本研究系統(tǒng)闡述了石菖蒲治療ND的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制,為深入研究提供了相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。我們后續(xù)會(huì)進(jìn)一步對石菖蒲治療ND相關(guān)疾病的成分篩查和靶點(diǎn)或通路的驗(yàn)證提供更多依據(jù)。