趙銀峰，梁云，魏天天，嘉玉成

（湖北醫(yī)藥學院附屬隨州醫(yī)院/隨州市中心醫(yī)院 普通外科，湖北 隨州 441300）

胰腺癌是高度惡性的消化道腫瘤。在全球，胰腺癌在男性中發(fā)病率為5.5/10萬，女性為4.0/10萬，在癌癥相關病死率中排第4位[1]。在我國，胰腺癌發(fā)病率列第10位，病死率列第5位[2]。胰腺癌特征是進展迅速、早期轉移復發(fā)及對放化療抵抗[3]，導致預后不佳，5年總生存率＜5%，中位生存時間不足6個月[1]。胰腺癌臨床癥狀缺乏特異性，很多胰腺癌患者診斷時即為晚期而失去手術機會，深入探索胰腺癌進展的分子機制對提高診治水平具有重要的臨床意義。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）長度超過200個核苷酸，沒有蛋白質編碼功能[4]。lncRNA參與不同類型的腫瘤進展，是腫瘤發(fā)生、進展和轉移的關鍵調節(jié)因子，lncRNA在胰腺癌的發(fā)病、診斷、治療和預后中起著至關重要的作用[5]。lncRNA PCAT19（簡稱PCAT19）是最新發(fā)現(xiàn)的lncRNA分子，長度為693 bp，基因位于9號染色體上。研究顯示其在胃癌[6]、喉癌[7]、非小細胞肺癌[8]、肺腺癌[9]、神經膠質瘤[10]中表達上調，且與惡性進展和不良預后密切相關。盡管如此，PCAT19在胰腺癌中的表達、功能及作用機制尚無研究報道?；诠P者前期通過starBase數(shù)據(jù)庫預測PCAT19可與miR-195-5p互補結合，本研究進一步探討PCAT19在胰腺癌細胞中的表達與功能，及其與miR-195-5p的調控關系。

1 資料與方法

1.1 實驗試劑

人胰腺導管上皮細胞系（HPNE）和胰腺癌細胞系（PANC-1、SW1990、HS766T及CFPAC-1）由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗室饋贈，10% FBS及DMEM培養(yǎng)基購自Invitrogen公司，LipofectamineTM3000轉染試劑盒購自Invitrogen公司，miR-195-5p模擬物（miR-195-5p mimics）、miR-195-5p抑制物、si-PCAT19序列均由上海吉瑪生物公司合成，TRIzol試劑購自Invitrogen公司，Western blot試劑盒購自北京碧云天生物公司，TaqMan miRNA逆轉錄試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司，Transwell侵襲小室購自美國BD Biosciences公司，MTT細胞增殖檢測試劑盒購自日本Kumamoto公司，β-catenin、c-Myc、cyclin D1及GAPDH一抗購自美國BD公司，二抗購自美國Invitrogen公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

所有細胞都在補充有10% FBS和100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基中在37 ℃、含5% CO2環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用LipofectamineTM3000將PANC-1細胞系分別轉染PCAT19沉默序列si-PCAT19（si-PCAT19組）、陰性對照序列（si-NC組）、miR-195-5p抑制序列+si-PCAT19（共轉染組），并分成si-PCAT19組、si-NC組及共轉染組，待各組細胞系培養(yǎng)至對數(shù)期后行后續(xù)實驗。

1.3 RNA提取和qRT-PCR

使用TRIzol 試劑從細胞系中提取總RNA。用逆轉錄酶將分離的RNA轉錄成互補DNA（cDNA）。使用 SYBR Green實時聚合酶鏈式反應擴增成cDNA產物。使用 SYBR Green RT-PCR檢測PCAT19及miR-195-5p的表達。PCAT19的表達以GAPDH為內參，標準化為GAPDH的對照值。miR-195-5p的測定以U6小核為內參，標準化為U6的對照值。miR-195-5p引物序列正向（5'→3'）：CGC AGC ACA GAA ATA TTG GC，反向（5'→3'）：CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC；U6引物序列正向（5'→3'）：CTC GCT TCG GCA GCA CA，反向（5'→3'）：AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT；PCAT19引物序列正向（5'→3'）：CAG AAC AGG ATG GCA GAG，反向（5'→3'）：GGA CTA CTT GGA TGG CTA AT；GAPDH引物序列正向（5'→3'）：TCT CTG CTC CTC CTG TTC，反向（5'→3'）：GTT GAC TCC GAC CTT CAC。

