郭 民， 李 婷， 楊曉雪， 高 睿， 栗馨洋， 王海龍△， 龐 敏△

（1山西醫(yī)科大學實驗動物中心，山西 太原 030001；2山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，呼吸疾病防治與基礎研究山西省重點實驗室，山西 太原 030001；3山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學研究中心，山西 晉中030600）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease， COPD）的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，且隨著發(fā)病率的升高其死亡率亦有所增加［1］。COPD 的特征是呼吸道持續(xù)性損傷，引起氣道重塑，并伴有肺實質的破壞，進而導致呼氣困難、氣體潴留、肺通氣過度和運動時呼吸短促，隨著時間的推移，引起肺功能加速下降［2］。香煙煙霧（cigarette smoke， CS）誘發(fā)肺泡上皮細胞和內皮細胞衰老而參與COPD 的發(fā)生發(fā)展［3-4］，因此，降低COPD 患者肺部上皮細胞或內皮細胞衰老，將是改善COPD 患者肺功能的一種有益嘗試。

CC16 （club cell secretory protein 16）是棒狀細胞（club cells）分泌的具有肺組織特異性的蛋白質，具有抗炎、抗氧化和抗纖維化等生物學作用［5-6］。CC16基因缺失的小鼠更易罹患COPD［7］；與健康人相比，COPD 患者支氣管肺泡灌洗液及血清中CC16也呈下降狀態(tài)［8-9］，提示CC16 在COPD 的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。本課題組前期應用重組CC16 蛋白滴鼻COPD 模型小鼠，可顯著降低小鼠氣道炎癥，減輕COPD 小鼠肺組織病理損傷［10］，然而重組CC16 蛋白對COPD 模型小鼠肺功能改善和肺組織細胞衰老的干預作用及機制還未闡明。因此，本研究擬應用重組人CC16 蛋白（recombinant human CC16， rhCC16）滴鼻干預COPD 模型小鼠，觀察小鼠肺功能、肺組織病理損傷及肺組織細胞衰老狀況，并對其機制進行初步研究。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

清潔級健康BALB/c 雄性小鼠（4~6 周齡）40 只，體重為20~22 g，購于山西醫(yī)科大學實驗動物中心［生產(chǎn)許可號：SCXK（晉）2019-0004，使用許可證號：SYXK（晉）2019-0007］。適應性飼養(yǎng)1 周后進行實驗，相關實驗動物操作獲得山西醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準。

2 試劑和儀器

rhCC16 由本實驗室自主純化［10］，用PBS 稀釋至使用濃度進行實驗。紅塔山牌香煙（煙氣煙堿量0.9 mg，焦油量10 mg，煙氣CO 量11 mg）購自云南玉溪卷煙廠；逆轉錄試劑盒和實時熒光定量試劑盒購自北京聚合美生物科技有限公司；總RNA 提取試劑盒購自北京賽文創(chuàng)新生物科技有限公司；兔抗P16多克隆抗體和兔抗P21 多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；兔抗p-P38多克隆抗體和兔抗磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶1/2（phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2， p-ERK1/2）多克隆抗體購自Cell Signaling Technology；免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物有限公司。

D30 微量核酸檢測儀（Eppendorf）；Quant Studio 3 實時熒光定量PCR 儀（Thermo Fisher Scientific）；PFT 肺功能檢測系統(tǒng)（上海塔旺智能科技）；JXFSTPRP 高通量快速研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）。

3 實驗方法

3.1 實驗分組 將40 只經(jīng)過適應性飼養(yǎng)的小鼠隨機均分為對照組、COPD 模型組、COPD+rhCC16 組、COPD+PBS 組，每組10 只。對照組作為空白對照不加任何干預，使其自由進食飲水；其余各組小鼠均采用被動吸煙法制備COPD 穩(wěn)定期小鼠模型［11］，每日吸入煙霧1次，每次使用10支香煙，每周6 d，持續(xù)24周。COPD+rhCC16 組于熏煙16 周開始，在熏煙前2 h 給予小鼠雙側滴鼻rhCC16（2.5 μg/g），COPD+PBS組則使用等體積（20 μL）的PBS雙側滴鼻，每日1次，持續(xù)干預8周。

