附子白絹病拮抗細(xì)菌的分離鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

施春蘭 湯永玉 葉坤浩 曾舒泉 張永科 何霞紅 魏朝霞 曾華蘭 葉鵬盛 吳國(guó)星

DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.06.013

摘要：【目的】從黃粉甲中分離獲得對(duì)附子白絹病病原菌具有較好抑制作用的拮抗細(xì)菌，為附子白絹病的生物防治提供菌種資源?！痉椒ā恳灶静↑S粉甲為材料，通過(guò)稀釋涂布法和平板對(duì)峙法分離并篩選對(duì)附子白絹病菌具有拮抗作用的細(xì)菌，通過(guò)形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化特征及16S rDNA序列分析等對(duì)拮抗細(xì)菌進(jìn)行種類鑒定；以拮抗細(xì)菌發(fā)酵液在600 nm波長(zhǎng)下的OD值為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)的方法對(duì)拮抗細(xì)菌的培養(yǎng)基組分以及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化；通過(guò)室內(nèi)盆栽試驗(yàn)明確拮抗細(xì)菌對(duì)附子白絹病的防治效果?！窘Y(jié)果】采用稀釋涂布法從罹病黃粉甲中分離獲得4株細(xì)菌，經(jīng)平板對(duì)峙法篩選獲得對(duì)附子白絹病菌具有較好拮抗效果的菌株TS1，該菌對(duì)齊整小核菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率可達(dá)68.03%。根據(jù)菌株TS1的菌落形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化特征及16S rDNA序列分析結(jié)果，確定菌株TS1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。菌株TS1的優(yōu)化培養(yǎng)基配方：蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、麥芽糖15.0 g/L；最佳發(fā)酵條件：裝液量30 mL、初始接種量0.50%、轉(zhuǎn)速210 r/min、培養(yǎng)溫度42 ℃、初始pH 9、培養(yǎng)時(shí)間48 h。室內(nèi)盆栽保護(hù)和治療試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株TS1對(duì)附子白絹病的平均防治效果分別為49.39%和62.97%?！窘Y(jié)論】?jī)?yōu)化的發(fā)酵方案可用于快速、大批量培養(yǎng)菌株TS1菌懸液。菌株TS1對(duì)附子白絹病有較好的防治效果，具有開發(fā)成附子白絹病生防菌的潛力。

關(guān)鍵詞：黃粉甲；內(nèi)生細(xì)菌；枯草芽孢桿菌；齊整小核菌；發(fā)酵條件；防治效果

中圖分類號(hào)：S435.672? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2023）06-1720-12

Isolation， identification and fermentation conditions optimization of antagonistic bacteria against southern blight on

Aconitum carmichaeli

SHI Chun-lan1， TANG Yong-yu1， YE Kun-hao1， ZENG Shu-quan1， ZHANG Yong-ke1， HE Xia-hong1， WEI Zhao-xia1， ZENG Hua-lan2， YE Peng-sheng2， WU Guo-xing1*

（1College of Plant Protection，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan? 650201，China； 2Institute of Industrial Crop Breeding and Cultivation，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu，Sichuan? 610066，China）

Abstract：【Objective】This study screened and obtained antagonistic bacteria with good inhibitory effect on the pathogen of southern blight on Aconitum carmichaeli from Tenebrio moliter， so as to provide strain resources for the biological control of southern blight on A. carmichaeli. 【Method】Using diseased T. moliter as the material， the bacteria with antagonistic effect on southern blight on A. carmichaeli was isolated and screened by dilution coating and plate confrontation methods. The antagonistic bacteria was identified by morphological， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence. With the OD value of bacterial fermentation broth at 600 nm as the index， the culture medium components and fermentation conditions of antagonistic bacteria were optimized by single factor experiment. The control effect of antagonistic bacteria on southern blight on A. carmichaeli was confirmed by pot experiment in laboratory. 【Result】Four strains of bacteria were obtained from T. moliter by dilution coating method. And TS1 strain with greater antagonistic effect against southern blight on A. carmichaeli was obtained by plate confrontation method， with an average inhibitory rate for Sclerotium rolfsii mycelial growth of 68.03%. The TS1 strain was identified as Bacillus subtilis based on its morphological， physiological and biochemical characteristics and the result of 16S rDNA sequence analysis. The optimized medium formula was peptone 10.0 g/L， yeast extraction powder 5.0 g/L and maltose 15.0 g/L. The optimal fermentation conditions were 30 mL of liquid， 0.50% of initial inoculum， 210 r/min of rotation speed， 42 ℃ of temperature， initial pH 9， and 48 h of incubation. The results of laboratory pot experiment and experimental treatment showed that the average control efficiency of TS1 strain against southern blight on A. carmichaeli were 49.39% and 62.97% respectively. 【Conclusion】The optimized fermentation scheme can be used to rapidly culture TS1 strain suspensions in large quantities. TS1 strain has a good control effect on southern blight on A. carmichaeli and has the potential to be developed into a biocontrol bacterium for southern blight on A. carmichaeli.

