王正平 羅麗芬 張林 段生雙 朱書生 楊敏

DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.06.009

摘要：【目的】揭示葉部噴施茉莉酸（Jasmonic acid，JA）誘導(dǎo)三七根系的代謝變化，明確顯著變化的代謝物，為三七病害的生物防治提供理論基礎(chǔ)?！痉椒ā恳匀邽樵囼灢牧?，在葉部接種黑斑病菌（Alternaria panax）菌株SL17，于接種4和8 d時測定三七植株內(nèi)源JA含量；于三七葉片外源噴施不同濃度的JA后，利用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析三七根系代謝物變化，并檢測顯著變化代謝物對主要根腐病菌的抑制活性及其灌根后誘導(dǎo)三七葉部抗黑斑病的效果?！窘Y(jié)果】葉部接種黑斑病菌4 d時，三七葉部JA和茉莉酸亮氨酸螯合物（JA-ile）的含量增加而在根系減少；接種8 d時，葉部JA含量顯著增加（P<0.05，下同），而根系中2種物質(zhì)的含量均極顯著增加（P<0.01）。外源噴施不同濃度JA后三七根系代謝變化測定結(jié)果顯示，三七根系中共檢測出125種代謝物，主要分為有機酸類、氨基酸類、酯類、糖類、胺類、核苷酸及其衍生物和酮類等，其中有機酸類、氨基酸類和糖類是根系代謝物中的主要成分。與對照相比，葉部施用JA后三七根系中的草酸和氫化乳清酸含量顯著增加。進(jìn)一步測定顯著變化的差異代謝物功能發(fā)現(xiàn)，草酸和氫化乳清酸對三七主要根腐病菌具有一定的抑制活性，其中氫化乳清酸在濃度為0.001 μg/mL時對茄腐鐮刀菌（Fusarium solani）菌株F3和銹腐病菌（Ilyonectria destructans）菌株RS6的抑制效果最佳，濃度為0.010 μg/mL時對銹腐病菌菌株RS8的抑制效果最佳，濃度為0.100 μg/mL時對惡疫霉（Phytophthora cactorum）菌株D-6的抑制效果最佳；草酸濃度為0.001 μg/mL時對菌株F3的抑制效果最佳，濃度為10.000 μg/mL時對菌株D-6的抑制效果最佳；草酸和氫化乳清酸灌根后還能明顯減小三七葉部黑斑病的病斑面積，且均在濃度10.000 μg/mL時誘導(dǎo)抗病效果最佳?！窘Y(jié)論】外源噴施JA可改變?nèi)吒荡x，促進(jìn)氫化乳清酸和草酸的積累，進(jìn)而增強三七對黑斑病的抗性，并對三七主要根腐病菌具有一定的抑制活性。

關(guān)鍵詞：三七；黑斑病菌；茉莉酸；氫化乳清酸；草酸；抗病性

中圖分類號：S435.675? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2023）06-1676-13

Effects of exogenous jasmonic acid on the metabolites of Panax

notoginseng （Burk.） F. H. Chen root system and the induction of disease resistance in Panax notoginseng （Burk.） F. H.

Chen by key metabolites

WANG Zheng-ping， LUO Li-fen， ZHANG Lin， DUAN Sheng-shuang， ZHU Shu-sheng， YANG Min*

（Yunnan Agricultural University/Key Laboratory of Agrobiodiversity and Pest Management， Ministry of Education/ State Key Laboratory for Conservation and Utilization Bio-resources in Yunnan， Kunming，Yunnan? 650201，China）

