白相書， 黃 曼， 田云娜， 徐俊鵬， 袁琳波， 張 賽△， 王萬(wàn)鐵△

（1溫州醫(yī)科大學(xué)附屬平陽(yáng)醫(yī)院/平陽(yáng)縣人民醫(yī)院公共衛(wèi)生科，浙江 平陽(yáng) 325400；2溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系，浙江 溫州 325035）

低氧性肺動(dòng)脈高壓（hypoxic pulmonary hypertention， HPH）是高原常見的低氧誘導(dǎo)疾病，通常會(huì)導(dǎo)致平均肺動(dòng)脈壓和右心肥厚指數(shù)升高［1］。臨床數(shù)據(jù)表明HPH 是一種預(yù)后差，病死率高的疾?。?］，HPH 的病理生理基礎(chǔ)包括肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）增生、肺血 管收 縮 和 原 位血 栓形 成［3］。HPH 的形成及發(fā)展主要與低氧性肺血管收縮及肺血管重建有關(guān)［4］，血管平滑肌細(xì)胞的增殖對(duì)于HPH 肺血管重構(gòu)（pulmonary vascular remodeling， PVR）來(lái)說至關(guān)重要。到目前為止對(duì)于PASMCs 增殖的分子機(jī)制研究尚不清晰明確，因此對(duì)于其具體分子機(jī)制的探討就顯得尤為重要。

有研究表明，血管平滑肌細(xì)胞衍生的Notch3 信號(hào)通路是主動(dòng)脈高肌化和血管開放喪失的關(guān)鍵中介［5］，Notch 是調(diào)節(jié)血管形態(tài)結(jié)構(gòu)改變的基本信號(hào)機(jī)制之一［6］，Notch 信號(hào)與血管形態(tài)和功能密切相關(guān)，Notch 信號(hào)通路調(diào)控肺動(dòng)脈血管重構(gòu)，參與血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的分化和凋亡，對(duì)維持血管穩(wěn)態(tài)具有重要作用［7-8］。肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)Notch3的過度表達(dá)是人類肺動(dòng)脈高壓的主要特點(diǎn)［9］，因此，本研究探究三七總皂苷（Panax notoginsengsaponins， PNS）是否通過Notch3 信號(hào)通路改善HPH 以及其機(jī)制，以期為臨床防治HPH 提供新的治療思路和方法。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞與試劑

大鼠PASMCs 購(gòu)自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠Notch3、Hes-1、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）和caspase-3 抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購(gòu)于Biosharp；CCK-8 試劑盒購(gòu)于Dojindo；BeyoClick? EdU-488 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天公司；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于翌圣生物科技（上海）股份有限公司；Notch3 通路γ-分泌酶抑制劑DAPT｛N-［N-（3，5-difluorophenacetyl）-L-alanyl］-S-phenylglycinet-butyl ester｝濃 度 為20 mmol/L，DMEM稀釋到使用濃度10 μmol/L。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞模型制備及分組 取3~9 代的原代PASMCs 細(xì)胞饑餓處理24 h，隨機(jī)分為6 組：正常對(duì)照（control， Con）組、低氧（hypoxia， Hypo）組、Hypo+PNS 組、Hypo+DAPT 組、Hypo+過表達(dá)Notch3（Hypo+Notch3）組和Hypo+Notch3+PNS 組。根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)分組加入不同的培養(yǎng)混合液。Con 組置于常氧（21%O2、5% CO2、74% N2）箱內(nèi)培養(yǎng)48 h；Hypo組用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，Hypo+PNS 組用完全培養(yǎng)基配制100 mg/L PNS 培養(yǎng)，Hypo+DAPT 組用完全培養(yǎng)基配制10μmol/L DAPT 培養(yǎng)，Hypo+Notch3 組過表達(dá)Notch3 按照Lip2000的試劑盒處理24 h后，換用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，Hypo+Notch3+PNS 組過表達(dá)Notch3 按照質(zhì)粒說明書處理24 h 后，換用完全培養(yǎng)基配制的100 mg/L PNS 培養(yǎng)，后5 組均置于低氧（5% O2、6% CO2、89% N2）箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。

2.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞的活性 配制CCK-8 工作液。將準(zhǔn)備進(jìn)行操作的96 孔板從培養(yǎng)箱中取出，用200 μL 移液槍將舊培養(yǎng)基吸出，用PBS 洗1 遍。棄去PBS后，每孔加入110 μL配制好的CCK-8工作液；放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h；最后用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)量吸光度（A）值。