Key words： Tenebrio moliter； endogenous bacteria； Bacillus subtilis； Sclerotium rolfsii； fermentation conditions； control effect

Foundation items： Sichuan Provincial Regional Innovation Cooperation Project （2021YFQ0022）； Yunnan Science and Technology Planning Project （202105AC160037）

0 引言

【研究意義】附子（Aconitum carmichaeli）是雙子葉植物綱原始植物花被亞綱毛茛目毛茛科金蓮花亞科烏頭屬植物，可形成塊根，可作為塊根類植物的代表（李玉龍，2019）。附子在我國(guó)有很高的藥用價(jià)值，在四川、陜西和云南均有種植，其加工品有回陽(yáng)、溫理逐寒、止痛等功效（陳芳，2007）。附子白絹病是由齊整小核菌（Sclerotium rolfsii）引起的土傳性真菌病害，主要危害附子的根莖部，對(duì)我國(guó)附子的產(chǎn)量和質(zhì)量產(chǎn)生較大影響，與霜霉病、根腐病及病毒病混發(fā)嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)率可達(dá)50%以上（唐莉等，2004）。此外，齊整小核菌還會(huì)侵染辣椒、魔芋和花生等作物，宿主十分廣泛，可侵染500種以上的植物物種（Iquebal et al.，2017），造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，對(duì)于白絹病的防治以化學(xué)藥劑井岡霉素、噻呋酰胺、氟酰胺和異菌脲等殺菌劑為主，但由于長(zhǎng)期不規(guī)范用藥，造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留、病原菌抗性增強(qiáng)等一系列問(wèn)題。因此，利用綠色高效生防菌進(jìn)行生物防治對(duì)附子的安全無(wú)公害生產(chǎn)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已報(bào)道防治附子白絹病的生防菌主要有芽孢桿菌（Bacillus sp.）、假單胞桿菌（Pseudomonas adaceae）、綠粘帚霉（Gliocladium virens）、木霉菌（Trichoderma）、青霉菌（Penicillium）、根瘤菌（Rhizobium）和鏈霉菌（Streptomycetaceae）等（李敏等，2022）。其中，枯草芽孢桿菌（B. subtilis）和木霉菌等生防菌已作為菌劑廣泛投入市場(chǎng)，實(shí)現(xiàn)商品化（阮盈盈和劉峰，2020）。宋漳和陳輝（2002）從百合根部分離得到1株綠色木霉T02，用其對(duì)齊整小核菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果顯示其拮抗系數(shù)為2～3；劉任等（2005）用甲醇法、乙醇法、超聲波水法和堿法等4種方法對(duì)哈茨木霉（T. harzianum）T2菌株分生孢子中的抗菌物質(zhì)進(jìn)行提取，并通過(guò)抑菌試驗(yàn)測(cè)定各種粗提物對(duì)齊整小核菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)其活性均較好，其對(duì)齊整小核菌的抑制活性可達(dá)82.2%；文毅（2010）從魚腥草根際分離得到枯草芽孢桿菌B8，該菌對(duì)附子白絹病的盆栽防效可達(dá)56.8%；胡朝暉等（2017）從蠶沙發(fā)酵肥中分離得到枯草芽孢桿菌、熒光假單胞菌（Psdeuomnoda fluoerncnet）、類芽孢桿菌（Paenibacillus ash）和黃桿菌（Flavobacterium mizutaii），其中枯草芽孢桿菌對(duì)齊整小核菌的抑菌率可達(dá)67.6%；Thampi和Bhai（2017）從黑胡椒根際土壤中分離得到3株鏈霉菌菌株IISRBPAct1、IISRBPAct25和 IISRBPAct42，其中菌株IISRBPAct1對(duì)齊整小核菌表現(xiàn)出90%以上的抑制作用；Volpiano等（2018）從菜豆根結(jié)中分離得到16株對(duì)齊整小核菌菌絲生長(zhǎng)抑制率超過(guò)84%的根瘤菌菌株，這些拮抗菌株可產(chǎn)生高達(dá)36.5 μg/mL的IAA，同時(shí)驗(yàn)證了IAA產(chǎn)生與菌絲體抑制之間的直接相關(guān)性；Li等（2019）發(fā)現(xiàn)灰黃青霉（P. griseofulvum）菌株CF3不僅可以抑制齊整小核菌菌絲生長(zhǎng)，還能抑制菌核的形成和萌發(fā)；何俊烺等（2021）分別用哈茨木霉和綠色木霉（T. virid）對(duì)齊整小核菌進(jìn)行平板對(duì)峙，結(jié)果表明2株菌株對(duì)齊整小核菌的抑菌率分別為56.72%和58.01%；李界秋等（2022）從桑樹中分離得到貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensi）NN04，該菌對(duì)齊整小核菌的抑菌活性可達(dá)74.81%。可見，齊整小核菌的拮抗菌大多來(lái)源于土壤或植物體內(nèi)，利用昆蟲內(nèi)生菌進(jìn)行病害防治的報(bào)道極少，常見的對(duì)昆蟲腸道微生物的研究則更多集中于微生物與昆蟲之間的關(guān)系等方面，在植物病害防治方面的相關(guān)研究較少（郭軍等，2015；魏曉瑩等，2019）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前齊整小核菌拮抗菌株的獲取對(duì)象多局限于土壤或植物，其他來(lái)源的報(bào)道較少。黃粉甲是一種雜食性昆蟲，危害五谷雜糧、麥麩、果皮及天然纖維，且可降解PE；黃粉甲生存環(huán)境多樣，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng)（劉玉升等，2010；丁夢(mèng)琪，2021），其抗逆性較強(qiáng)可能是一些共生菌在發(fā)揮重要作用；罹病黃粉甲致病菌在致病時(shí)其體內(nèi)菌群發(fā)生變化，有益共生菌發(fā)揮作用對(duì)抗致病菌，此時(shí)容易分離到重要的生防菌?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)稀釋涂布法和平板對(duì)峙法從罹病黃粉甲中分離獲得對(duì)附子白絹病菌具有高效拮抗作用的細(xì)菌，通過(guò)形態(tài)和生理生化特征及16S rDNA序列分析等對(duì)拮抗細(xì)菌進(jìn)行種類鑒定，并研究拮抗菌株的最佳發(fā)酵條件及對(duì)附子白絹病的室內(nèi)防治效果，為后續(xù)拮抗菌株的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)，也為附子白絹病生防菌的來(lái)源及其生物防治提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 供試菌株 拮抗細(xì)菌：從罹病黃粉甲中分離篩選獲得。病原菌：齊整小核菌，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室自行分離并鑒定。