Abstract： 【Objective】This study aimed to inresligate the metabolic changes of Panax notoginseng （Burk.） F. H. Chen root system induced by jasmonic acid （JA） spraying on leaves， and clarify the significantly changed metabolites， so as to provide a basis for biological control of P. notoginseng diseases. 【Method】P. notoginseng was used as experiment materials. This study determined the content of endogenous hormone JA in P. notoginseng after inoculation on leaves with Alternaria panax strain SL17 for 4 and 8 d. Metabolic changes in P. notoginseng root system were analyzed by using gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） after exogenously spraying on leaves with different concentrations of JA. This study measured the effects of significantly changed metabolites on resistance against major root rot pathogens and the induction of black spot disease resistance in P. notoginseng after root irrigation. 【Result】The content of JA and Jasmonic acid leucine chelate（JA-ile） in the leaves increased while the content of the both substances in the root system decreased after inoculation on leaves for 4 d. The content of JA in the leaves was significantly increased （P<0.05， the same below）， and the contents of two substances in root system were extremely significantly increased （P<0.01） after inoculation for 8 d. After exogenously spraying different concentrations of JA， the metabolism change analysis of P. notoginseng root system showed that 125 metabolites were detected in the root system of P. notoginseng， mainly categorized as organic acids， amino acids， esters， sugars， amines， nucleotides and their derivatives and ketones， of which sugars， organic acids and amino acids were the main components. Compared with the blank control， the content of oxalic acid and dihydroorotic acid in the root system of P. notoginseng increased significantly after exogenously spraying JA on the leaves. Further study on significantly changed differential matebolities revealed that oxalic acid and dihydroorotic acid had certain inhibitory effect against the major root rot pathogens of P. notoginseng. Among them， dihydroorotic acid with the concentration of 0.001 μg/mL had the best inhibitory effect against Fusarium solani strain F3 and Ilyonectria destructans strain RS6. Dihydroorotic acid with the concentration of 0.010 μg/mL had the best inhibitory effect against I. destructans strain RS8. Dihydroorotic acid with the concentration of 0.100 μg/mL had the best inhibitory effect against Phytophthora cactorum strain D-6. Oxalic acid with the concentration of 0.001 μg/mL had the best inhibitory effect against F. solani strain F3. Oxalic acid with the concentration of 10.000 μg/mL had the best inhibitory effect against P. cactorum strain D-6. Oxalic acid and dihydroo-rotic acid significantly reduced the lesion area of black spot disease on leaves of P. notoginseng after root irrigation and represented the most induction of disease resistance in the concentration of 10.000 μg/mL. 【Conclusion】Exogenously spraying JA can alter P. notoginseng root system metabolism and promote the accumulation of dihydroorotic acid and oxalic acid， which enhance plant resistance against black spot disease and show inhibitory effect against main root rot pathogens.

Key words： Panax notoginseng （Burk.） F. H. Chen； Alternaria panax； jasmonic acid； dihydroorotic acid； oxalic acid； disease resistance

Foundation items： National Natural Science Foundation of China （32060719）； Yunnan Young and Middle-aged Reserve Talent Project （202005AC160045）； Yunnan Innovation Team Project （202105AE160016）； Yunnan Agriculture and Forestry Joint Key Project （202101BD070001-003）