3.2 小鼠外觀行為學觀察及肺功能檢測 實驗期間每日觀察各組小鼠被毛、精神狀態(tài)及飲食情況等；小鼠肺功能檢測：小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（35 mg/kg）進行深度麻醉，將小鼠固定于小鼠解剖臺，暴露氣管，使用配套軟管從口腔插入氣管，細線扎緊固定后，待小鼠無呼吸抵抗后上機檢測，記錄相應肺功能參數(shù)數(shù)值［0.3 秒內用力呼氣容積（forced expiratory volume in 0.3 s， FEV0.3）、用力肺活量（forced vital capacity， FVC）、肺順應性（dynamic compliance， Cdyn）及氣道阻力（airway resistance， Raw）］。

3.3 小鼠肺組織形態(tài)學觀察 肺功能檢測完畢后，打開胸腔，暴露雙肺，觀察小鼠肺組織外觀情況，將左肺置于4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，透明，石蠟包埋，切片，行常規(guī)HE 染色，高倍鏡下隨機選取5 個視野觀察細胞，拍照并分析各組小鼠肺組織病理改變。

3.4 RNA 提取和RT-qPCR 將小鼠右肺取出，稱取30 mg肺組織用高通量快速研磨儀進行研磨，得到肺組織勻漿后，吸取上清液，按照試劑說明書提取各組小鼠肺組織總RNA。按試劑盒說明書進行逆轉錄獲得cDNA；qPCR 反應體系為10 ng cDNA、2× M5PCR預混液10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，ddH2O 補足至20 μL。qPCR 反應程序為：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40 個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s。采用2-ΔΔCt計算各基因mRNA 的相對表達水平，并對結果進行統(tǒng)計學分析。引物由北京中美泰和科技有限公司合成。P16 上游引物序列為5'-GCTGGGTGGTCTTTGTGTA-3'，下游引 物 序列為5'-TGCCATTCCTTTCCTGTC-3'；P21 上游引物序列為5'-AGTGTGCCGTTGTCTCTTC-3'，下游引物序列為5'-AGTCAAAGTTCCACCGTTCT-3'；GAPDH 上游引物序列為5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，下游引物序列為5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'。

3.5 免疫組織化學 肺組織切片脫蠟至水，梯度酒精進行水化（酒精濃度從低到高），3% H2O2孵育30 min，微波爐內抗原修復，待液體冷卻至室溫后PBS洗3 次，滴加5% BSA 封閉后，分別與P16 抗體（1∶100）、P21 抗體（1∶100）、p-P38 抗體（1∶100）和p-ERK1/2 抗體（1∶100）于4℃孵育過夜，次日PBS 洗滌3次，滴加二抗，PBS洗滌3次，DAB工作液顯色，于顯微鏡下觀察顯色情況，流水沖洗，蘇木素復染，流水沖洗，1%鹽酸酒精分化10 s，流水沖洗反藍，脫水，樹脂封片，顯微鏡下觀察染色情況并采集圖像，使用ImageJ 軟件分析免疫組化陽性染色面積占總細胞面積百分率。

4 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 8.00 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。兩組之間采用獨立樣本t檢驗進行比較，三組及三組以上的組間比較采用單因素方差分析。P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 rhCC16改善COPD小鼠被毛及行為

對照組小鼠被毛有光澤，活潑好動，精神狀態(tài)良好，呼吸平緩均勻，無打斗現(xiàn)象；模型組小鼠毛發(fā)稀疏暗黃且無光澤，部分小鼠出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象，熏煙時喜扎堆蜷縮于角落，精神狀態(tài)不佳，煩躁不安，易出汗，呼吸急促，伴有張口呼吸，飼養(yǎng)過程中常有打斗現(xiàn)象發(fā)生。rhCC16 干預組小鼠被毛未顯著改善，打斗減少，亦喜歡扎推，但呼吸趨于平緩均勻；PBS 組小鼠被毛及行為與模型組相同。

2 rhCC16有效改善COPD小鼠肺功能

與對照組相比，COPD 小鼠FEV0.3/FVC 比值降低（P<0.05），氣道阻力增加（P<0.05），肺順應性降低（P<0.05）；與COPD 模型組相比，rhCC16干預組小鼠FEV0.3/FVC 比值和肺順應性均升高（P<0.05），而氣道阻力降低（P<0.05），而PBS 組小鼠各項指標與COPD組相比均無顯著差異（P>0.05），見圖1。

Figure 1.Detection of the lung function in different groups.A： forced expiratory volume in 0.3 s （FEV0.3）/forced vital capacity（FVC）； B： airway resistance （Raw）； C： lung dynamic compliance （Cdyn）.Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs control group；#P<0.05， ##P<0.01 vs COPD group.圖1 各組小鼠肺功能檢測