1. 1. 2 供試培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏3.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 5.0 g/L、瓊脂1.5 g/L，121 ℃滅菌20 min；馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯20.0 g/L、葡萄糖2.0 g/L、瓊脂1.5 g/L，121 ℃滅菌30 min；蛋白胨酵母蔗糖培養(yǎng)基（YSP）：蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、蔗糖20.0 g/L、瓊脂15.0 g/L，115 ℃滅菌30 min；牛肉膏酵母葡萄糖培養(yǎng)基（NYBD）：牛肉膏8.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、瓊脂15.0 g/L，115 ℃滅菌30 min；細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（CM）：葡萄糖5.0 g/L、（NH4）2SO4 2.0 g/L、檸檬酸鈉1.0 g/L、MgSO4·7H2O 2.0 g/L、K2HPO4 4.0 g/L、KH2PO4 6.0 g/L、瓊脂15.0 g/L，121 ℃滅菌20 min；蛋白胨酵母培養(yǎng)基（LB）：蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L、瓊脂15.0 g/L，121 ℃滅菌20 min。

1. 1. 3 主要儀器和試劑 超凈工作臺(tái)（江蘇安泰空氣技術(shù)有限公司）、冰箱（青島海爾股份有限公司）、高壓滅菌鍋（ZEALWAY GR85DA）、-80 ℃超低溫冰箱（Thermo 906）、SPX-300B-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）、普通天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、人工氣候箱（寧波東南儀器有限公司）、電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（上海市崇明實(shí)驗(yàn)儀器廠）。蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、酵母浸粉和氯化鈉等分析純?cè)噭┚?gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1. 2 拮抗細(xì)菌分離

參照何明川等（2021）的方法，先將罹病黃粉甲用75%酒精處理，后用無(wú)菌水漂洗3次，將處理好的黃粉甲放入裝有1 mL無(wú)菌水的離心管中用研磨棒充分研磨，制備梯度稀釋菌懸液。取10-5、10-6和10-7稀釋度的菌懸液100 μL分別涂布于NA培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度3次重復(fù)。倒置平皿于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。在超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌挑針挑取NA培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的單菌落并于LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)；純化3～4次，將菌株保存于4 ℃冰箱備用。

1. 3 拮抗細(xì)菌抑菌效果測(cè)定

1. 3. 1 平板對(duì)峙法 將培養(yǎng)4 d的齊整小核菌打成6 mm大小的菌餅，接種于PDA培養(yǎng)基中央，用無(wú)菌牙簽在距菌餅2 cm左右處十字線對(duì)稱接種細(xì)菌，以不接種細(xì)菌的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，于28 ℃培養(yǎng)4 d后觀察并記錄抑菌圈大小，20 d后觀察并記錄菌核產(chǎn)生情況。重復(fù)3次。