0 引言

【研究意義】三七［Panax notoginseng （Burk.） F. H. Chen］是我國獨具特色的重要藥用資源，為五加科（Araliaceae）人參屬（Panax）植物。三七主要應(yīng)用于心腦血管系統(tǒng)疾病的治療（Watanabe and Tatsuno，2021），具有活血抗栓、止血、補血的藥理作用以及調(diào)節(jié)血壓的功效（王小其，2020）。三七主要分布于我國西南部1200～2200 m的高海拔地區(qū)（鄒石龍，2018），其獨特的生長環(huán)境易誘發(fā)多種病害，且隨著三七在各地種植年限的增加，病害的種類、發(fā)病面積及嚴(yán)重程度逐年上升，嚴(yán)重影響三七的產(chǎn)量和品質(zhì)（羅群等，2010；張帥等，2020）。根腐病和黑斑病是目前三七生產(chǎn)中危害較大的病害（蔣妮等，2011），嚴(yán)重制約了三七產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展（孫萌等，2015）。有研究顯示，生產(chǎn)中三七病害的防控措施主要包括農(nóng)藥施用、開墾新地和輪作（張金麗，2022；Wang et al.，2022）等，但這些措施均不能完全減輕病害的發(fā)生，農(nóng)藥過量施用還會帶來嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留和重金屬含量超標(biāo)等問題。因此，亟需研究綠色生態(tài)的防控措施以減輕三七主要病害的發(fā)生危害，對保障三七產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】茉莉酸（Jasmonic acid，JA）作為一種信號物質(zhì)可參與植物應(yīng)對生物和非生物脅迫的防御反應(yīng)（嚴(yán)加坤等，2019；張明菊等，2021）。研究發(fā)現(xiàn)，外源JA處理不僅能減輕水稻稻瘟病和葡萄灰霉病的發(fā)病程度（王云鋒等，2018；鄭素慧等，2022），參與西瓜對根結(jié)線蟲的系統(tǒng)防御誘導(dǎo)（Yang et al.，2018），還能有效誘導(dǎo)辣椒對青枯?。ㄚw顯陽等，2018）、草地早熟禾對白粉病的抗性（趙澤花等，2020）。對擬南芥、大麥、小麥、玉米和珍珠粟進(jìn)行的幾項研究表明，JA調(diào)控著植物對干旱脅迫的耐受性（Awan et al.，2020；Wang et al.，2021）。魏婷等（2021）通過外源施用施茉莉酸甲酯（MeJA）處理番茄幼苗提高了其對鎘（Cd）的抗性。李顏等（2022）研究發(fā)現(xiàn)，外源添加JA不僅可以緩解砷（As）在水稻幼苗根系中的積累，還能提高水稻幼苗的抗性，減少As對水稻幼苗的損害。Han等（2022）研究發(fā)現(xiàn)，JA可提高茶樹的耐冷性。因此，JA在植物遭受病原菌脅迫時也起著重要作用。另外，JA還可調(diào)節(jié)植物基因的表達(dá)，進(jìn)而積累次生代謝物，從而增強植物對各種脅迫的抵抗力（Marquis et al.，2022）。Yang等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，JA和水楊酸（SA）的平衡能促進(jìn)碳和氮資源的再分配，通過增加次級代謝產(chǎn)物有效增強圓錐鐵線蓮對紫外光的氧化防御。【本研究切入點】已有研究表明，外源施用JA一方面能使植物根系代謝發(fā)生變化，還能提高植株本身的抗性，但三七葉片施用JA后根系代謝是否發(fā)生改變，是否影響植株的抗病性等方面的研究目前尚未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以三七為試驗材料，測定葉部接種黑斑病菌后三七葉片和根系中JA含量的變化，進(jìn)而利用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析外源噴施JA后三七根系代謝物變化，明確顯著變化代謝物對主要根腐病菌的抑制活性及其灌根后誘導(dǎo)三七葉部抗黑斑病的效果，為深入解析JA誘導(dǎo)植物根系代謝變化機制及三七黑斑病生物防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試材料 健康的一年生三七苗來源于云南省昆明市尋甸縣云南農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)教育科研基地（東經(jīng)103°16'41.6"，北緯25°31'8.0"，海拔1980 m）。供試黑斑病菌（Alternaria panax）菌株SL17、茄腐鐮刀菌（Fusarium solani）菌株F3、惡疫霉（Phytophthora cactorum）菌株D-6、銹腐病菌（Ilyonectria destructans）菌株RS6和RS8均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室自三七病株分離培養(yǎng)獲得，并經(jīng)過致病性測定。

1. 1. 2 供試試劑 試驗所用化合物JA、氫化乳清酸和草酸，純度均為98%，購自上海源葉有限公司。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 接種黑斑病菌不同時間點對三七植株JA含量的影響 用接種針挑取培養(yǎng)7 d的黑斑病菌菌餅（直徑為6 mm）接種于三七葉片傷口處，每株三七接種2片葉片，接種4和8 d后分別收集未接種黑斑病菌的所有剩余葉片和根系，經(jīng)液氮研磨后，稱量150.0 mg于1.5 mL離心管中，委托中國科學(xué)院昆明植物研究所進(jìn)行測定。本研究使用島津超高效液相色譜儀LC-20A和三重四極桿質(zhì)譜儀LCMS-8040聯(lián)用系統(tǒng)，每個樣品吸取10 μL注射到ODS柱（1.6 μm，75 mm×2 mm）（Shim-pack XR-ODS III 2.0）中，柱溫40 ℃。以0.3 mL/min的流速，由溶劑A（0.05%甲酸，5 mmol甲酸銨）和溶劑B（甲醇）組成的流動相以梯度模式進(jìn)行洗脫，洗脫程序：1～3 min，B=20%；3～6.5 min，B等速升級到95%，維持0.5 min后，7 min恢復(fù)20%。采用電噴霧離子源負(fù)離子模式進(jìn)行檢測，離子源接口電壓4.5 kV，離子源溫度80 ℃；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。

