廣西壯瑤藥瘤果紫玉盤SCoT-PCR反應(yīng)體系建立及引物篩選

張尚文 楊天為 黃詩宇 李婷 高曼熔 何龍飛 張向軍

DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.06.006

摘要：【目的】建立瘤果紫玉盤SCoT-PCR最佳反應(yīng)體系，并篩選出適宜的SCoT引物，為瘤果紫玉盤種質(zhì)鑒定分類、親緣關(guān)系分析和遺傳多樣性分析提供理論參考?！痉椒ā恳詮V西河池、百色、柳州、南寧4份瘤果紫玉盤野生種質(zhì)為試材，通過單因素試驗和正交試驗對瘤果紫玉盤SCoT-PCR反應(yīng)體系的DNA模板用量、引物用量和Mix預(yù)混液用量3個因素進行優(yōu)化，并使用優(yōu)化后最佳反應(yīng)體系進行SCoT引物篩選。最后將SCoT-PCR最佳反應(yīng)體系和篩選出的引物用于瘤果紫玉盤種質(zhì)的遺傳多樣性分析?！窘Y(jié)果】單因素試驗結(jié)果顯示，DNA模板用量為40～70 ng，引物（10 μmoL/L）用量為1.0～1.4 μL，Mix預(yù)混液用量為9.0～12.0 μL范圍內(nèi)擴增效果較好，通過L16（43）正交試驗確定瘤果紫玉盤的SCoT-PCR最佳反應(yīng)體系20.0 μL：DNA模板（40 ng/μL）1.0 μL，引物（10 μmoL/L）1.2 μL，Mix預(yù)混液10.0 μL，7.8 μL ddH2O。利用最佳反應(yīng)體系篩選出26條適用于瘤果紫玉盤的SCoT引物，并確定了各引物最適的退火溫度。26條SCoT引物在4份瘤果紫玉盤材料中共擴增出305個基因位點，其中多態(tài)性位點204個，多態(tài)性比率為66.89%，平均每條引物擴增出11.7個基因位點，有8.7個多態(tài)性位點。4份瘤果紫玉盤種質(zhì)的平均等位基因數(shù)（Na）為1.7377，平均有效等位基因數(shù)（Ne）為1.5344，Nei’s基因多樣性指數(shù)（H′）為0.3053，Shannon指數(shù)（I）為0.4449。4份瘤果紫玉盤間的遺傳相似系數(shù)為0.5443～0.6492，遺傳距離為0.4320～0.6083，說明4份瘤果紫玉盤種質(zhì)間存在較大的遺傳變異，遺傳多樣性水平較高?！窘Y(jié)論】建立的SCoT-PCR最佳反應(yīng)體系和篩選出的26條SCoT標(biāo)記引物擴增效果較好，可用于瘤果紫玉盤種質(zhì)資源的鑒定分類、親緣關(guān)系分析和遺傳多樣性分析。

關(guān)鍵詞：瘤果紫玉盤；SCoT-PCR；反應(yīng)體系優(yōu)化；引物篩選；遺傳多樣性

中圖分類號：S567.19? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2023）06-1646-10

Establishment of SCoT-PCR reaction system and primer

screening of Guangxi Zhuang-Yao medicine Uvaria kweichowensis

ZHANG Shang-wen1， YANG Tian-wei1， HUANG Shi-yu1， LI Ting1， GAO Man-rong1，2，

HE Long-fei2， ZHANG Xiang-jun1*

（1Biotechnology Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Science，Nanning，Guangxi? 530007，China；