菌落直徑（cm）=（橫徑+縱徑）/2

抑菌率（%）＝（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100

式中，處理菌落直徑為對(duì)稱拮抗細(xì)菌的兩點(diǎn)間距離減去兩點(diǎn)拮抗細(xì)菌的抑菌圈半徑。

菌核萌發(fā)抑制率（%）=（對(duì)照菌核數(shù)量-處理菌核數(shù)量）/對(duì)照菌核數(shù)量×100

1. 3. 2 拮抗細(xì)菌揮發(fā)物對(duì)附子白絹病菌生長(zhǎng)的影響 參考張霞等（2020）的方法并加以改進(jìn)。將拮抗細(xì)菌在LB培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，同時(shí)將齊整小核菌6 mm大小的菌餅接種于PDA培養(yǎng)基上，采用對(duì)扣法（劉海洋等，2018）將有病原菌的一面置于上方，以不劃線作對(duì)照，3次重復(fù)，于28 ℃培養(yǎng)4 d后觀察并記錄抑菌圈大小。培養(yǎng)20 d后觀察并記錄菌核產(chǎn)生情況。計(jì)算方法參照1.3.1。

1. 3. 3 拮抗細(xì)菌無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)附子白絹病菌菌絲生長(zhǎng)的影響 參照李玉龍（2019）及彭啟超等（2022）的方法并加以改進(jìn)。將拮抗細(xì)菌發(fā)酵液以8000 r/min離心15 min，收集上清液，用0.22 μm濾膜過(guò)濾得到無(wú)菌濾液。無(wú)菌濾液用無(wú)菌水進(jìn)行5倍和10倍稀釋后，將原液、5倍和10倍稀釋液與加熱冷卻至50～55 ℃的PDA培養(yǎng)基以1∶4的比例混合后倒入90 mm的平板中，即得到最終稀釋為5倍、25倍和50倍發(fā)酵液PDA平板。將齊整小核菌6 mm大小的菌餅接于平板中央，以添加等量無(wú)菌水的PDA培養(yǎng)基平板為對(duì)照，3次重復(fù)，于28 ℃下培養(yǎng)，每天觀察并記錄抑菌圈大小。培養(yǎng)20 d后觀察并記錄菌核產(chǎn)生情況。計(jì)算方法參照1.3.1。

1. 3. 4 拮抗細(xì)菌無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)附子白絹病菌菌核萌發(fā)的影響 參照李玉龍（2019）的方法并加以改進(jìn)。將拮抗細(xì)菌發(fā)酵液以8000 r/min離心15 min，收集上清液，用0.22 μm濾膜過(guò)濾得到無(wú)菌濾液。無(wú)菌濾液用無(wú)菌水進(jìn)行5倍和10倍稀釋后，將原液、5倍和10倍稀釋液與加熱冷卻至50～55 ℃的PDA培養(yǎng)基以1∶4的比例混合后倒入90 mm的平板中，即得到最終稀釋為5倍、25倍和50倍發(fā)酵液PDA平板。每個(gè)平板放置12個(gè)菌核，以添加等量無(wú)菌水的PDA培養(yǎng)基平板為對(duì)照，3次重復(fù)，于28 ℃培養(yǎng)，每24 h觀察菌核萌發(fā)情況并記錄。計(jì)算方法參照1.3.1。

1. 4 拮抗細(xì)菌鑒定

1. 4. 1 形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理生化特征 在LB培養(yǎng)基上接種拮抗細(xì)菌，28 ℃培養(yǎng)3 d，待長(zhǎng)出單菌落觀察形態(tài)。根據(jù)《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》對(duì)菌株的生理生化特性進(jìn)行測(cè)定（何明川等，2021）。

1. 4. 2 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建 采用細(xì)菌16S rDNA基因通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對(duì)拮抗細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成）。PCR反應(yīng)體系50 μL：PCR Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板3 μL，Rnase H2O 18 μL。擴(kuò)增程序：94.8 ℃預(yù)變性2.5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后送至昆明擎科生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，并選擇同源性較高的序列使用ClustalX 1.83和MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（何明川等，2021）。

1. 5 拮抗細(xì)菌發(fā)酵條件篩選

1. 5. 1 種子液制備 挑取拮抗細(xì)菌單菌落于100 mL LB液體培養(yǎng)基中28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，備用。

1. 5. 2 培養(yǎng)基優(yōu)化 配制YSP、NYBD、NA、LB和CM培養(yǎng)基各100 mL，分別接入50 μL種子液，于28 ℃下180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h，取出測(cè)定不同培養(yǎng)基中細(xì)菌的OD600，篩選最佳培養(yǎng)基（何明川等，2021）。每處理3次重復(fù)（下同）。

1. 5. 3 碳源對(duì)拮抗細(xì)菌生長(zhǎng)速度的影響 以最佳培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖和淀粉作為碳源，其余成分保持不變，接入50 μL種子液在28 ℃下180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h，取出測(cè)定不同培養(yǎng)基中細(xì)菌的OD600，篩選出最佳碳源。