1. 2. 2 外源施用JA對三七植株根系代謝的影響

1. 2. 2. 1 樣品前處理 分別配制0.001和0.010 mmol/L的JA（分別記為JA_0.001處理和JA_0.010處理）備用。選擇18盆長勢一致的一年生健康三七苗，每處理6盆，將配制好的JA溶液噴施三七苗葉部，以噴施1%甲醇為對照，24 h后取樣。將上述處理三七根系經(jīng)液氮研磨后取50.0 mg于1.5 mL離心管中，加入1 mL萃取液（甲醇∶氯仿∶水=5∶2∶2），渦旋提取6 min，4 ℃ 14000 r/min離心3 min，取450 μL上清液備用。將上述所有樣品放入真空干燥器中干燥。

1. 2. 2. 2 衍生化 在干燥好的樣品中加入80 μL鹽酸甲氧胺吡啶（20 mg/mL），80 ℃恒溫處理60 min，冷卻至室溫后加入40 μL N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（MSTFA），75 ℃處理90 min；4 ℃下14000 r/min離心3 min，取上清液80 μL，裝入有內(nèi)補管的GC進(jìn)樣瓶，上機備用。

1. 2. 2. 3 GC-MS 檢測儀器為氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS-QP2010 ultra，Shimadzu，Japan），GC條件：SH-Rxi-5Sil MS色譜柱（30.00 m×0.25 mm×0.25 μm）。起始柱溫40 ℃，以3 ℃/min升溫至80 ℃后以5 ℃/min升溫至260 ℃，保持30 min。載氣為氦氣，進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣量2 μL，進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，分流比為10∶1。MS條件：EI電離源，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，掃描范圍35～500 m/z，采集方式scan，掃描間隔0.3 s。采用島津脫機軟件、Analysis Base File Converter軟件、MSDIAL ver 3.52軟件和NIST 14數(shù)據(jù)庫進(jìn)行峰值的識別和相關(guān)數(shù)據(jù)生成。數(shù)據(jù)歸一化及后續(xù)分析在Metaboanalyst 4.0上完成。

1. 2. 3 差異代謝物氫化乳清酸和草酸對三七根腐病病原菌菌絲生長的影響 參考羅麗芬（2019）的方法進(jìn)行。分別將利用二甲基甲酰胺（DMF）溶解后的氫化乳清酸和利用無菌水溶解后的草酸添加到已滅菌的PDA培養(yǎng)基中制成終濃度為0.001、0.010、0.100、1.000和10.000 μg/mL的平板待用，分別以含有1% DMF和無菌水的PDA培養(yǎng)基為對照。在培養(yǎng)基中央分別接種直徑為6 mm的菌株F3、D-6、RS6和RS8菌餅，25 ℃暗培養(yǎng)，待對照菌落長至培養(yǎng)皿的2/3時采用十字交叉法測量各處理菌落直徑，每處理6次重復(fù)。

1. 2. 4 差異代謝物氫化乳清酸和草酸對三七抗黑斑病的誘導(dǎo)效果測定 分別配制0.001、0.010、0.100、1.000和10.000 μg/mL的氫化乳清酸和草酸溶液備用。選擇72盆長勢一致的一年生健康三七苗，分別用上述配制好的氫化乳清酸和草酸溶液灌入根部，氫化乳清酸以含1% DMF的無菌水為對照，草酸以等體積的無菌水為對照，每處理6盆。灌根24 h后用接種針挑取培養(yǎng)7 d的黑斑病菌菌餅（直徑為6 mm）接種于三七葉片傷口處，每棵苗接種2片葉片。接種后將所有盆栽放入透明塑料箱中，在26 ℃、光照強度2000 lx、12 h光暗交替條件下保濕培養(yǎng)，4 d后取發(fā)病葉片，用掃描儀（Epson perfection V850 Pro scanner）掃描病斑后，利用Adobe Photoshop CS6測量病斑面積。