2College of Agriculture，Guangxi University，Nanning，Guangxi? 530004，China）

Abstract：【Objective】The purpose of the study was to establish the optimal SCoT-PCR reaction system for Uvaria kweichowensis， and to screen out the suitable SCoT primers， so as to provide theoretical references for germplasm identification and classification， genetic relationship analysis and genetic diversity analysis of U. kweichowensis. 【Method】Four wild germplasms of U. kweichowensis in Hechi， Baise， Liuzhou and Nanning of Guangxi were used as test materials， and the three factors of the SCoT-PCR reaction system of U. kweichowensis， namely， DNA template dosage， primer dosage and Mix premix dosage were optimized by single factor test and orthogonal test， and the optimized SCoT-PCR reaction system was used for SCoT primer screening. The optimal SCoT-PCR reaction system and screened primers were used to analyze the genetic diversity of U. kweichowensis germplasm. 【Result】The results of single factor test showed that the amplification effect was better at the dosages of 40-70 ng of DNA template，? 1.0-1.4 μL of primer （10 μmoL/L）， and 9.0-12.0 μL of Mix premix. The optimal SCoT-PCR reaction system （20.0 μL）? for U. kichowensis was determined by L16（43） orthogonal test： 1.0 μL of DNA template （40 ng/μL）， 1.2 μL of primer （10 μmoL/L）， 10.0 μL of Mix premix， and 7.8 μL of ddH2O. The 26 SCoT primers suitable for U. kweichowensis were screened using the optimal reaction system， and the optimal annealing temperature of each primer was determined. A total of 305 gene loci were amplified by 26 SCoT primers in four U. kweichowensis materials， of which 204 were polymorphic loci， wit a polymorphism rate of 66.89%. On average，11.7 gene loci were amplified by each primer， among which there were 8.7 polymorphic loci. The average allele number （Na） of the four U. kweichowensis germplasms was 1.7377， the average effective number of alleles （Ne） was 1.5344， the Nei’s gene diversity index （H'） was 0.3053， and Shannon index （I） was 0.4449. The genetic similarity coefficients among the four U. kweichowensis ranged from 0.5443 to 0.6492， and the genetic distances ranged from 0.4320 to 0.6083， indicating that there was? a large genetic variation among the four U. kweichowensis germplasms， and the level of genetic diversity was high. 【Conclusion】The established SCoT-PCR optimal reaction system and the screened 26 SCoT marker primers have good amplification effects， which can be used for germplasm identification and classification， genetic relationship analysis， and genetic diversity analysis of germplasm resources of U. kweichowensis.

Key words： Uvaria kweichowensis； SCoT-PCR； reaction system optimization； primer screening； genetic diversity

Foundation items： National Modern Agricultural Industrial Technology System （CARS-21）；Guangxi Key Research and Development Plan Project （Guike 21220042）；Guangxi Characteristic Crop Test Station Project （Gui TS2022002）；Innovation Project in Key Areas of Guangxi Soil and Water Conservation Society （202009001）