1.4 細胞增殖能力測定

采用MTT實驗評估細胞增殖能力。將細胞以5×103個/孔的密度培養(yǎng)在96孔板中，在轉染后0、24、48、72 h，將細胞在含有10 μL MTT溶液的DMEM培養(yǎng)基中于37 ℃孵育2 h。使用酶標儀測定每孔在490 nm處的吸光度A490 nm，實驗重復3次，并繪制細胞增殖曲線。

1.5 細胞侵襲能力檢測

采用Transwell實驗評估細胞侵襲能力，將4×104個細胞放入涂有稀釋的Matrigel的上室中，然后將500 μL培養(yǎng)基添加到下室。細胞用PBS洗滌2次，用多聚甲醛固定25 min，培養(yǎng)24 h后用0.1%結晶紫染色30 min。然后，在光學顯微鏡下隨機取10個視野拍攝并計數(shù)，實驗重復3次，取平均值。

1.6 螢光素酶報告基因檢測

PCR產物純化后，酶切產物用限制性內切酶克隆到pmirGLO轉染載體。采用LipofectamineTM3000將pmirGLO-WT-PCAT19或Mut-PCAT19與miR-182 mimics或si-NC共轉染入胰腺癌細胞系PANC-1。培養(yǎng)48 h后，用PBS洗滌細胞，然后在室溫下用被動裂解緩沖液裂解20 min。收集孵育裂解物并轉移到96孔板中，并將等分試樣添加到板中。立即添加螢光素酶檢測試劑Ⅱ后，在Infinite M200讀板器系統(tǒng)中測量螢光素酶活性，檢測轉染后細胞相對的螢光素酶活性。

1.7 Western blot

收集轉染后的PANC-1細胞，用蛋白酶抑制劑混合物在冰冷的RIPA 緩沖液中裂解細胞并在冰上孵育30 min。在10%～15% Tris-Glycine Gels中進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將分離的蛋白質轉移到PVDF膜上。用含0.05%Tween-20和5%牛奶的Tris 緩沖鹽水封閉膜，予一抗孵育，并按標準程序洗滌3次。一抗是兔單克隆抗β-連環(huán)素（β-catenin）抗體（1∶200）、兔單克隆抗c-Myc（1∶300）、兔單克隆抗周期素D1（cyclin D1）抗體（1∶300）、兔單克隆抗GAPDH（1∶400）。與HRP偶聯(lián)的二抗孵育后，用PBS洗滌蛋白條帶，加入顯影劑后在暗室曝光，計算條帶的灰度值和蛋白相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（±s）。通過GraphPad Prism 12.0軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)，并使用t檢驗或單向方差分析進行統(tǒng)計分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 PCAT19與miR-195-5p在胰腺癌細胞及正常胰腺導管上皮細胞中的表達

qRT-PCR示，正常胰腺導管上皮細胞系HPNE中PCAT19表達量為1.25±0.21，胰腺癌細胞系PANC-1、SW1990、HS766T、CFPAC-1中PCAT19表達水平依次為8.75±1.34、8.44±1.27、7.44±1.29、7.06±1.31，各胰腺癌細胞系中PCAT19表達水平均高于HPNE細胞（均P＜0.05）（PANC-1細胞中PCAT19增高程度最明顯，故后續(xù)實驗選用PANC-1細胞為研究對象）。HPNE細胞中miR-195-5p表達水平為4.23±0.24，胰腺癌細胞系PANC-1、SW1990、HS766T和CFPAC-1中miR-195-5p的水平依次為1.75±0.13、1.64±0.15、1.44±0.21和1.26±0.24，各胰腺癌細胞系中miR-195-5p明顯高于HPNE細胞（均P＜0.05）（圖1）。

圖1 PCAT19與miR-195-5p在胰腺癌細胞及正常胰腺導管上皮細胞中的表達水平Figure 1 The expression levels of PCAT19 and miR-195-5p in pancreatic cancer cells and normal pancreatic ductal epithelial cells

2.2 PCAT19靶點miRNA分析

前期通過生物信息學軟件starBase 2.0版檢索發(fā)現(xiàn)miR-195-5p存在與PCAT19結合位點（圖2A）。因此，進一步用螢光素酶報告質粒pGL3.0-PCAT19和miR-195-5p模擬物共轉染胰腺癌細胞PANC-1。結果表明，miR-195-5p可降低野生型質粒WT-PCAT19螢光素酶活性（P＜0.05），而對突變型質粒Mut-PCAT19螢光素酶活性無明顯影響（P＞0.05）（圖2B）。