2.3 EdU 檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞接種于24 孔板，造模處理后，每孔加入EdU 工作液500 μL，原培養(yǎng)液保留，繼續(xù)孵育細(xì)胞2 h；去除培養(yǎng)液加1 mL 固定液（4%多聚甲醛），洗3 次，每次5 min；每孔加1 mL通透液，室溫15 min，PBS洗3次，每次5 min；每孔加0.5 mL click 反應(yīng)液，避光孵育30 min，洗3 次，每 次5 min；每 孔1 mL 1× Hoechest 33342，避光孵育10 min，洗3 次，每次5 min。封片后用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。

2.4 TUNEL 檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 將自然晾干的細(xì)胞爬片浸入固定液，室溫固定20 min；PBS 漂洗3 次，每次5 min；將樣本浸入通透液中，37 ℃ 、10 min；PBS漂洗3次，每次5 min；后續(xù)操作按照試劑盒進(jìn)行。最后使用倒置顯微鏡進(jìn)行拍照觀察，計(jì)算TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例。

2.5 RT-qPCR 檢測(cè)PASMCs 中Notch3、Hes-1、PCNA和caspase-3的mRNA 表達(dá)水平 造模結(jié)束的細(xì)胞去除培養(yǎng)液并洗滌后，10 cm培養(yǎng)皿中加入1 mL Trizol，加入Trizol 后需上下顛倒混勻10 次左右，冰上放置10~15 min；加氯仿200 μL（大約占總體積的1/5），用槍頭吹打充分混勻后，上下顛倒混勻10 次并劇烈搖晃，置冰上反應(yīng)10~15 min；4 ℃、12 000 r/min 離心25 min，轉(zhuǎn)上層水相于另一個(gè)1.5 mL EP管中，異丙醇體積與上層水相體積相同，上下顛倒混勻10~15 次后，冰上放置15 min 至20 min，再次離心收集RNA。測(cè)完RNA 濃度后，進(jìn)行cDNA 合成、gDNA 去除及qPCR體系與條件的操作，以2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA 相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

2.6 Western blot 檢測(cè)Notch3、Hes-1、PCNA 和caspase-3 的蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞造模結(jié)束后，從37 ℃培養(yǎng)箱中取出置于冰上，用預(yù)冷過的PBS 按照每孔1~2 mL 加入每孔中洗滌3 次，隨后加入適量細(xì)胞裂解混合液到每孔進(jìn)行裂解30 min，離心后收集上清。將每組的蛋白濃度統(tǒng)一稀釋成定量濃度（5 mg/L），再置于滾沸的開水中煮8~10 min 備用。每組加20μg蛋白樣品進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完成后，用鑷子將膜緩慢取出放入到10%脫脂奶粉溶液中浸沒，隨后將盒子放到搖床上孵育至少2 h。加入Ⅰ抗（Notch3、Hes-1、PCNA 和caspase-3 抗體均為1∶1 000 稀釋，內(nèi)參照β-actin 為1∶5 000 稀釋）放置于4 ℃搖床上過夜。次日將孵育的Ⅰ抗用移液槍進(jìn)行回收，迅速的沿盒子邊緣加入TBST，漂洗4 次，每次5 min，洗滌后孵育Ⅱ抗。Ⅱ抗孵育結(jié)束后，用TBST洗膜4次，每次5 min。于曝光儀中將化學(xué)發(fā)光液均勻滴加到PVDF膜上，曝光并保存結(jié)果。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組樣本均數(shù)比較先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度PNS對(duì)PASMCs活力的影響

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，400、800、1 600 mg/L PNS可顯著降低正常培養(yǎng)的PASMCs 活力（P<0.01），僅在200 mg/L 的濃度以下，PNS 對(duì)細(xì)胞活性不產(chǎn)生明顯影響（P>0.05），見圖1。而在低氧培養(yǎng)條件下，低氧組PASMCs 細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)（P<0.05），PNS 濃度在100、200 mg/L 時(shí)可顯著下調(diào)低氧處理的PASMCs 細(xì)胞活性（P<0.01）。因此后續(xù)選擇100 mg/L的PNS濃度用于抑制細(xì)胞活力，見圖2。