1. 5. 4 氮源對(duì)拮抗細(xì)菌生長(zhǎng)速度的影響 以最佳培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以蛋白胨、酵母浸粉、硝酸銨、氯化銨和甘氨酸作為氮源，其余成分保持不變，接入50 μL種子液在28 ℃下180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h，取出測(cè)定不同培養(yǎng)基中細(xì)菌的OD600，篩選出最佳氮源。

1. 5. 5 初始接菌量對(duì)拮抗細(xì)菌生長(zhǎng)速度的影響 采用最佳培養(yǎng)基，種子液為液體培養(yǎng)基體積比的0.05%、0.10%、0.50%、1.00%和2.00%，接入菌種在28 ℃下180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h，取出測(cè)定不同培養(yǎng)基中細(xì)菌的OD600，篩選出最佳初始接菌量。

1. 5. 6 裝液量對(duì)拮抗細(xì)菌生長(zhǎng)速度的影響 采用最佳培養(yǎng)基，裝液量分別配置為30、60、90、120和150 mL，接入50 μL種子液在28 ℃下180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h，取出測(cè)定不同培養(yǎng)基細(xì)菌的OD600，篩選出最佳裝液量。

1. 5. 7 轉(zhuǎn)速對(duì)拮抗細(xì)菌生長(zhǎng)速度的影響 采用最佳培養(yǎng)基，分別設(shè)置120、150、180、210和240 r/min的轉(zhuǎn)速，接入50 μL種子液在28 ℃下不同轉(zhuǎn)速搖床振蕩培養(yǎng)24 h，取出測(cè)定不同培養(yǎng)基中細(xì)菌的OD600，篩選出最佳轉(zhuǎn)速。

1. 5. 8 溫度對(duì)拮抗細(xì)菌生長(zhǎng)速度的影響 采用最佳培養(yǎng)基，分別設(shè)置20、24、28、32、36、40和46 ℃，接入50 μL種子液在優(yōu)化條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)24 h，取出測(cè)定不同培養(yǎng)基中細(xì)菌的OD600，篩選出最佳培養(yǎng)溫度。

1. 5. 9 初始pH對(duì)拮抗細(xì)菌生長(zhǎng)速度的影響 采用最佳培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)pH為4、5、6、7、8、9和10，接入50 μL種子液在優(yōu)化條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)24 h，取出測(cè)定不同培養(yǎng)基中細(xì)菌的OD600，篩選出最佳初始pH。

1. 5. 10 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)拮抗細(xì)菌生長(zhǎng)速度的影響 采用最佳培養(yǎng)基，接入50 μL種子液在優(yōu)化條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，開始培養(yǎng)24 h內(nèi)每隔2 h測(cè)量1次OD600，24 h后每隔12 h測(cè)量1次OD600，繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，篩選出最佳培養(yǎng)時(shí)間。

1. 6 附子白絹病室內(nèi)盆栽防效試驗(yàn)

參考何明川等（2022）、彭啟超等（2022）的方法并加以改進(jìn)。采用拮抗細(xì)菌菌液灌根處理附子測(cè)定其對(duì)白絹病的防效。試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理，每處理9盆附子，每盆1株，試驗(yàn)盆栽隨機(jī)擺放。保護(hù)試驗(yàn)：分別用拮抗細(xì)菌發(fā)酵液（1×108 CFU/mL）、噻呋酰胺和無(wú)菌水進(jìn)行灌根處理，2 d后接種病原菌。治療試驗(yàn)：先接種病原菌，2 d后分別用拮抗細(xì)菌發(fā)酵液（1×108 CFU/mL）、噻呋酰胺和無(wú)菌水進(jìn)行灌根處理。接種病原菌后每隔20 d對(duì)附子白絹病發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查。病情分級(jí)：按附子莖葉枯萎程度分為4級(jí)，0級(jí)，無(wú)病葉；1級(jí)，病葉數(shù)量小于總?cè)~片數(shù)的50%；2級(jí)，病葉數(shù)量為50%～100%，但莖稈未枯萎；3級(jí)，病葉數(shù)量為100%，莖稈枯萎。分別統(tǒng)計(jì)各處理各病級(jí)的株數(shù)，計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)及防治效果。

發(fā)病率（%）=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100

病情指數(shù)=［∑（各級(jí)病株×各級(jí)代表值）/調(diào)查總株數(shù)×3］×100

防治效果（%）=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100

1. 7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 26.0、GraphPadPrism 8.0和Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析和圖表制作，采用Duncan’s新復(fù)極差法檢驗(yàn)不同處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 拮抗細(xì)菌的分離與篩選

