兩種新型的BTK和HDAC抑制劑在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中的協(xié)同抗腫瘤作用*

楊 婕， 魏 婷， 許艷麗， 玉 斌， 楊 熒， 李慶山，△

（1華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院血液科，廣東 廣州 510180；2暨南大學(xué)附屬?gòu)V州紅十字會(huì)醫(yī)院血液科，廣東 廣州 510220；3華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006）

彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma， DLBCL）是B 細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma， NHL）中最常見的亞型，具有不同的臨床病理特征。通過(guò)基因表達(dá)譜，根據(jù)淋巴瘤細(xì)胞的起源細(xì)胞可以將DLBCL 病例分為生發(fā)中心B細(xì)胞樣（germinal center B-cell-like， GCB）型、活化B細(xì)胞樣（activated B-cell-like， ABC）型和未確定型［1］。在采用利妥昔單抗（rituximab， RTX）聯(lián)合環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿、強(qiáng)的松一線治療（R-CHOP）化療方案的DLBCL 患者中，ABC 型患者的預(yù)后明顯差于GCB 型患者。在非GCB 型DLBCL 的治療中，治療后總體復(fù)發(fā)率超過(guò)30%［2-3］。一些難治/復(fù)發(fā)病例對(duì)CD20 單抗產(chǎn)生耐藥性，這使得治療更加困難。因此，尋求新的治療策略，可為該疾病的臨床治療提供新的思路。

組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylase， HDAC）是從組蛋白中去除乙?；拿讣易澹顷P(guān)鍵的表觀遺傳沉默因子。HDAC 抑制劑通過(guò)干擾HDAC 可以逆轉(zhuǎn)腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄抑制并影響多種基因的表達(dá)、誘導(dǎo)DNA 損傷并抑制DNA 修復(fù)、在多個(gè)層面上與細(xì)胞凋亡的線粒體和死亡受體介導(dǎo)途徑相互作用，上調(diào)促凋亡和下調(diào)抗凋亡蛋白［4］。pracinostat 是一種基于羥肟酸的新型組蛋白去乙酰酶抑制劑。在體外，pracinostat 抑制I 類，II 類和IV 類HDAC，對(duì)其他鋅結(jié)合酶沒有影響，并且對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系顯示出顯著的抗增殖活性［5］。作為B 細(xì)胞受體（B cell receptor， BCR）依賴性細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵介質(zhì)，由BTK介導(dǎo)的BCR 信號(hào)通路的異常激活也是部分NHL 包括DLCBL 的另一個(gè)重要致病因素［6-7］。BTK 參與B細(xì)胞發(fā)育的各個(gè)方面，如增殖、凋亡和細(xì)胞遷移［6］。BTK抑制劑已證實(shí)在B 細(xì)胞惡性腫瘤中具有治療活性。據(jù)報(bào)道，BTK 抑制劑如伊布替尼在治療B 細(xì)胞NHL方面顯示出巨大的潛力［8］，但作為單藥療效有限［9］。澤布替尼是第二代BTK 抑制劑，與伊布替尼相比，澤布替尼具有更強(qiáng)的BTK 靶點(diǎn)占據(jù)和更低的脫靶效應(yīng)。首例報(bào)道CAR-T 細(xì)胞治療失敗后，HDAC 和BTK 雙重抑制治療復(fù)發(fā)/難治性DLBCL 的案例，為未來(lái)的治療開辟了新的可能性［10］。在病例報(bào)道中，原發(fā)性骨髓彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤的老年患者在RCHOP 治療無(wú)效后，同時(shí)給予HDAC 抑制劑西達(dá)本胺和BTK 抑制劑伊布替尼，患者達(dá)到完全緩解［11］。靶向BCR 通路中PI3K 和HDAC 雙重抑制劑也在體外和人DLBCL 異種移植小鼠模型中顯示出抗腫瘤功效［12］。HDAC 和BTK 的雙重抑制在DLBCL 治療中顯示出協(xié)同作用，其在臨床上已進(jìn)行嘗試且取得令人滿意的療效，但仍缺乏基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及機(jī)制驗(yàn)證［10］。

本研究以人彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞為研究對(duì)象，從細(xì)胞水平探討B(tài)TK 抑制劑澤布替尼和HDAC 抑制劑pracinostat 聯(lián)用是否可促進(jìn)DLBCL 細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)，為pracinostat 作為新型治療藥物的開發(fā)以及DLBCL的臨床治療提供參考和數(shù)據(jù)支持。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞

人彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤（NU-DUL-1 為ABC型，SU-DHL-6 為GCB 型）細(xì)胞株購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司，所有實(shí)驗(yàn)均使用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