Figure 1.Effects of different concentrations of Panax notoginseng saponins （PNS） on the viability of rat pulmonary artery smooth muscle cells （PASMCs） under normoxia condition.Mean±SD.n=3.*P<0.05， **P<0.01 vs 0 mg/L group.圖1 不同濃度PNS 對(duì)正常氧條件下大鼠PASMCs 活力的影響

Figure 2.Effects of different concentrations of Panax notoginseng saponins （PNS） on the viability of rat pulmonary artery smooth muscle cells （PASMCs） induced by hypoxia （Hypo）.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control（Con） group； ##P<0.01 vs Hpyo group.圖2 不同濃度PNS對(duì)低氧條件下大鼠PASMCs活力的影響

2 PNS對(duì)PASMCs增殖的影響

EdU 染色陽(yáng)性細(xì)胞為綠色，藍(lán)色代表細(xì)胞核。低氧組相對(duì)于對(duì)照組而言出現(xiàn)明顯細(xì)胞增殖（P<0.01）；給予PNS干預(yù)后，PASMCs增殖能力明顯低于低氧組（P<0.01）；給予Notch3 抑制劑DAPT 干預(yù)后，增殖能力較低氧組明顯減弱（P<0.01），見圖3。

Figure 3.The proliferation of rat pulmonary artery smooth muscle cells （PASMCs） on each group detected by EdU staining （×200）.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control （Con） group； ##P<0.01 vs hypoxia （Hypo） group.圖3 EdU染色檢測(cè)大鼠PASMCs的增殖能力

3 TUNEL檢測(cè)PASMCs細(xì)胞凋亡情況

TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色，藍(lán)色代表細(xì)胞核。相對(duì)于對(duì)照組，低氧組細(xì)胞凋亡水平顯著下降（P<0.01）；給予PNS 干預(yù)后，凋亡水平顯著高于低氧組（P<0.01），見圖4。

Figure 4.The apoptosis of rat pulmonary artery smooth muscle cells （PASMCs） determined by TUNEL staining （×200）.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control （Con） group； ##P<0.01 vs hypoxia （Hypo） group.圖4 PNS可促進(jìn)低氧條件下大鼠PASMCs的凋亡水平

4 PNS 及Notch3 抑 制 劑 處 理 對(duì)PASMCs 中Notch3、Hes-1、PCNA、caspase-3 mRNA表達(dá)的影響

RT-qPCR 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低氧組Notch3、Hes-1 和PCNA mRNA 表 達(dá) 水 平 增 高（P<0.01），caspase-3 mRNA 表達(dá)水平降低（P<0.01）；給予PNS 或Notch 3 抑制劑干預(yù)后，Notch3、Hes-1 和PCNA mRNA 表達(dá)水平降低（P<0.01），caspase-3 mRNA表達(dá)水平增高（P<0.05），見圖5。

Figure 5.Relative mRNA expression levels of Notch3， Hes-1， proliferating cell nuclear antigen （PCNA） and caspase-3 in rat pulmonary artery smooth muscle cells （PASMCs）.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control （Con） group； #P<0.05， ##P<0.01 vs hypoxia （Hypo） group.圖5 各組大鼠PASMCs中Notch3、Hes-1、PCNA和caspase-3的mRNA表達(dá)水平

5 PNS 及Notch3 抑 制 劑 處 理 對(duì)PASMCs 中Notch3、Hes-1、PCNA和caspase-3蛋白表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低氧組Notch3、Hes-1 以及PCNA 蛋白表達(dá)水平增高（P<0.05），caspase-3 蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）；給予PNS 或Notch3 抑制劑干預(yù)后，Notch3、Hes-1 以及PCNA 蛋白表達(dá)水平低于低氧組P<0.05），caspase-3 蛋白表達(dá)水平高于低氧組（P<0.01），見圖6。

Figure 6.The protein expression of Notch3， Hes-1， proliferating cell nuclear antigen （PCNA） and caspase-3 in rat pulmonary artery smooth muscle cells （PASMCs） detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control （Con） group； #P<0.05， ##P<0.01 vs hypoxia （Hypo） group.圖6 Western blot檢測(cè)各組大鼠PASMCs中Notch3、Hes-1、PCNA和caspase-3蛋白的表達(dá)