0 引言

【研究意義】瘤果紫玉盤（Uvaria kweichowensis）為番荔枝科紫玉盤屬植物，是一種攀援灌木，主要分布于我國貴州、廣西等地，生長于海拔1000 m的地區(qū)，其味微甘性溫，具消炎止痛、活血通經(jīng)的功效。瘤果紫玉盤已被列入廣西壯藥（廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，2018）和瑤藥（廣西壯族自治區(qū)藥品監(jiān)督管理局，2022）。瘤果紫玉盤植物中含有黃酮、多氧取代環(huán)己烯、番荔枝內(nèi)酯、生物堿等成分，在抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥等方面具有重要作用（許瓊明等，2006，2007）。民間常用瘤果紫玉盤葉煮沸作茶飲用，對高尿酸癥、肝癌、肝腹水和前列腺疾病有較明顯的作用，同時對風(fēng)濕和類風(fēng)濕有一定的療效。雖然瘤果紫玉盤具有非常高的藥用價值，但不同地區(qū)的瘤果紫玉盤種質(zhì)中有效成分含量區(qū)別較大。分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于物種種質(zhì)資源研究，能揭示不同個體或群體之間的遺傳變異情況，在物種的遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、育種研究等方面具有重要意義。SCoT是一種能擴增到與性狀相關(guān)的目的基因片段的分子標(biāo)記，其具有穩(wěn)定性強、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富、操作快捷簡便、成本較低等優(yōu)點，非常適用于植物遺傳特性方面的研究（龍治堅等，2015）。因此，建立廣西壯瑤藥瘤果紫玉盤SCoT-PCR最佳反應(yīng)體系，并篩選適宜的引物，對瘤果紫玉盤種質(zhì)鑒定分類、親緣關(guān)系分析和遺傳多樣性分析具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，瘤果紫玉盤尚未進行人工引種栽培，野生種質(zhì)資源稀少，有關(guān)種質(zhì)資源的研究鮮見報道，育種研究停滯不前，阻礙了瘤果紫玉盤潛在藥用價值的研究與開發(fā)。據(jù)《中國植物志》記載，瘤果紫玉盤在我國分布面積狹小，已知分布點少于10個，生境明顯退化，成熟個體數(shù)非常少。因此，瘤果紫玉盤野生種質(zhì)資源的保護與有效利用是當(dāng)前重要的工作。SCoT分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于拳卷地錢（謝鳳鳳等，2018）、葛根（尚小紅等，2019）、血葉蘭（鄭濤等，2020）、鐵皮石斛（邵征績等，2021）等藥用植物中。研究發(fā)現(xiàn)，SCoT分子標(biāo)記的擴增條帶穩(wěn)定且多態(tài)性高，能有效對種質(zhì)資源進行遺傳多樣性評價（龍治堅等，2015）。高效準(zhǔn)確獲取種質(zhì)資源SCoT分子標(biāo)記信息的前提是穩(wěn)定可靠的SCoT-PCR反應(yīng)體系，該體系受到DNA模板量、引物濃度、dNTPs濃度、Taq DNA聚合酶量等因素的影響，且各因素對PCR反應(yīng)體系的影響程度在不同物種中存在明顯差異（陳喆等，2015；戚華沙等，2022）。因此，目前已有較多研究通過正交試驗進行SCoT反應(yīng)體系優(yōu)化，以期獲得更穩(wěn)定的SCoT分子標(biāo)記信息。如對DNA模板、Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶和引物5個因素進行正交試驗（陳喆等，2015；袁柳嬌等，2017）；對DNA模板、引物和Mix預(yù)混液3種因素進行正交試驗（袁王俊等，2015；耿睿曼等，2021），其中Mix預(yù)混液為Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶的混合液，其優(yōu)點是將3種因素混合后能減少試驗操作步驟，能有效減小添加Mg2+、dNTPs和Taq DNA聚合酶的操作誤差，且提高了試驗效率，擴增結(jié)果也更穩(wěn)定。通常反應(yīng)體系優(yōu)化的研究方法主要是單因素試驗和正交試驗（李娜等，2014； 邵征績等，2021）。采用單因素試驗對各影響因素進行優(yōu)化，能分析單個影響因素的最優(yōu)范圍，快速確定單一因素的最佳用量，但PCR反應(yīng)受到各個影響因素的相互作用，僅憑單因素試驗無法分析多因素的影響結(jié)果，而正交試驗?zāi)芫C合分析多因素之間相互作用的影響，從而彌補單因素試驗的缺陷（劉新梅等，2022）。因此，通過單因素試驗確定適宜的條件范圍后，再進行正交試驗綜合分析，從而獲得更準(zhǔn)確可靠的結(jié)果。Collard和Mackill（2009）公布的36條SCoT引物具有較好的通用性，已在多種植物中獲得驗證和應(yīng)用（袁王俊等，2015；席秀利等，2018；尚小紅等，2019）?！颈狙芯壳腥朦c】目前鮮見有關(guān)瘤果紫玉盤種質(zhì)資源SCoT-PCR反應(yīng)體系建立及引物篩選的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過單因素試驗和正交試驗對SCoT-PCR反應(yīng)體系的DNA模板用量、引物用量和Mix預(yù)混液用量進行優(yōu)化，建立適用于瘤果紫玉盤的SCoT-PCR最佳反應(yīng)體系，并利用該體系進行SCoT引物篩選，確定各引物的退火溫度，最后利用篩選獲得的SCoT引物對瘤果紫玉盤種質(zhì)進行遺傳多樣性分析，為瘤果紫玉盤種質(zhì)鑒定分類和親緣關(guān)系分析提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料為瘤果紫玉盤，分別采集于廣西河池、百色、柳州和南寧4個分布地居群，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院黃云峰副研究員鑒定為瘤果紫玉盤（Uvaria kweichowensis）。在4個分布地居群中隨機挑選一株生長健康，外觀無明顯差異的植株。SCoT分子標(biāo)記引物參考Collard和Mackill（2009）公布的SCoT-1～ SCoT-36（表1），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。2×Taq PCR MasterMix（500 μmoL/L dNTPs，3 μmoL/L MgCl2，0.1 U/μL Taq DNA聚合酶）（以下簡稱Mix預(yù)混液）購自北京索萊寶科技有限公司。主要儀器設(shè)備：TProfessional梯度PCR儀（Biometra，德國）、UVI FireReader凝膠成像系統(tǒng)（UVItec Cambridge，英國）和DYY-6D型電泳儀（北京市六一儀器廠）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 基因組DNA提取 采用改良CTAB法提取4份廣西不同地區(qū)瘤果紫玉盤葉片DNA（Yi et al.，2018），通過NanoDrop One超微量分光光度計測定DNA純度及濃度，并通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測合格的DNA置于-20 ℃冰箱冷凍保存。