2 主要試劑和儀器

澤布替尼（zanubrutinib）和pracinostat（SB939）購(gòu)自Selleck；CellTiter-Glo?2.0 Cell Viability Assay 購(gòu)自Promega；Annexin V/7-AAD 購(gòu)自BD；多腺苷二磷酸核 糖 聚 合 酶1［poly（ADP-ribose） polymerase 1，PARP1］、caspase-3、caspase-8 和tubulin-HRP 抗體購(gòu)自CST；三色預(yù)染蛋白Marker、Tris/甘氨酸/SDS 電泳緩沖液（10×）、PAGE 凝膠快速制備試劑盒（10%）、PAGE 凝膠快速制備試劑盒（15%）、封閉用BSA、TBS/Tween 緩沖液（10×）、Omni-ECL?基礎(chǔ)型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（皮克級(jí)）和Omni-ECL?超靈敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（飛克級(jí)）購(gòu)自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；甘氨酸、SDS 和Tris 堿購(gòu)自生工生物工程股份有限公司；Amersham Protran 0.2 μm 硝酸纖維素膜購(gòu)自Cytiva。

3 方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng) DLBCL 細(xì)胞的NU-DUL-1 細(xì)胞（ABC 亞型）以及SU-DHL-6 細(xì)胞（GCB 亞型）在含有10%的FBS 和 1% 青霉素-鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

3.2 CellTiter-Glo 法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NU-DUL-1和SU-DHL-6細(xì)胞離心后用完全培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞以每孔5 000 個(gè)細(xì)胞、100 μL 的密度接種到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用濃度為0、2.5、5、10、20、40、80 和160 μmol/L 的單藥澤布替尼和濃度為0、15.63、31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000 nmol/L 的單藥pracinostat 分別處理NUDUL-1 細(xì)胞和SU-DHL-6 細(xì)胞。將96 孔板在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48 和72 h 后，用CellTiter-Glo 試劑裂解細(xì)胞，并在室溫孵育30 min 后在多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)測(cè)定發(fā)光值（relative light unit， RLU），使用SynergyFinder（https：//synergyfinder.fimm.fi）選用零相互作用效價(jià)（zero interaction potency， ZIP）模型［13］計(jì)算出聯(lián)合用藥的協(xié)同指數(shù)，大于10 表示兩種藥物之間的相互作用為協(xié)同效應(yīng)（小于-10：兩種藥物之間的相互作用可能是拮抗性的； -10~10：兩種藥物之間的相互作用可能是相加的；大于10：兩種藥物之間的相互作用可能是協(xié)同的）。

3.3 CellTiter-Glo 法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖抑制的協(xié)同作用 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NU-DUL-1 和SU-DHL-6細(xì)胞離心后用完全培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞以每孔5 000個(gè)細(xì)胞、100 μL 的密度接種到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用濃度為0、5、7.5、10、12.5和15 μmol/L的澤布替尼和濃度為0、15.63、31.25、62.5、125 和250 nmol/L 的pracinostat，單藥或聯(lián)合處理NU-DUL-1 細(xì)胞和SUDHL-6 細(xì)胞。將96 孔板在培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48 h后，用CellTiter-Glo 試劑裂解細(xì)胞，并在室溫孵育30 min后在多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)測(cè)定發(fā)光值。

3.4 Annexin V/7-AAD 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，以每孔5×105細(xì)胞、2 mL 接種至6 孔板中，用濃度為0、20 μmol/L的澤布替尼和濃度為0、200 nmol/L 的pracinostat 單藥或聯(lián)合處理NU-DUL-1 細(xì)胞，用濃度為0、20 μmol/L 的澤布替尼和濃度為0、150 nmol/L 的pracinostat 單藥或聯(lián)合處理SU-DHL-6 細(xì)胞。培養(yǎng)箱培育48 h 后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液于1.5 mL EP 管中，以2 000 r/min，室溫離心5 min后，棄上清，預(yù)冷PBS洗滌后，加入1×Binding Buffer 緩沖液，離心后重懸為100 μL，加入5μL Annexin V-APC 和5 μL 7-AAD，混勻后室溫避光孵育15 min，加入1×Binding Buffer 緩沖液重懸至500 μL，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