1. 3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0進(jìn)行分析；通過Excel 2010和GraphPad Prism 9.4.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)繪圖；通過Metaboanalyst平臺（https：//www.metaboanalyst.ca/）對差異代謝物進(jìn)行熱圖聚類和代謝通路分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 接種黑斑病菌后不同時間點對三七內(nèi)源JA的影響

由圖1可知，葉部接種菌株SL17后不同時間點對三七植株內(nèi)源JA含量存在影響。與對照相比，接種4 d后，三七葉片中JA和茉莉酸亮氨酸螯合物（JA-ile）的含量增加（圖1-A），但根系中JA和JA-ile含量降低，其中JA含量較對照極顯著降低（P<0.01，下同）（圖1-B）；接種8 d后，葉片中JA和JA-ile含量增加（圖1-C），同時，根系中的JA和JA-ile含量極顯著增加（圖1-D）。

2. 2 外源施用JA后三七根系代謝的變化

2. 2. 1 三七根系代謝物分析 經(jīng)GC-MS檢測所有處理后得到125種代謝物，其中包括糖及衍生物33種、有機酸26種、氨基酸23種、酯類7種、酮類5種、胺類5種、核苷酸及其衍生物4種、烷類3種、多元醇類2種、其他化合物17種。

2. 2. 2 外源施用JA后三七根系差異代謝物分析

2. 2. 2. 1 主成分分析 從PCA得分圖可看出（圖2），所有樣品均處于95%置信區(qū)間，說明模型擬合效果較好，且同一處理組中的6組重復(fù)相對聚攏，試驗重復(fù)性相對良好。不同濃度JA處理與CK在主成分上明顯分離，并解釋了樣品總變量的58.98%，表明與對照相比，JA處理明顯改變了三七的根系代謝。

2. 2. 2. 2 差異代謝物分析 基于VIP≥1和P<0.05篩選差異代謝物，并對差異代謝物進(jìn)行熱圖聚類分析。結(jié)果（圖3）顯示，與CK相比，JA_0.001處理中有1種代謝物表達(dá)上調(diào)，43種代謝物表達(dá)下調(diào)；JA_0.010處理中有12種代謝物表達(dá)上調(diào)，47種代謝物表達(dá)下調(diào)。當(dāng)JA濃度為0.001 mmol/L時，有機酸中的草酸含量增加（圖3-A）；當(dāng)濃度為0.010 mmol/L時，表現(xiàn)上調(diào)的代謝物數(shù)量增多，有機酸類（戊酸、十七烷酸、草酸、抗壞血酸）、多元醇（肌醇）、糖類［L-（-）-阿拉伯糖醇、來蘇糖］、氨基酸（天門冬氨酸、脯氨酸、瓜氨酸）、核苷酸及其衍生物（雙甘肽、氫化乳清酸）在根系中的含量均增加（圖3-B）。

2. 2. 2. 3 差異代謝物代謝通路富集分析 為更直觀地反映不同處理下三七根系差異代謝物的變化情況，對JA_0.001和JA_0.010處理的差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析，得到代謝通路影響因子圖（圖4），JA_0.001處理后發(fā)生變化的代謝通路共32條，篩選出Impact>0.1或-lg P值較大的通路共4條，分別為淀粉和蔗糖代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（圖4-A）。JA_0.010處理后發(fā)生變化的代謝通路共37條，篩選出Impact>0.1或-lg P值較大的通路共12條，分別為抗壞血酸和醛糖代謝，淀粉和蔗糖代謝，磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)，半乳糖代謝，嘧啶代謝，精氨酸生物合成，磷酸肌醇代謝，檸檬酸循環(huán)，乙醛酸和二羧酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝。以上結(jié)果表明，不同濃度JA噴施三七葉片后，主要影響了根系的糖代謝、氨基酸代謝和有機酸代謝（圖4-B）。