1. 2. 2 單因素試驗設(shè)計 選用預(yù)擴增效果較好的SCoT-29引物對DNA模板用量、引物用量、Mix預(yù)混液用量進行單因素試驗。擴增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。SCoT初始反應(yīng)體系20.0 μL：1.0 μL DNA模板（50 ng/μL），1.0 μL引物（10 μmoL/L），10.0 μL Mix預(yù)混液，ddH2O補足至20.0 μL。單一因素設(shè)6個水平梯度，其中DNA模板用量設(shè)20、30、40、50、60和70 ng；引物用量設(shè)0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 μL；Mix預(yù)混液用量設(shè)7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0 μL。按照濃度梯度改變變量因素進行加樣，其他影響因素為初始條件。

1. 2. 3 SCoT-PCR正交試驗 通過L16（43）正交試驗（表2）對DNA模板用量、引物用量和Mix預(yù)混液用量3個影響因素進行優(yōu)化，共16個處理（T1-T16）。PCR擴增程序與單因素試驗一致，擴增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測（40～60 min），在凝膠成像系統(tǒng)下觀察擴增結(jié)果，并參考尚小紅等（2018）的直觀分析法進行評分，滿分為16分，分?jǐn)?shù)越高表示擴增質(zhì)量越好。Ki表示第i水平的評分平均值，反映各水平的擴增效果，R表示同一因素不同處理水平評分平均值的極差，反映各因素對擴增結(jié)果的影響程度，根據(jù)評分結(jié)果最終確定瘤果紫玉盤SCoT-PCR的最佳反應(yīng)體系。

1. 2. 4 SCoT引物篩選及退火溫度優(yōu)化 以廣西河池地區(qū)的瘤果紫玉盤DNA為模板，通過SCoT-PCR最佳反應(yīng)體系對36條SCoT引物進行篩選，并通過設(shè)置退火溫度梯度（48、50、52、54、56和58 ℃）進行復(fù)篩，選擇背景清晰、明亮、條帶數(shù)多的引物作為瘤果紫玉盤SCoT分子標(biāo)記的候選引物。

1. 2. 5 最佳反應(yīng)體系及引物驗證 利用SCoT-PCR最佳反應(yīng)體系及SCoT候選引物對4份廣西不同地區(qū)的瘤果紫玉盤種質(zhì)進行PCR擴增，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結(jié)果，以驗證該體系和候選引物的可行性和穩(wěn)定性。