6 PNS 及 過 表 達(dá)Notch3 處 理 后 對(duì)PASMCs 中Notch3和PCNA mRNA和蛋白表達(dá)的影響

6.1 Notch3 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平 RT-qPCR和Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低氧組Notch3 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）；給予PNS 干預(yù)后，Notch3 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著低于低氧組（P<0.05）；與低氧+PNS 組相比，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行Notch3 過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可逆轉(zhuǎn)PNS 對(duì)Notch3 mRNA 和蛋白表達(dá)的抑制作用（P<0.05）；與低氧+Notch3 組相比，在此基礎(chǔ)上給予PNS仍可降低Notch3 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平（P<0.05），見圖7。

Figure 7.The mRNA and protein expression of Notch3 and proliferating cell nuclear antigen （PCNA） in rat pulmonary artery smooth muscle cells （PASMCs）.A： relative mRNA expression of Notch3 and PCNA of in rat PASMCs detected by RT-qPCR； B：relative protein expression of Notch3 and PCNA in rat PASMCs detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control（Con） group； #P<0.05， ##P<0.01 vs hypoxia（Hypo） group； &P<0.05， &&P<0.01 vs Hypo+Panax notoginseng saponins （PNS） group； △P<0.05， △△P<0.01 vs Hypo+Notch3 group.圖7 各組大鼠PASMCs中Notch3和PCNA的mRNA和蛋白表達(dá)

6.2 PCNA 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平 RT-qPCR 和Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低氧組PCNA的mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）；給予PNS 干預(yù)后，PCNA 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著低于低氧組（P<0.05）；與低氧+PNS 組相比，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行Notch3 過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可逆轉(zhuǎn)PNS 對(duì)PCNA mRNA和蛋白表達(dá)的抑制作用（P<0.05），見圖7。

討 論

HPH 是一種以血管阻力持續(xù)性升高和血管重塑為特征的進(jìn)展性疾病［10］，多發(fā)于慢性阻塞性肺疾病、睡眠呼吸障礙和間質(zhì)性肺疾病患者，主要是由于長(zhǎng)期缺氧造成了肺內(nèi)皮細(xì)胞受損，內(nèi)皮舒張因子減少，引起肺血管收縮和重塑，進(jìn)而導(dǎo)致了HPH 的發(fā)生［11］。HPH 的發(fā)病機(jī)制與Notch 信號(hào)通路有關(guān)［12］，Notch 信號(hào)在血管平滑肌細(xì)胞的分化、生理和功能中同樣發(fā)揮著重要作用，而其中的Notch3 主要通過調(diào)節(jié)PASMCs的增殖進(jìn)而影響PVR，所以我們將Notch3信號(hào)通路作為本次實(shí)驗(yàn)的相關(guān)信號(hào)通路。

Hes-1 是 Notch 通路下游靶基因 HES 蛋白家族成員， Notch3 受體蛋白可調(diào)控 Hes-1蛋白的表達(dá)［13］，通過Hes-1 表達(dá)的檢測(cè)，可以進(jìn)一步了解Notch3 信號(hào)通路情況。PCNA 與細(xì)胞DNA 合成關(guān)系密切，在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起重要作用，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)，而caspase-3 是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶［14］，對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)可進(jìn)一步探究PASMCs的增殖及凋亡情況。

三七是五加科人參屬植物三七的干燥根及根莖，具有化瘀止血和消腫止痛等功效，在傳統(tǒng)中藥中作為一種活血化瘀類藥品被廣泛應(yīng)用［15］，其化學(xué)成分主要包括有人參皂苷、三七皂苷、三七素及多糖，其中PNS 是主要有效成分［16］。根據(jù)Xu 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，三七的活性物質(zhì)三七皂苷R1 能通過降低ERK、p38的表達(dá)，減輕缺氧和高碳酸血癥引起的離體大鼠肺動(dòng)脈環(huán)的血管收縮，從而降低PAH。因此本次實(shí)驗(yàn)從Notch3 信號(hào)通路進(jìn)行研究，探討PNS 是否同樣可以通過該信號(hào)通路發(fā)揮防治PAH的作用。

目前的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［18-20］，低氧可直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)證明［21］，PNS 可以抑制低氧高二氧化碳引起的PASMCs 細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果表明：低氧可誘導(dǎo)PASMCs 增殖、抑制PASMCs凋亡；PNS可通過抑制Notch3表達(dá)顯著下調(diào)低氧誘導(dǎo)的PCNA 的表達(dá)，抑制PASMCs 增殖、促進(jìn)PASMCs凋亡。

綜上所述，在低氧條件下，PNS 可通過抑制Notch3 信號(hào)通路減輕PASMCs 的增殖、促進(jìn)PASMCs的凋亡，從而緩解HPH。