圖2 PCAT19的靶點預測與驗證 A：PCAT19與miR-195-5p存在靶向結合位點；B：螢光素酶實驗示miR-195-5p為PCAT19的靶標分子Figure 2 Target prediction and validation of PCAT19 A: PCAT19 has binding sites for miR-195-5p; B: Dual-luciferase experiments demonstrate that miR-195-5p is a target molecule of PCAT19

2.3 PCAT19與miR-195-5p對PANC-1細胞增殖的影響

與si-NC組比較，si-PCAT19組PANC-1細胞系中miR-195-5p表達水平明顯升高（P＜0.05），而共轉染組miR-195-5p表達水平無明顯變化（P＞0.05）（圖3A）；MTT結果顯示，在轉染后24、48、72 h，si-PCAT19組A490 nm值均低于si-NC組（均P＜0.05），而共轉染組各時間點A490 nm值與si-NC組差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）（圖3B）。

圖3 PCAT19與miR-195-5p對PANC-1細胞增殖的影響 A：各組細胞miR-195-5p的表達比較；B：各組細胞的增殖曲線比較Figure 3 The impact of PCAT19 and miR-195-5p on the proliferation of PANC-1 cells A: Comparison of miR-195-5p expression among groups of cells; B: Comparison of the proliferation curves of cells in each group

2.4 PCAT19與miR-195-5p對PANC-1細胞侵襲能力的影響

Transwell結果顯示，si-NC組侵襲細胞數(shù)為（180.7±10.4）個，si-PCAT19組侵襲細胞數(shù)為（78.7±9.34）個，共轉染組侵襲細胞數(shù)為（175.3±9.5）個，si-PCAT19組侵襲細胞數(shù)明顯少于si-NC組和共轉染組（均P＜0.05），si-NC組和共轉染組侵襲細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖4）。

圖4 PCAT19與miR-195-5p對PANC-1細胞侵襲能力的影響Figure 4 The influence of PCAT19 and miR-195-5p on the invasion capability of PANC-1 cells

2.5 PCAT19 表達水平對Wnt/β-Catenin信號通路蛋白的影響

鑒于Wnt/β-catenin信號通路在胰腺癌進展中起重要作用，故分析PCAT19/miR-195-5p是否參與Wnt/β-catenin信號通路調控過程。Western blot結果顯示，si-PCAT19組中β-catenin、c-Myc和cyclin D1表達水平下調，明顯低于si-NC組和共轉染組（均P＜0.05），si-NC組和共轉染組β-catenin、c-Myc和cyclinD1表達水平差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）（圖5）。

圖5 PCAT19與miR-195-5p對Wnt/β-Catenin信號通路蛋白表達的影響Figure 5 The effect of PCAT19 and miR-195-5p on the expression of proteins in the Wnt/β-Catenin signaling pathway

3 討 論

近年來，越來越多的證據(jù)[11-12]表明lncRNA在介導復雜的腫瘤細胞生物學過程中發(fā)揮著至關重要的作用，特別是在惡性腫瘤中，這引起了希望揭示其潛在機制的學術界的極大關注。lncRNA在腫瘤生物學過程中扮演著重要的角色，可調控多種腫瘤的增殖[13]、凋亡[14]、遷移及侵襲[15]、自噬[16]、鐵死亡[17]，并影響著預后[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌細胞系中，PCAT19表達水平顯著上調，研究結果與文獻[13]報道一致。在前列腺癌[19]組織和體外培養(yǎng)的細胞系中均發(fā)現(xiàn)PCAT19表達水平較正常組織和細胞系顯著上調。同時，在非小細胞肺癌[20]中也發(fā)現(xiàn)類似的結果，其體外培養(yǎng)的細胞系中PCAT19表達水平上調。在體外培養(yǎng)的膠質瘤[10]細胞中發(fā)現(xiàn)，干擾或敲低PCAT19表達后，膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力顯著下降。在喉癌[7]中，PCAT19通過調節(jié)miR-182/PDK4軸促進細胞增殖、腫瘤發(fā)生及代謝平衡。在肺腺癌[9]中，PCAT19可靶向miR-143-3p調控細胞增殖、遷移和侵襲，且是影響肺腺癌預后的獨立危險因子。通過干擾RNA技術敲低胰腺癌細胞系中PCAT19表達水平后，發(fā)現(xiàn)胰腺癌細胞增殖和侵襲能力受到顯著抑制，提示沉默PCAT19表達可能發(fā)揮抑癌的功能。雙螢光素酶基因報告實驗證實PCAT19下游的靶miRNA為miR-195-5p。同時在胰腺癌細胞系中發(fā)現(xiàn)與正常胰腺導管上皮細胞系相比，胰腺癌細胞系中miR-195-5p表達水平顯著下調，而下調PCAT19表達后，胰腺癌細胞中miR-195-5p表達水平顯著增加，提示兩者可能存在負向調節(jié)關系。