3 rhCC16可減輕COPD小鼠肺部損傷

對照組小鼠肺組織呈正常的淡粉紅色，表面光滑；COPD 組小鼠肺組織因長時間吸入香煙煙霧而呈暗紅色，并且肺表面可見充血灶，有深紅色瘀斑（白色箭頭所示）；與COPD 組相比，rhCC16 組小鼠肺組織顏色有所恢復，充血灶、紅色瘀斑減少；但PBS 組小鼠肺組織與COPD 組形態(tài)和顏色相似（圖2A）。HE 染色顯示，對照組小鼠肺泡大小均勻，結構清晰，氣道粘膜上皮結構完整；COPD 組小鼠氣道壁破裂塌陷，肺泡大小不均勻，多呈不規(guī)則擴大，形成肺大泡，管腔狹窄，管壁增厚，炎癥細胞浸潤；rhCC16 組小鼠肺泡結構有所恢復，肺大泡減少，炎癥細胞減少；PBS組小鼠肺組織與COPD組形態(tài)相似（圖2B）。

Figure 2.Morphological and pathological changes of the lung tissues in various groups of mice.A： morphological changes of the lungs in mice （congestive lesions and ecchymosis were observed on the surface of lung tissues in COPD mice， while rhCC16 treatment alleviated the aforementioned pathological injuries）； B： HE staining of mice lung tissues （scale bar=200μm； the airway wall of COPD mice ruptured and collapsed， accompanied by the formation large alveoli and infiltration of inflammatory cells， while rhCC16 treatment mitigated the aforementioned pathological injuries； white arrow indicates red ecchymosis， red arrow indicates inflammatory cells， and green arrow indicates rupture and collapse of the airway wall）.圖2 各組小鼠肺組織形態(tài)及病理學改變

4 rhCC16可抑制COPD小鼠肺組織細胞衰老

RT-qPCR 結果顯示，與對照組相比，COPD 小鼠肺組織P16 和P21 的mRNA 表達水平均有顯著升高（P<0.05），rhCC16 干 預 可 顯 著 降 低P16 和P21 mRNA 表達（P<0.05），而二者在PBS組與COPD組小鼠間無顯著差異（P>0.05），見圖3。

Figure 3.The mRNA expression of P16 （A） and P21 （B） in mouse lung tissues of various groups detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs COPD model group.圖3 RT-qPCR檢測各組小鼠肺組織P16和P21的mRNA水平

免疫組織化學染色結果顯示，與對照組相比，COPD 小鼠肺組織P16、P21 和衰老相關β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase， SA-β-Gal）表達顯著升高（P<0.05），rhCC16 干預可顯著降低P16、P21 和SA-β-Gal 表達（P<0.05），而三者在PBS組與COPD組小鼠間無顯著差異（P>0.05），見圖4。

Figure 4.Immunohistochemical staining of senescence-associated β-galactosidase （SA-β-Gal）， P16 and P21 in mouse lung tissues of various groups（scale bar=200 μm）.Senescence markers such as SA-β-Gal， P16 and P21 in lung tissues of COPD mice were increased， while rhCC16 treatment significantly reduced their levels.Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs control group；##P<0.01 vs COPD group.圖4 各組小鼠肺組織P16、P21及SA-β-Gal表達的免疫組化檢測

5 rhCC16 抑制COPD 小鼠肺組織細胞中的P38 MAPK/ERK1/2信號通路

免疫組織化學染色顯示，與對照組相比，COPD小鼠肺組織細胞p-P38 和p-ERK1/2 染色陽性率顯著增加（P<0.05），rhCC16 干預可顯著降低p-P38 和p-ERK1/2 表達（P<0.05），而二者在PBS 組與COPD 組小鼠間無顯著差異（P>0.05），見圖5。

Figure 5.The levels of p-P38 and p-ERK1/2 in mouse lung tissues of various groups detected by immunohistochemical staining （scale bar=200 μm）.The levels of p-P38 and p-ERK1/2 in lung tissues of COPD mice were elevated， while rhCC16 treatment significantly decreased their levels.Mean±SD.n=10.**P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs COPD group.圖5 免疫組織化學染色檢測各組小鼠肺組織細胞p-P38和p-ERK1/2水平