1. 2. 6 SCoT引物多態(tài)性分析 根據(jù)擴增條帶的位置轉(zhuǎn)化為0、1矩陣，即在相同遷移率下同一位點的DNA擴增條帶的有無分別記為“1”和“0”，并對SCoT引物進行多態(tài)性分析。

1. 3 統(tǒng)計分析

使用SPSS 22.0進行正交試驗設(shè)計，通過Excel 2021計算每因素各水平評分的平均值Ki和同一因素不同水平間評分平均值的極差（R）。基于4份瘤果紫玉盤種質(zhì)的分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，利用Popgene 32進行遺傳多樣性指標(biāo)、遺傳相似系數(shù)和遺傳距離計算。

2 結(jié)果與分析

2. 1 基因組DNA提取及檢測結(jié)果

4份瘤果紫玉盤種質(zhì)DNA的電泳檢測結(jié)果（圖1）顯示，條帶清晰明亮，無拖帶和污染現(xiàn)象。DNA純度和濃度檢測結(jié)果顯示，OD260/OD280為1.8～2.0，OD260/OD230為2.0～2.2，4份瘤果紫玉盤種質(zhì)DNA（S1～S4）濃度均較高，分別為310.1、298.3、353.6和132.8 ng/μL，質(zhì)量較好，滿足單因素試驗和正交試驗的DNA模板要求。

2. 2 單因素試驗結(jié)果

采用SCoT-29引物和廣西河池地區(qū)瘤果紫玉盤種質(zhì)DNA進行單因素試驗，結(jié)果（圖2）顯示，不同用量的DNA模板、引物、Mix預(yù)混液對PCR擴增效果均有不同程度地影響，其中，不同引物用量的PCR擴增效果差異較大，不同DNA模板和Mix預(yù)混液用量的PCR擴增效果差異較小。根據(jù)條帶的數(shù)量、明暗度、背景清晰度判斷擴增效果，DNA用量為20 ng時，有部分條帶缺失或模糊，而用量為30～70 ng時，隨著用量增加，部分條帶會更彌散，故選擇30～60 ng作為正交試驗梯度。引物（10 μmoL/L）用量為0.4 μL時，缺失和模糊的條帶較多，用量為0.6和0.8 μL時，雖然擴增條帶數(shù)量多，但少部分條帶略模糊，用量1.0～1.4 μL均能擴增到豐富、清晰的條帶，而用量為1.0 μL時，擴增效果最佳，用量為1.2和1.4 μL時，擴增效果基本一致，說明當(dāng)用量大于1.2 μL，擴增效果并不會明顯提升，故選擇0.6～1.2 μL作為正交試驗的梯度。Mix預(yù)混液用量為7.0 μL時，擴增條帶有缺失且較模糊，用量為9.0 μL時擴增條帶最多，但少部分條帶較模糊，用量為10.0和11.0 μL時擴增效果基本一致，用量為12.0 μL時，部分條帶亮度略微減弱，故選擇8.0～11.0 μL作為正交試驗梯度。

2. 3 正交試驗結(jié)果

各處理的PCR擴增結(jié)果（圖3）顯示，16個處理均能有效擴增出條帶，不同處理間的條帶清晰度和數(shù)量存在一定差異，評分結(jié)果如表3所示。通過Ki值可確定每個因素的最佳條件：DNA模板40 ng，引物1.2 μL，Mix預(yù)混液10.0 μL。由R可知，引物用量對擴增反應(yīng)的影響最大，其次為DNA模板用量和Mix預(yù)混液用量。最終確立SCoT-PCR的最佳反應(yīng)體系20.0 μL：1.0 μL DNA模板（40 ng/μL），1.2 μL引物（10 μmoL/L），10.0 μL Mix預(yù)混液，7.8 μL ddH2O。