從罹病黃粉甲初步分離得到4株細(xì)菌。經(jīng)平板對(duì)峙法進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)菌株Z1和T2對(duì)齊整小核菌菌絲無(wú)抑制效果，菌株TS1和TZ1均有抑制效果，且菌株TS1的效果最佳，對(duì)齊整小核菌菌絲的抑制率可達(dá)68.03%（表1）。表明菌株TS1對(duì)齊整小核菌有較好的抑制作用，選取菌株TS1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2. 2 拮抗菌株TS1對(duì)齊整小核菌的抑制效果

2. 2. 1 平板對(duì)峙結(jié)果 由圖1和表2可知，菌株TS1對(duì)齊整小核菌菌絲的生長(zhǎng)具有較好的抑制效果，抑制率可達(dá)68.03%；菌株TS1處理與對(duì)照產(chǎn)生的菌核數(shù)量也存在較大差異，處理的菌核數(shù)量顯著少于對(duì)照（P<0.05，下同）。

2. 2. 2 拮抗細(xì)菌揮發(fā)物對(duì)附子白絹病菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)菌核的影響 由表3可知，菌株TS1產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)齊整小核菌菌絲的抑制率可達(dá)71.8%；處理與對(duì)照產(chǎn)生的菌核數(shù)量也存在較大差異，處理的菌核數(shù)量顯著少于對(duì)照。

2. 2. 3 拮抗細(xì)菌無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)附子白絹病菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)菌核的影響 不同稀釋倍數(shù)的拮抗細(xì)菌無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)齊整小核菌菌絲生長(zhǎng)及菌核產(chǎn)生均有一定影響，且隨著稀釋倍數(shù)的增加，無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)菌絲生長(zhǎng)及菌核產(chǎn)生的抑制效果總體上呈逐漸下降的趨勢(shì)（表4和表5）。

2. 2. 4 拮抗細(xì)菌無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)附子白絹病菌菌核萌發(fā)的影響 由表6可知，拮抗細(xì)菌無(wú)菌發(fā)酵液可抑制附子白絹病菌菌核萌發(fā)，且隨著稀釋倍數(shù)的增加呈現(xiàn)抑制率降低的趨勢(shì)。

2. 3 拮抗細(xì)菌鑒定結(jié)果

2. 3. 1 拮抗菌形態(tài)特征及其生理生化特征 菌株TS1在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3 d后，形成圓形乳白稍黃菌落，表面干燥，邊緣完整且凸起有褶皺，菌體桿狀，產(chǎn)生橢圓形芽孢，為革蘭氏陽(yáng)性菌（圖2）。生理生化特征測(cè)定結(jié)果（表7）顯示，淀粉水解試驗(yàn)、牛奶石蕊試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵、甲基紅試驗(yàn)、H2S水解試驗(yàn)均為陽(yáng)性。

2. 3. 2 拮抗細(xì)菌分子鑒定結(jié)果 將菌株TS1校對(duì)后的序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示該序列與B. subtilis的相似性為87%。下載同源性高的序列，使用ClustalX 1.83和MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果（圖3）表明，菌株TS1與B. subtilis subsp.聚為一類。綜合拮抗細(xì)菌的形態(tài)特征及分子鑒定結(jié)果，初步鑒定菌株TS1為枯草芽孢桿菌。

2. 4 拮抗細(xì)菌發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2. 4. 1 培養(yǎng)基優(yōu)化 由圖4可知，菌株TS1分別在YSP、NYBD、NA、LB和CM等5種培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h的OD600分別為1.640、1.490、1.460、1.630和0.586，各處理間存在一定差異，其中YSP培養(yǎng)基最適合菌株TS1生長(zhǎng)，是菌株TS1生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基。

2. 4. 2 碳源對(duì)菌株TS1生長(zhǎng)速度的影響 由圖5可知，分別以麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖和淀粉作為YSP培養(yǎng)基的碳源，其余成分保持不變，所培養(yǎng)菌株TS1的OD600存在一定差異，其中麥芽糖為碳源時(shí)的OD600最高，為1.796，說(shuō)明麥芽糖是菌株TS1的最佳碳源。

2. 4. 3 氮源對(duì)菌株TS1生長(zhǎng)速度的影響 由圖6可知，分別以蛋白胨、酵母浸粉、氯化銨、硝酸銨和甘氨酸作為YSP培養(yǎng)基的氮源，其余成分保持不變，所培養(yǎng)菌株TS1的OD600存在一定差異，其中蛋白胨作為氮源時(shí)的OD600最高，為1.647，說(shuō)明蛋白胨為最佳氮源。

2. 4. 4 初始接菌量對(duì)菌株TS1生長(zhǎng)速度的影響 由圖7可知，不同初始接菌量下培養(yǎng)的菌株TS1的OD600相近，各處理間無(wú)顯著差異（P>0.05），其中接菌量為0.50%時(shí)OD600最大值，為1.821，說(shuō)明0.50%的初始接菌量為最佳接菌量。