3.5 Western blot 法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞，以每孔1×106細(xì)胞、3 mL 接種至6孔板中，用濃度為0、10、20 μmol/L 的澤布替尼和濃度為0、100、200 nmol/L 的pracinostat 單藥或聯(lián)合處理NU-DUL-1細(xì)胞，用濃度為0、10、20 μmol/L 的澤布替尼和濃度為0、150、300 nmol/L 的pracinostat 單藥或聯(lián)合處理SU-DHL-6 細(xì)胞。培養(yǎng)箱培育48 h 后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液于1.5 mL EP 管中，以2 000 r/min，室溫離心5 min 后，棄上清，再次用預(yù)冷PBS 洗滌后離心并棄上清。提取細(xì)胞總蛋白，制備蛋白樣品，于10%和6% SDS-PAGE 中分離，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，然后用0.4%麗春紅染色以觀察蛋白質(zhì)上樣量。在使用TBST 配制的5%脫脂牛奶中封閉1 h后，將膜與Ⅰ抗4 ℃孵育過(guò)夜，然后使用HRP 連接的Ⅱ抗室溫孵育1 h。根據(jù)制造商的說(shuō)明使用化學(xué)發(fā)光顯色成像，檢測(cè)目的蛋白變化。使用ImageJ 軟件對(duì)蛋白條帶灰度進(jìn)行半定量，并使用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和繪圖。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有體外實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行了3 次及以上獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，代表性結(jié)果顯示在圖中。使用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組之間比較采用t檢驗(yàn)。多組資料（>2）之間的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊性檢驗(yàn)不齊時(shí)，選擇Brown-Forsythe檢驗(yàn)和Welch檢驗(yàn)；滿足方差齊性，則選擇方差分析（ordinary ANOVA 分析）。藥物協(xié)同指數(shù)計(jì)算采用使用SynergyFinder（https：//synergyfinder.fimm.fi）選用ZIP 模型［13］。計(jì)量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 澤布替尼和pracinostat 可抑制NU-DUL-1 細(xì)胞和SU-DHL-6細(xì)胞增殖

采用不同濃度的澤布替尼和pracinostat 分別處理NU-DUL-1 和SU-DHL-6 細(xì)胞24 h、48 h 和72 h 后，CellTiter-Glo 法檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，澤布替尼和pracinostat 單藥處理NU-DUL-1 和SUDHL-6 細(xì)胞后，能顯著抑制細(xì)胞增殖，且呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系，見圖1。通過(guò)GraphPad Prism 8.0 軟件計(jì)算得到澤布替尼的IC50和pracinostat 的IC50，并以此作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度的參考，見表1。

表1 澤布替尼和pracinostat的IC50Table 1.The IC50 of zanubrutinib and pracinostat

Figure1.Inhibitory rates of the proliferation of NU-DUL-1 and SU-DHL-6 cells after treated with different concentrations of zanubrutinib （A） and pracinostat （B） for 24， 48 and 72 h were detected by CellTiter-Glo luminescent cell viability assay.圖1 CellTiter-Glo法檢測(cè)不同濃度澤布替尼和pracinostat處理24、48和72 h對(duì)NU-DUL-1和SU-DHL-6細(xì)胞增殖的影響

2 澤布替尼聯(lián)合pracinostat具有協(xié)同抗腫瘤作用

采用不同濃度的澤布替尼與pracinostat 單藥或聯(lián)合使用處理NU-DUL-1 和SU-DHL-6 細(xì)胞48 h 后，使用SynergyFinder（https：//synergyfinder.fimm.fi）選用ZIP 模型［13］計(jì)算出聯(lián)合用藥的協(xié)同指數(shù)，大于10，表示兩種藥物之間的相互作用為協(xié)同效應(yīng)。根據(jù)圖2 顯示，澤布替尼和pracinostat 的聯(lián)合使用對(duì)彌漫性大B 細(xì)胞瘤細(xì)胞NU-DUL-1 和SU-DHL-6 具有很強(qiáng)的協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。

計(jì)算各組細(xì)胞的抑制率，我們發(fā)現(xiàn)，兩藥聯(lián)合使用對(duì)細(xì)胞增殖的抑制也存在劑量依賴性，圖2A 中每個(gè)色塊內(nèi)的數(shù)字代表對(duì)應(yīng)濃度的兩藥聯(lián)合后對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率，色塊的飽和度越高代表抑制率越大。在同一濃度的澤布替尼，隨著聯(lián)合使用的pracinostat濃度的增加，細(xì)胞抑制率隨之增大；反之亦然。根據(jù)柱狀圖顯示，聯(lián)合組的細(xì)胞增殖率明顯低于單藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2B。

3 澤布替尼聯(lián)合pracinostat 促進(jìn)彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞NU-DUL-1和SU-DHL-6細(xì)胞凋亡