2. 4 引物篩選結(jié)果

使用優(yōu)化后的最佳反應(yīng)體系對廣西河池地區(qū)的瘤果紫玉盤DNA模板在退火溫度56 ℃下進行36條SCoT引物的初步篩選，初篩后通過設(shè)置退火溫度梯度（48、50、52、54、56和58 ℃）進行復(fù)篩，挑選2次篩選結(jié)果中多態(tài)性豐富、背景清晰、條帶明亮的引物作為瘤果紫玉盤SCoT分子標(biāo)記的候選引物，部分退火溫度復(fù)篩結(jié)果如圖4所示。最終篩選出適用于瘤果紫玉盤的26條SCoT引物及相應(yīng)退火溫度（表4），適用于瘤果紫玉盤SCoT引物的退火溫度為48～56 ℃。

2. 5 SCoT-PCR最佳反應(yīng)體系和候選引物驗證結(jié)果

利用表型差異較大的4份瘤果紫玉盤種質(zhì)對SCoT-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系和候選引物進行驗證，以檢驗反應(yīng)體系和候選引物的可行性和穩(wěn)定性，部分結(jié)果如圖5所示。候選引物從4份瘤果紫玉盤種質(zhì)DNA中均能擴增出背景清晰、特異性好、多態(tài)性豐富的條帶，說明該體系結(jié)果穩(wěn)定可靠，可用于瘤果紫玉盤種質(zhì)遺傳多樣性分析。

2. 6 遺傳多樣性分析結(jié)果

由表5可知，26條SCoT引物從4份瘤果紫玉盤種質(zhì)材料中共擴增出305個位點，其中多態(tài)性位點204個，多態(tài)性比率為66.89%，平均每條引物擴增出11.7個位點，其中有8.7個多態(tài)性位點。SCoT-12引物的多態(tài)性比率最高，為100.00%，SCoT-22引物的多態(tài)性比率最低，為40.00%。由表6可知，4份瘤果紫玉盤種質(zhì)的平均等位基因數(shù)（Na）為1.7377，平均有效等位基因數(shù)（Ne）為1.5344，Nei’s基因多樣性指數(shù)（H′）為0.3053，Shannon指數(shù)（I）為0.4449。由表7可知，4份瘤果紫玉盤種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)為0.5443～0.6492，遺傳距離為0.4320～0.6083，其中柳州種質(zhì)與河池種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)最大，為0.6492，遺傳距離最近，為0.4320，南寧種質(zhì)與河池種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)最小，為0.5443，遺傳距離最遠，為0.6083。以上結(jié)果說明4份瘤果紫玉盤種質(zhì)間存在較大的遺傳變異，遺傳多樣性水平較高。

3 討論

瘤果紫玉盤是一種珍稀瀕危的藥用植物，具有極高的藥用價值，開展瘤果紫玉盤遺傳特性方面的研究能為其種質(zhì)資源的收集保護、高效利用提供理論指導(dǎo)。SCoT是一種能快速揭示物種遺傳結(jié)構(gòu)的分子標(biāo)記，對物種鑒定和親緣關(guān)系分析具有重要意義，而SCoT反應(yīng)體系優(yōu)化是在SCoT分子標(biāo)記擴增的基礎(chǔ)上，分析SCoT-PCR反應(yīng)體系中各影響因素的配比組成對擴增效果產(chǎn)生直接的影響（婁永峰等，2021），只有確定穩(wěn)定可靠的SCoT-PCR反應(yīng)體系才能用于后續(xù)的種質(zhì)遺傳特性研究。