大量的lncRNA可作為miRNA的分子海綿或內源性競爭性RNA而在多種腫瘤中介導腫瘤的發(fā)生和進展[21]。lncRNA-NEAT1促進沉默調節(jié)蛋白1表達并通過海綿化miR-34a激活Wnt/β-catenin信號通路促進結直腸癌的發(fā)生和進展[22]。在胰腺癌[23]中，lncRNA TP73-AS1可通過發(fā)揮分子海綿作用競爭性抑制miRNA-128-3p表達，進而通過miRNA-128-3p/GOLM1軸促進胰腺癌的發(fā)生和進展。本研究進一步發(fā)現(xiàn)下調miR-195-5p表達水平可顯著恢復下調PCAT19對胰腺癌細胞增殖和侵襲的抑制作用。上述結果顯示PCAT19可能作為miR-195-5p分子海綿而發(fā)揮作用。

Wnt/β-catenin 信號通路在胰腺癌發(fā)生和進展中發(fā)揮重要作用[24]。研究[25]顯示在胰腺癌中，Wnt/β-catenin信號通路被激活，從而導致信號通路下游相關蛋白的表達水平增加，促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲，促進胰腺癌的發(fā)生和進展。最新研究也顯示通過開發(fā)針對Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑在體外可顯著抑制胰腺癌細胞增殖和侵襲[26]。目前研究[27]發(fā)現(xiàn)，大量的lncRNA可通過調節(jié)Wnt/β-catenin信號通路而發(fā)揮作用，例如lncRNA H19/miR-194/PFTK1軸即可通過激活Wnt/β-catenin信號通路而促進胰腺癌細胞增殖和侵襲。在膀胱癌中，miR-195-5p可通過調控Wnt/β-catenin信號通路而抑制細胞增殖、遷移和侵襲[28]。在結腸癌中，circ_0038718可通過miR-195-5p/Wnt/β-catenin信號通路促進腫瘤惡性進展[29]。由此筆者推測PCAT19、miR-195-5p可能與Wnt/β-catenin信號通路存在著密切聯(lián)系，PCAT19可能通過調控Wnt/β-catenin信號通路影響胰腺癌的進展。故本研究進一步通過Western blot實驗分析Wnt/β-catenin信號通路是否參與PCAT19/miR-195-5p調節(jié)胰腺癌細胞增殖和侵襲，結果顯示，單獨敲低PCAT19可顯著降低Wnt/β-catenin信號通路的關鍵蛋白表達，包括β-catenin、c-Myc和cyclin D1，同時進行PCAT19敲低和下調miR-195-5p表達后Wnt/β-catenin信號通路的關鍵蛋白表達水平無顯著變化。本研究發(fā)現(xiàn)，敲低PCAT19表達水平可抑制Wnt/β-catenin信號通路，而下調miR-195-5p后可部分恢復敲低PCAT19對胰腺癌細胞增殖和侵襲的抑制作用，表明沉默PCAT19表達抑制胰腺癌細胞增殖和侵襲的機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關，提示沉默PCAT19表達可能作為胰腺癌潛在的治療靶點。

當然，由于本研究是在細胞系中的研究，不可避免存在一定的不足，比如：PCAT19在胰腺癌組織中的表達及功能，在模式動物體內的功能如何，都值得進一步研究。綜上，敲低PCAT19表達可能通過上調miR-195-5p抑制胰腺癌細胞增殖和侵襲，機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路有關，其可能為胰腺癌新的治療靶點。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：趙銀峰參與課題設計及寫作；梁云參與細胞增殖實驗；魏天天參與細胞侵襲實驗；嘉玉成參與課題指導及論文寫作修改。