討 論

COPD 以炎癥和肺組織結構變化導致的氣流持續(xù)受限為主要特征，是一種無法治愈的慢性肺病，包括慢性支氣管炎、肺氣腫和小氣道阻塞，在某些個體中還伴有肺心病和呼吸衰竭，給患者和社會都帶來了巨大負擔，而吸煙被認為是引發(fā)COPD 的主要環(huán)境因素。炎癥、氧化應激、蛋白酶-抗蛋白酶失衡及細胞衰老被認為是COPD 的發(fā)生發(fā)展的主要機制［12，13］。截至目前，COPD 仍然沒有特異性治療方法，改善氣流受限的治療方案仍然是主要途徑。在COPD 急性發(fā)作期，抗生素、吸入性皮質類固醇、支氣管擴張劑在臨床上被廣泛應用，但此類藥物的副作用亦不容忽視。

CC16 是一種分子量約為10 kD 的同型二聚體蛋白質，由非纖毛細支氣管上皮細胞在遠端氣道中分泌，具有肺組織特異性［14］。體內外研究表明，CC16具有抗炎、免疫調節(jié)和抗氧化作用［15］。臨床研究報告指出，COPD 患者及肺功能缺陷患者的血液和氣道中CC16 水平降低［16］。此外，低血清CC16 水平加重肺上皮細胞損傷，減弱1 秒內用力呼氣量（FEV1）［17-18］。課題組前期研究顯示，重組大鼠CC16蛋白質通過抑制核因子κB 降低炎癥因子表達進而改善COPD 模型小鼠肺部炎癥及病理損傷［11］，且可以降低脂多糖誘導的大鼠氣道上皮細胞炎癥因子表達［19］。而其對延緩細胞衰老，改善COPD 小鼠肺功能方面的研究還未見報道。

目前，構建COPD 模型小鼠的經(jīng)典方法是通過香煙煙霧誘導，此方法可以誘導出許多COPD 典型病理特征，例如氣道阻力增加、肺順應性降低、肺活量下降、肺通氣受限等［20］。在COPD 模型小鼠研究中，F(xiàn)EV0.3、FVC 及FEV0.3/FVC 是常用的評價小鼠肺功能的指標［21］。本研究中，COPD 模型小鼠經(jīng)6 月被動吸煙被成功制備，與正常對照組小鼠相比，F(xiàn)EV0.3/FVC 比值降低，氣道阻力升高并且肺順應性降低，而rhCC16 干預組小鼠的各項指標均得到改善，表明rhCC16能夠有效緩解香煙煙霧刺激引起的肺功能下降。Laucho-Contreras 等［22］的研究顯示，CC16基因缺失小鼠的肺組織在發(fā)育中自發(fā)地向肺老化表型轉化，并伴有COPD樣肺部病變，表明CC16對小鼠肺組織結構和功能的影響可能通過衰老途徑。而我們的研究顯示給予rhCC16干預可以降低COPD 小鼠肺組織衰老標志物β-半乳糖苷酶、P16 和P21 的表達，提示rhCC16 可通過抑制細胞衰老進而發(fā)揮改善COPD小鼠肺功能的作用，進一步明確了CC16-細胞衰老在COPD 發(fā)生發(fā)展中的作用，為認識COPD 的發(fā)生機制提供實驗證據(jù)。

COPD 主要由香煙煙霧、空氣過敏原、空氣污染物和細菌感染誘發(fā)，而在呼吸道內，這些環(huán)境因子都能夠激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases， MAPKs）家族［23］。MAPKs 包含三種主要信號分子即ERK1/2、c-Jun 氨基末端激酶和P38 MAPK。MAPKs 通過磷酸化調節(jié)與衰老相關蛋白質的活性來控制細胞反應程序。P38 MAPK 和ERK1/2的激活（磷酸化）可以促進多種因素誘導的細胞衰老［24-25］，且二者的激活 也 參與了COPD 的發(fā)生發(fā)展［20，26-27］。鑒此，我們檢測了各組小鼠肺組織p-P38 MAPK 和p-ERK1/2 的表達，結果顯示rhCC16 可以有效降低COPD小鼠肺組織p-P38和p-ERK1/2的含量，提示rhCC16 可能通過抑制P38 MAPK 和ERK1/2 信號級聯(lián)通路延緩香煙煙霧誘導的細胞衰老。我們前期研究顯示CC16 可以抑制核因子κB 活性，降低炎癥因子表達，減輕小鼠COPD 癥狀［11］。本項工作則從MAPK-細胞衰老通路觀察了CC16 在COPD 模型小鼠肺組織的表達，顯示出CC16 在COPD 模型小鼠中通過多條信號通路發(fā)揮多種生物學效應。

綜上所述，rhCC16 可能通過抑制P38 MAPK 和ERK1/2信號級聯(lián)通路延緩香煙煙霧誘導的COPD 小鼠肺組織細胞衰老，改善COPD小鼠肺功能。