2. 4. 5 裝液量對(duì)菌株TS1生長(zhǎng)速度的影響 由圖8可知，不同裝液量下培養(yǎng)的菌株TS1的OD600存在一定差異，其中，當(dāng)裝液量為30 mL時(shí)的OD600最高，為1.890，說(shuō)明30 mL為最佳裝液量。

2. 4. 6 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株TS1生長(zhǎng)速度的影響 由圖9可知，不同轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)的菌株TS1的OD600存在一定差異，當(dāng)轉(zhuǎn)速為210 r/min時(shí)菌株TS1的OD600達(dá)最大值，為1.740，說(shuō)明210 r/min為最佳轉(zhuǎn)速。

2. 4. 7 溫度對(duì)菌株TS1生長(zhǎng)速度的影響 由圖10可知，在20～46 ℃條件下菌株TS1均可生長(zhǎng)，但不同溫度下的OD600存在一定差異，其中42 ℃時(shí)菌株TS1的生長(zhǎng)最好，OD600達(dá)2.158，說(shuō)明42 ℃為最佳生長(zhǎng)溫度。

2. 4. 8 初始pH對(duì)菌株TS1生長(zhǎng)速度的影響 由圖11可知，不同pH條件下培養(yǎng)的菌株TS1的OD600存在一定差異。菌株TS1在pH 5～10時(shí)均可生長(zhǎng)，其中pH為9時(shí)菌株生長(zhǎng)情況最好，OD600可達(dá)1.790，說(shuō)明pH 9為最佳初始pH。

2. 4. 9 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株TS1生長(zhǎng)速度的影響 由圖12可知，不同培養(yǎng)時(shí)間下菌株TS1的生長(zhǎng)速度存在一定差異。剛開始培養(yǎng)時(shí)菌株TSI的OD600隨培養(yǎng)時(shí)間增加而逐漸上升，培養(yǎng)4 h后菌株的生長(zhǎng)速度加快，在48 h時(shí)達(dá)最大值，此時(shí)的OD600為1.960，繼續(xù)在搖床上培養(yǎng)，72～120 h時(shí)菌株的生長(zhǎng)速度開始減緩，呈現(xiàn)一個(gè)平穩(wěn)下降的趨勢(shì)，說(shuō)明48 h為最適發(fā)酵時(shí)間

2. 5 室內(nèi)盆栽防效試驗(yàn)結(jié)果

保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果（表8）顯示，噻呋酰胺處理的平均防效為66.67%，而用菌株TS1發(fā)酵液處理的防效也可達(dá)49.39%，二者間差異顯著；治療試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株TS1發(fā)酵液處理與噻呋酰胺處理的平均防效相當(dāng)，分別為62.97%和58.03%。

3 討論

芽孢桿菌具有耐高溫、抗紫外線、耐鹽等特性，同時(shí)與大多數(shù)根際促生細(xì)菌相似，可產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶類以及脂肽類抗生素，對(duì)真菌和一些細(xì)菌病原體具有拮抗活性，其代謝物可促進(jìn)植物生長(zhǎng)，并且通過(guò)影響根際微生物，觸發(fā)宿主的防御反應(yīng)提高植物的抗逆性，使其成為很好的生物防治劑（Wulff et al.，2002；李永麗等，2021；王蕊等，2021）。枯草芽孢桿菌屬于細(xì)菌，其作為芽孢桿菌的模式菌株，具有生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單以及產(chǎn)生耐高溫、具抗逆性的芽孢等特點(diǎn)，在生物防治應(yīng)用方面具有較大潛力（黃曦等，2010；何藝琴等，2019）。目前，具有拮抗作用的枯草芽孢桿菌通常從土壤或植物體內(nèi)分離獲得，少有從昆蟲體內(nèi)分離并應(yīng)用。而昆蟲的生命活動(dòng)與其體內(nèi)存在的微生物有著密切關(guān)系，二者相互依存，相互影響，對(duì)昆蟲體內(nèi)微生物的研究開發(fā)具有深遠(yuǎn)的意義（何明川等，2022）。

本研究對(duì)從黃粉甲分離到的1株枯草芽孢桿菌菌株TS1進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)齊整小核菌的平板抑制率可達(dá)68.03%。本研究采用單因素試驗(yàn)方法對(duì)其基礎(chǔ)培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明最佳培養(yǎng)基為YSP培養(yǎng)基，麥芽糖為最佳碳源，蛋白胨為其最佳氮源，其優(yōu)化培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、麥芽糖15.0 g/L；最佳發(fā)酵條件為裝液量30 mL、接菌量0.50%、轉(zhuǎn)速為210 r/min、培養(yǎng)溫度42 ℃、初始pH 9、培養(yǎng)時(shí)間48 h。將菌株TS1與金黎明等（2020）和夏俊芳等（2020）從土壤中分離得到的枯草芽孢桿菌21-1-2、T3，何明川等（2021）從美洲大蠊體內(nèi)分離得到的枯草芽孢桿菌MC4-2的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行比較，可發(fā)現(xiàn)除菌株TS1外其他3株菌株在pH的選擇上相似，集中在6～7，而菌株TS1的最適pH為9；轉(zhuǎn)速基本集中在180～210 r/min；菌株TS1與MC4-2在最適裝液量的選擇相同，而且二者對(duì)于氮源的選擇也相同。將菌株TS1與實(shí)驗(yàn)室保存的菌株枯草芽孢桿菌ZLSY-2的生理生化測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在尿素分解、葡萄糖發(fā)酵和H2S水解等方面存在差異，可能是不同菌株對(duì)尿素、葡萄糖和硫化氫的不同作用所致。