本研究通過單因素試驗比較3個因素梯度的擴增效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同引物用量的PCR擴增效果差異較大，不同DNA模板用量和Mix預(yù)混液用量的PCR擴增效果差異較小，而正交試驗結(jié)果中3個因素的影響程度大小排序為引物用量>DNA模板用量>Mix預(yù)混液用量，說明單因素試驗結(jié)果與正交試驗結(jié)果基本一致。該結(jié)果與前人研究結(jié)果存在差異，如在鐵皮石斛SCoT-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化研究中發(fā)現(xiàn)，引物用量的影響程度最大，DNA模板用量的影響程度最?。ㄉ壅骺兊?，2021）；在陳山紅心杉SCoT-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化中研究中發(fā)現(xiàn)，Mix預(yù)混液用量的影響程度最大，DNA模板用量的影響程度最?。▕溆婪宓?，2021），說明SCoT-PCR反應(yīng)體系中各因素的影響程度會因植物材料不同而有所差異，故獲得的最佳反應(yīng)體系條件也不相同。

SCoT分子標(biāo)記是Collard和Mackill （2009）提出的一種基于單引物擴增反應(yīng)的新型分子標(biāo)記方法，公布的36條SCoT引物在多種植物中具有通用性（王俏君等，2018），如王玉等（2014）、尚小紅等（2018）分別從36條SCoT引物中篩選出20條適用于玫瑰的SCoT引物和35條適用于葛根的SCoT引物，可用于遺傳多樣性分析。在引物的篩選過程中，退火溫度直接影響到引物與DNA模板的特異性結(jié)合和擴增條帶的清晰程度，同一引物和DNA模板在不同退火溫度下產(chǎn)生的擴增結(jié)果存在顯著差異（江常勝等，2022）。本研究利用優(yōu)化后SCoT-PCR最佳反應(yīng)體系進行引物初篩，并通過退火溫度梯度復(fù)篩最終確定26條引物及其相應(yīng)退火溫度，26條SCoT引物退火溫度為48～56 ℃，與席秀利等（2018）的研究結(jié)果相比，發(fā)現(xiàn)同一引物在不同植物中的最佳退火溫度并不相同，說明同一SCoT引物應(yīng)用于不同植物材料時還需重新進行最佳退火溫度的篩選。

本研究SCoT引物多態(tài)性分析結(jié)果顯示，26條SCoT引物的多態(tài)性比率為40.00%～100.00%，平均多態(tài)性率達66.89%，26條SCoT引物在4份瘤果紫玉盤種質(zhì)中均能擴增出清晰條帶，多態(tài)性較高，其遺傳多樣性分析結(jié)果顯示，4份瘤果紫玉盤種質(zhì)間存在較大的遺傳變異，說明不同地理位置分布的種質(zhì)具有較高的遺傳多樣性，而有關(guān)居群的遺傳背景還需進一步研究。上述結(jié)果表明，優(yōu)化后的SCoT-PCR最佳反應(yīng)體系和篩選獲得的26條SCoT可有效用于瘤果紫玉盤的遺傳多樣性分析。

4 結(jié)論

通過對DNA模板用量、引物用量、Mix預(yù)混液用量進行單因素試驗和正交試驗，最終確立適用于瘤果紫玉盤的SCoT-PCR最佳反應(yīng)體系20.0 μL DNA模板（40 ng/μL）1.0 μL，引物（10 μmoL/L）1.2 μL，Mix預(yù)混液10.0 μL，ddH2O 7.8 μL。建立的SCoT-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系和篩選出的26條SCoT引物可用于瘤果紫玉盤種質(zhì)資源的鑒定分類、親緣關(guān)系分析、遺傳多樣性分析。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）

收稿日期：2022-12-01

基金項目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-21）；廣西重點研發(fā)計劃項目（桂科AB21220042）；廣西特色作物試驗站項目（桂TS2022002）；廣西水土保持學(xué)會重點領(lǐng)域創(chuàng)新項目（202009001）

通訊作者：張向軍（1975-），https：//orcid.org/0000-0002-2391-7423，副研究員，主要從事中藥材栽培與選育研究工作，E-mail：158586707 @qq.com

第一作者：張尚文（1980-），https：//orcid.org/0000-0002-8290-2950，主要從事特色藥用植物種質(zhì)資源開發(fā)與遺傳改良研究工作，E-mail：63838114@qq.com