富集到JA_0.001處理中4條通路的代謝物有7種，分別是海藻糖、草酸、順式烏頭酸、琥珀酸、甘氨酸、L-天門冬氨酸和L-丙氨酸；其中，琥珀酸、甘氨酸和L-天門冬氨酸參與了2條代謝通路（表2）。富集到JA_0.010處理中12條通路的代謝物有15種，分別是肌醇、抗壞血酸、海藻糖、甘油、氫化乳清酸、5，6-二氫脲嘧啶、草酸、順式烏頭酸、琥珀酸、甘氨酸、D-甘油酸、L-瓜氨酸、L-天門冬氨酸、L-脯氨酸和1，4-丁二胺；其中，肌醇參與了4條代謝通路，L-天門冬氨酸和琥珀酸參與了3條代謝通路（表3）。

2. 2. 2. 4 顯著差異代謝物篩選結(jié)果 進(jìn)一步將JA_0.001和JA_0.010處理中顯著變化的差異代謝物（VIP≥1，P<0.05，F(xiàn)old Change>1.5或Fold Change<0.5）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)2個濃度中下調(diào)的代謝物較多，但隨著濃度的增加，顯著上調(diào)的差異代謝物數(shù)量逐漸增多。JA_0.001處理中，顯著上調(diào)的代謝物為草酸（Fold Change>1.5），JA_0.010處理中，顯著上調(diào)的代謝物有氫化乳清酸、草酸、瓜氨酸、脯氨酸和抗壞血酸（Fold Change>1.5），其中氫化乳清酸和草酸為極顯著上調(diào)代謝物（Fold Change>2.0）（圖5-A和圖5-B）。

2. 3 差異代謝物氫化乳清酸和草酸對三七主要根腐病菌菌絲生長的影響

2. 3. 1 氫化乳清酸對三七主要根腐病菌菌絲生長的影響 由圖6可看出，氫化乳清酸對茄腐鐮刀菌菌株F3的生長具有一定抑制作用，濃度為0.001、0.100和1.000 μg/mL時能顯著抑制菌絲的生長（P<0.05，下同）（圖6-A）；在0.001和0.010 μg/mL時對惡疫霉菌株D-6無抑制效果，濃度為0.100和10.000 μg/mL時對菌株D-6的菌絲生長具有顯著的抑制活性（圖6-B）；氫化乳清酸對銹腐病菌表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，當(dāng)濃度為0.001、0.010和1.000 μg/mL時能顯著抑制菌株RS6的菌絲生長（圖6-C），濃度為0.010 μg/mL時對菌株RS8的菌絲生長具有顯著的抑制活性（圖6-D）。綜上所述，氫化乳清酸對三七主要根腐病菌具有一定的抑制作用。

2. 3. 2 草酸對三七主要根腐病菌菌絲生長的影響 由圖7可看出，草酸在濃度為0.001 μg/mL時對菌株F3菌絲生長存在明顯的抑制作用（圖7-A）；當(dāng)濃度為0.001和10.000 μg/mL時對菌株D-6菌絲生長表現(xiàn)出顯著的抑制作用（圖7-B）；草酸對菌株RS6和RS8的菌絲生長無明顯的抑制效果。表明草酸對部分三七根腐病菌具有一定的抑制作用。

2. 4 差異代謝物氫化乳清酸和草酸對三七抗黑斑病的誘導(dǎo)效果

經(jīng)不同濃度氫化乳清酸處理后，三七黑斑病的病斑面積均顯著減小。接種4 d后，對照的病斑面積為1.263 cm2，0.001、0.010、0.100、1.000和10.000 μg/mL氫化乳清酸處理后的病斑面積分別比對照小62.32%、49.59%、31.43%、42.83%和64.31%，其中，10.000 μg/mL氫化乳清酸處理后病斑面積最小（圖8-A）。

不同濃度草酸處理后，三七黑斑病的病斑面積均減小，但差異不顯著（P>0.05）。0.001、0.010、0.100、1.000和10.000 μg/mL草酸處理后的病斑面積分別比對照小19.25%、24.21%、39.87%、27.30%和68.16%，其中，10.000 μg/mL草酸處理后病斑面積最?。▓D8-B）。以上結(jié)果表明，氫化乳清酸和草酸灌根后均能誘導(dǎo)三七對黑斑病菌產(chǎn)生抗性，且濃度為10.000 μg/mL時誘導(dǎo)效果最好。