本研究探究了生防菌株TS1的揮發(fā)物和非揮發(fā)物對(duì)附子白絹病菌菌絲營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)及菌核產(chǎn)生情況的影響，結(jié)果表明，菌株TS1的揮發(fā)物和非揮發(fā)物可有效抑制齊整小核菌菌絲的生長(zhǎng)和菌核的形成。葉云峰等（2011）發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌B47可通過(guò)產(chǎn)生環(huán)狀脂肽iturin A進(jìn)而對(duì)多種病原真菌產(chǎn)生抑制作用；王雅等（2014）從柑橘葉片分離得到枯草芽孢桿菌Bv10，從該菌株的無(wú)菌發(fā)酵液中提取得到A、B兩種對(duì)芝麻白絹病具有較好抑制作用的活性物質(zhì)，經(jīng)鑒定，純化物A為脂肽化合物伊枯草菌素iturinA2，純化物B為iturinA4；李廣等（2022）發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌1151通過(guò)產(chǎn)生抗菌肽物質(zhì)降低辣椒軟腐病發(fā)病程度和病斑直徑，其抗菌肽類物質(zhì)可能包括AP01339（BHP）、AP00889（SP-B）、AP02860（Hb 98-114）、subtilosin A和Subtilosin Sbox等。綜上，菌株TS1也極有可能通過(guò)產(chǎn)生上述物質(zhì)從而抑制附子白絹病病原菌的生長(zhǎng)以及菌核的產(chǎn)生。

本研究對(duì)附子白絹病進(jìn)行了室內(nèi)盆栽防效測(cè)定，發(fā)現(xiàn)菌株TS1發(fā)酵液在保護(hù)試驗(yàn)中有49.39%的防效，在治療試驗(yàn)中可達(dá)到62.97%的防治效果。本研究結(jié)果與文毅（2010）用枯草芽孢桿菌B8對(duì)魚腥草白絹病和楊義等（2010）用枯草芽孢桿菌Bv22對(duì)茉莉花白絹病進(jìn)行室內(nèi)盆栽防效測(cè)定，20 d時(shí)分別達(dá)66.1%和56.8%的防效相似。綜上可以看出，同一種病原菌在不同作物上的發(fā)生情況不同，而且來(lái)源不同的枯草芽孢桿菌對(duì)齊整小核菌的影響效果也不盡相同。

本研究為枯草芽孢桿菌應(yīng)用于生物防治提供了更多的參考和依據(jù)，并豐富了昆蟲內(nèi)生細(xì)菌的研究，同時(shí)也表明菌株TS1存在較好的生防潛力，下一步可加強(qiáng)對(duì)該菌株的代謝產(chǎn)物、生防機(jī)制的研究。

4 結(jié)論

枯草芽孢桿菌菌株TS1對(duì)齊整小核菌具有較好的抑制作用，其最佳培養(yǎng)基為YSP，最佳碳源為麥芽糖，最佳氮源為蛋白胨；優(yōu)化培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、麥芽糖15.0 g/L；最佳發(fā)酵條件為裝液量30 mL、接種量0.50%、轉(zhuǎn)速210 r/min、培養(yǎng)溫度42 ℃、初始pH 9、培養(yǎng)時(shí)間48 h。優(yōu)化的發(fā)酵方案可用于快速、大批量培養(yǎng)菌株TS1菌懸液。室內(nèi)盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株TS1對(duì)附子白絹病有較好的防治效果，具有開發(fā)成附子白絹病生防菌的潛力。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）

收稿日期：2022-09-14

基金項(xiàng)目：四川省區(qū)域創(chuàng)新合作項(xiàng)目（2021YFQ0022）；云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（202105AC160037）

通訊作者：吳國(guó)星（1975-），https：//orcid.org/0000-0002-7308-2161，博士，教授，主要從事農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理研究工作，E-mail：wugx1@163.com

第一作者：施春蘭（1998-），https：//orcid.org/0000-0001-6914-1774，研究方向?yàn)樯镛r(nóng)藥開發(fā)與利用，E-mail：shiclan22@163.com