Annexin V-APC/7-AAD 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，NU-DUL-1 細(xì)胞中，空白對(duì)照組凋亡細(xì)胞占比為（8.84±1.47）%，澤 布 替 尼 組 凋 亡 細(xì) 胞 占 比 為（37.30±2.50）%，pracinostat 組 凋 亡 細(xì) 胞 占 比 為（37.53±2.80）%，聯(lián)合 用藥 組凋亡 細(xì)胞 占 比為（88.63±2.45）%；SU-DHL-6 細(xì)胞中，空白對(duì)照組凋亡細(xì)胞占比為（8.63±2.95）%，澤布替尼組凋亡細(xì)胞占比為（35.70±4.50）%，pracinostat 組凋亡細(xì)胞占比為（32.30±3.05）%，聯(lián)合用藥組凋亡細(xì)胞占比為（68.33±3.00）%。聯(lián)合用藥組與空白對(duì)照組和單藥組相比，凋亡細(xì)胞比例的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖3。

Figure 3.Cell death rates of NU-DUL-1 （A） and SU-DHL-6 （B） cells induced by combination of zanubrutinib and pracinostat.Mean±SD.n=3.△△P<0.01 vs control （without treatment）； **P<0.01 vs zanubrutinib alone； ##P<0.01 vs pracinostat alone.圖3 澤布替尼聯(lián)合pracinostat誘導(dǎo)NU-DUL-1和SU-DHL-6的細(xì)胞死亡率

4 澤布替尼聯(lián)合pracinostat 通過(guò)上調(diào)凋亡蛋白PARP1 和caspase-3/8 剪切誘導(dǎo)彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞NU-DUL-1和SU-DHL-6細(xì)胞凋亡

Western blot結(jié)果顯示，在NU-DUL-1和SU-DHL-6細(xì)胞中，與對(duì)照組及單藥組相比，聯(lián)合組的caspase-3、caspase-8和PARP1的表達(dá)量降低，而剪切增多，即cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和cleaved PARP1表達(dá)量增多；其灰度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，在NU-DUL-1及SU-SHL-6 細(xì)胞中，聯(lián)合組與單藥組相比，cleaved caspase-3、cleaved caspase-8 和cleaved PARP1 表達(dá)量增多（P<0.01），見圖4。上述結(jié)果說(shuō)明，聯(lián)合用藥可以更大程度地激活caspase-3 和caspase-8，促進(jìn)PARP1 剪切，從而誘導(dǎo)彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞NU-DUL-1和SU-DHL-6發(fā)生凋亡。

Figure 4.Protein expression levels of PARP1， cleaved PARP1， caspase-3， cleaved caspase-3， caspase-8 and cleaved caspase-8 in NU-DUL-1 （A） and SU-DHL-6 （B） cells were determined by Western blot.Mean±SD.n=3.△△P<0.01 vs control （without treatment）； **P<0.01 vs zanubrutinib （10 μmol/L） alone； ##P<0.01 vs pracinostat （20 μmol/L） alone.圖4 Western blot 檢測(cè)NU-DUL-1 和SU-DHL-6 細(xì)胞中PARP1、cleaved PARP1、caspase-3、cleaved caspase-3、caspase-8 和cleaved caspase-8蛋白水平

討 論

BTK是包括DLBCL的ABC亞型在內(nèi)的B細(xì)胞惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵分子之一［7，14-15］，目前研究者已開發(fā)了許多針對(duì)該靶點(diǎn)的抑制劑。澤布替尼是一種新型口服BTK抑制劑，與其他BTK抑制劑一樣，在BTK的三磷酸腺苷結(jié)合口袋內(nèi)的Cys481處形成不可逆共價(jià)鍵。澤布替尼已被批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)/難治性慢性淋巴細(xì)胞白血病和套細(xì)胞淋巴瘤，與Ibrutinib相比，它對(duì)其他酪氨酸激酶（如EGFR、JAK3、TEC、ITK 等）的脫靶抑制更少［16-17］，具有更好的反應(yīng)和更少的毒性，特別是心血管毒性［18-19］。然而，澤布替尼單藥療效有限，與其他靶向藥物聯(lián)合可取得更好療效。