3 討論

三七由于其獨特的生長環(huán)境容易發(fā)生多種病害，三七病害的發(fā)生直接影響其品質(zhì)與產(chǎn)量，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失（崔丹丹等，2020；張雪玲等，2021）。JA是一種重要的植物內(nèi)源激素，在植物生長、發(fā)育和抗逆誘導(dǎo)等方面具有重要的生理功能（毛佳昊等，2021）。有研究發(fā)現(xiàn)，病原菌Pseudomonas syringae pv. tomato （Pst）侵染擬南芥后能顯著增加植株內(nèi)JA含量（Yuan et al.，2018）。本研究也發(fā)現(xiàn)三七葉部接種黑斑病菌4 d時，JA和JA-ile含量在葉部上調(diào)而在根系下調(diào)；接種8 d時，不僅葉部JA的含量顯著上調(diào)，且根系中JA和JA-ile的含量極顯著上調(diào)，說明三七葉部被黑斑病菌侵染后，也能使JA的含量上調(diào)，且隨著接種時間的延長，JA在根部被顯著積累。

許多研究發(fā)現(xiàn)JA可誘導(dǎo)植物代謝改變（王春麗等，2012；孫際薇，2014）。叢枝菌根真菌侵染可促進(jìn)植物體內(nèi)JA水平上升，進(jìn)而誘導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物增加，增強植物抗病性（呂亞茹等，2022）。本研究對葉部外源噴施JA處理后的三七根系進(jìn)行代謝組分析發(fā)現(xiàn)，采用GC-MS方法共鑒定出125種代謝物，經(jīng)OPLS-DA分析后從JA_0.001和JA_0.010處理中分別篩選出44和59種發(fā)生變化的差異代謝物，將這些差異代謝物進(jìn)行代謝通路富集分析，發(fā)現(xiàn)大多富集到與氨基酸代謝、有機酸代謝及生物合成相關(guān)的通路。研究表明，氨基酸代謝與植物調(diào)節(jié)滲透勢、維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)合成密切相關(guān)（劉晨露，2022），非生物脅迫后，植物細(xì)胞會激發(fā)氨基酸代謝合成親水滲透物質(zhì)，調(diào)節(jié)滲透壓，維持正常生長發(fā)育（王佳鈺，2020）；游離氨基酸在受到脅迫后能直接或間接作出響應(yīng)（Ashraf and Harris，2004）。有機酸在響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用（郭立泉等，2005），董麗娟（2018）發(fā)現(xiàn)山定子幼苗在堿脅迫條件下根系會分泌草酸以降低逆境損傷。綜上所述，外源施用JA后能增加三七根系代謝產(chǎn)物含量且富集到相關(guān)通路，與前人對植物抗逆性的研究相符（田嬌等，2015），推測JA可能通過改變代謝來增強植株抗病性。