異常HDAC表達(dá)發(fā)生在血液系統(tǒng)腫瘤中，包括B細(xì)胞淋巴瘤［20］。已經(jīng)有充分的研究證明，組蛋白乙酰化是由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和HDAC 調(diào)節(jié)，通過(guò)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)重塑和核結(jié)構(gòu)從而在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中起關(guān)鍵作用［21-23］。組蛋白乙?；氖д{(diào)可導(dǎo)致異常基因表達(dá)，從而激活癌基因，滅活腫瘤抑制因子，抑制程序性細(xì)胞死亡并介導(dǎo)免疫逃避，最終導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展［24］。已有臨床病例報(bào)告表明，HDAC和BTK 雙重抑制在CD19 靶向CAR-T 治療失敗后的彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤患者中有效［10］。1、2 期臨床試驗(yàn)顯示，pracinostat聯(lián)合阿扎胞苷治療AML以及骨髓增生異常綜合征良好的療效及安全性［25-26］。西達(dá)本胺和伊布替尼聯(lián)合治療在原發(fā)性難治性DLBCL患者中取得完全緩解［26］。然而，協(xié)同機(jī)制背后的機(jī)制仍不清楚。因此，探索澤布替尼與pracinostat是否具有協(xié)同效應(yīng)及其內(nèi)在機(jī)制是我們研究的重點(diǎn)。

本研究表明，HDAC 抑制劑pracinostat 和BTK 抑制劑澤布替尼在體外可抑制彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株NU-DUL-1（ABC 型）和SU-DHL-6（GCB 型）的增殖，且有濃度和時(shí)間依賴性。在澤布替尼和pracinostat聯(lián)合使用刺激DLBCL細(xì)胞時(shí)，計(jì)算出兩藥物在NU-DUL-1 和SU-DHL-6 細(xì)胞的協(xié)同指數(shù)分別為19.553 和19.392，均大于10，表明其聯(lián)合效果顯著。在此基礎(chǔ)上，我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)澤布替尼和pracinostat 的聯(lián)合對(duì)NU-DUL-1 和SU-DHL-6 細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組凋亡細(xì)胞比例較對(duì)照組和單藥組明顯增加。說(shuō)明，聯(lián)合用藥具有明顯的協(xié)同效應(yīng)，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮協(xié)同作用。

既往文獻(xiàn)報(bào)道，在BTK 抑制劑的治療中，GCBDLBCL患者的治療反應(yīng)較差，只有5%取得完全或部分緩解。在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，除BCR 依賴性途徑的ABC-DLBCL 外，無(wú)BCR 突變的腫瘤也對(duì)伊布替尼的治療具有不錯(cuò)的反應(yīng)，因?yàn)?7%的伊布替尼應(yīng)答者具有野生型CD79A 和CD79B［9］。但是，我們發(fā)現(xiàn)ABC 和GCB 型的DLBCL 細(xì)胞在澤布替尼和pracinostat 聯(lián)合使用時(shí)均存在協(xié)同效應(yīng)，因此我們認(rèn)為，pracinostat 的加入，可以提高非ABC-DLBCL 患者對(duì)澤布替尼治療的反應(yīng)。

HDAC 除了可降低組蛋白乙酰化，還有許多非組蛋白的底物，例如腫瘤抑制基因p53、B 細(xì)胞淋巴瘤蛋白6（B-cell lymphoma protein 6， BCL-6）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）、熱 休 克 蛋 白90（heat shock protein， HSP90）、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、輸入蛋白、核激素受體等［27］。因此，HDAC抑制劑可以通過(guò)作用于組蛋白和非組蛋白底物，阻斷基因表達(dá)、抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞功能［28-29］，并參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制、細(xì)胞凋亡和血管生成［30-33］。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，HDAC 抑制劑可以通過(guò)沉默BTK 靶向的microRNA 表達(dá)，導(dǎo)致BTK 途徑的信號(hào)傳導(dǎo)降低并最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［34］。除此之外，研究表明髓樣分化因子88 （myeloid differentiation primary response gene 88，MYD88）去乙酰化可導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡［35］。Caspase 家族屬于半胱氨酸蛋白酶，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Caspase 8 作為促進(jìn)凋亡啟動(dòng)的蛋白可以裂解caspase-3和caspase-7，從而激活它們［36］。PARP1 是DNA 修復(fù)酶，在caspase 依賴性凋亡過(guò)程中，PARP1 在其裂解位點(diǎn)被caspase-3和7裂解［37-38］。PARP 剪切被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要指標(biāo)，也通常被認(rèn)為是caspase-3激活的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)證明澤布替尼與pracinostat聯(lián)用可以促進(jìn)凋亡啟動(dòng)蛋白caspase-8和凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3的表達(dá)，并且增加PARP1的剪切，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，澤布替尼聯(lián)合pracinostat 能夠協(xié)同抑制DLBCL 的NU-DUL-1 細(xì)胞和SU-DHL-6 細(xì)胞生長(zhǎng)，并通 過(guò) 激活caspase-3 和caspase-8，增 加PARP1 剪切，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。