植物誘導(dǎo)抗性在所有植物中普遍存在（鄭家瑞和李云洲，2022），植物在外源蛋白質(zhì)、糖類、有機酸等處理后，通過受體識別、信號傳導(dǎo)等產(chǎn)生防御反應(yīng)（萬宣伍等，2022）。本研究結(jié)果表明，葉部JA處理有助于促進(jìn)三七根系中氫化乳清酸和草酸含量的增加，這些物質(zhì)可能在JA誘導(dǎo)植物抗性中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，氫化乳清酸主要參與嘧啶代謝，嘧啶代謝在人類疾病控制和嘧啶的胞內(nèi)循環(huán)利用中具有重要作用，有利于免疫細(xì)胞的合成，與抗菌活性密切相關(guān)（張海彬，2021）；但目前尚無關(guān)于氫化乳清酸對植株本身的誘導(dǎo)抗性及對病原菌調(diào)控相關(guān)的報道，本研究結(jié)果可為氫化乳清酸在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用提供依據(jù)。草酸是一種在動植物、真菌中普遍存在的代謝物，主要參與乙醛酸和二羧酸代謝，提高生物體利用乙酰-CoA的能力，對植物的生長發(fā)育起著重要作用（Dutton and Evans，1996）。有研究發(fā)現(xiàn)，草酸具有很強的抗氧化能力（Kayashima and Katayama，2002）。朱麗琴等（2013）發(fā)現(xiàn)草酸處理辣椒果實后會增強其超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性，延緩辣椒果實衰老；二者的變化可能與植物響應(yīng)病原菌侵染及調(diào)控植物抗性有關(guān)，但其作用尚不明確。羅麗芬等（2019）發(fā)現(xiàn)外源添加草酸能增強三七根系的抗氧化能力，有效緩解皂苷Rg1對三七生長的自毒活性。徐翠等（2022）發(fā)現(xiàn)濃度為25 mmol/L的草酸處理狗尾草種子25 min，可有效促進(jìn)收獲當(dāng)年和儲藏1年種子的萌發(fā)及生長。在本研究中，氫化乳清酸和草酸不僅對三七主要根腐病菌具有不同程度的抑制作用，外源灌根后還能提高三七對葉部黑斑病的抗性。但本研究僅測定了三七根系代謝物中氫化乳清酸和草酸在低濃度下對三七抗黑斑病的誘導(dǎo)抗性及對根腐病菌生長的影響，后續(xù)還需對這2種物質(zhì)在根系分泌物中的含量進(jìn)行檢測，以便更好地研究其功能。另外，本研究JA外源噴施三七后，三七根系中許多代謝物被下調(diào)，后續(xù)亟需對下調(diào)的化合物開展深入研究，以明確其功能，以期對外源施用JA后三七根系代謝物的功能進(jìn)行更全面的解析。

另有研究發(fā)現(xiàn)，植物可能利用根部代謝物對土壤中的微生物進(jìn)行選擇（Akhter et al.，2015），并可通過改變代謝和分泌來影響根際微生物的種類和豐度（Turner et al.，2013）。Carvalhais等（2015）發(fā)現(xiàn)，外源添加JA可改變土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)；Huang等（2019）發(fā)現(xiàn)三萜類化合物通過定向富集或抑制特定種類細(xì)菌的生長，以調(diào)控根際微生物的種群和功能；Voges等（2019）發(fā)現(xiàn)香豆素能抑制假單胞菌屬生長。植物能在葉部病原體入侵后釋放特定的根系分泌物包括長鏈脂肪酸、氨基酸、短鏈有機酸和糖以募集有益的根際微生物，從而保護(hù)寄主或后代植物（Wen et al.，2020）。有益的根際微生物也能通過誘導(dǎo)植物的系統(tǒng)抗性（ISR）來抑制發(fā)?。╕uan et al.，2018）。Kost等（2014）發(fā)現(xiàn)，有益菌株Burkholderia phyto?rmans PsJN定殖羽扇豆和玉米的能力與其利用草酸為碳源的能力密切相關(guān)。本研究中草酸灌根后能提高三七的抗病性，可能是在三七根部募集到了某些有益菌來保護(hù)宿主植物。因此，后續(xù)亟需深入研究外源施用JA后三七能否通過調(diào)控根部代謝物及分泌物中的氫化乳清酸和草酸含量來特異性調(diào)控根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能，從而深入解析外源施用JA增強三七植株抗性的機制。

4 結(jié)論

外源噴施JA可改變?nèi)吒荡x，誘導(dǎo)氫化乳清酸和草酸的積累，進(jìn)而增強三七對黑斑病的抗性，并對三七主要根腐病菌具有一定的抑制活性。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）

收稿日期：2022-10-05

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（32060719）；云南省中青年后備人才項目（202005AC160045）；云南省創(chuàng)新團隊項目（202105AE 160016）；云南省農(nóng)林聯(lián)合重點項目（202101BD070001-003）

通訊作者：楊敏（1981-），https：//orcid.org/0000-0003-2658-3075，博士，教授，主要從事三七連作障礙研究工作，E-mail：yangminscnc @126.com

第一作者：王正平（1999-），https：//orcid.org/0000-0002-6636-7927，研究方向為三七連作障礙，E-mail：1273459195@qq.com