桑葉聯(lián)合二甲雙胍對2型糖尿病小鼠的糖脂代謝、炎癥及腸道微生物的影響

陸東裕，趙燕琳，金鵬，王倩，杜巖，湯道權*（.徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院睢寧分院藥劑科，江蘇 睢寧 00；.徐州醫(yī)科大學江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室，江蘇 徐州 004）

近年來，隨著人們飲食及生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病率逐年升高。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計，2021年全球約有5.37億人患有糖尿病，預計到2030年患糖尿病人數(shù)將增長到6.43億。2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）占糖尿病患者總數(shù)的90%以上，致病因素包括肥胖、缺乏鍛煉、高能量飲食和遺傳因素等，同時會引發(fā)心血管疾病、糖尿病腎病、糖尿病足、視網(wǎng)膜病變等一系列并發(fā)癥，給患者及其家庭帶來了巨大的壓力，給社會造成了極大的經(jīng)濟負擔。

二甲雙胍（metformin，MET）為臨床上用于治療糖尿病的主要口服降糖藥物，其主要通過減少肝臟葡萄糖的輸出和改善外周胰島素抵抗而降低血糖，是T2DM患者控制高血糖的一線用藥和藥物聯(lián)合中的基本用藥。長期服用MET可引起胃腸道反應、維生素B12水平下降及藥物抵抗，其對脂質代謝紊亂及炎癥的治療作用也有待確認，且無法阻止并發(fā)癥的發(fā)生。因此，MET與中藥聯(lián)合對T2DM及其并發(fā)癥的延緩或阻滯作用，已引起廣泛的注意。

桑葉是?？浦参锷５母稍锶~，具有疏散風熱、清肺潤燥、清肝明目的功效?！侗静菥V目》中首次記載了桑葉茶可用于“消渴癥”的治療?，F(xiàn)代藥理學研究同樣證實，桑葉可改善鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）及高脂飲食誘導的糖尿病大鼠及小鼠體內的血糖水平異常；降低糖尿病患者的血糖水平、改善其糖脂代謝異常[1-3]。

研究證實，桑葉茶和MET聯(lián)用可有效改善肺熱津傷證T2DM患者中醫(yī)證候評分及胰島素抵抗，抑制白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平，該聯(lián)合用藥效果可能與桑葉能延遲MET的體內消除時間有關[4]。大量研究表明，糖尿病與腸道菌群的種類與數(shù)量存在一定的關系[5]。因此，本文在前期實驗的基礎上，以STZ聯(lián)合高脂高糖（high fat and high sucrose，HFHS）飲食誘導的T2DM小鼠為對象，觀察桑葉水提物（mulberry leaf water extract，MLE）聯(lián)合MET對T2DM小鼠糖脂代謝、炎癥及腸道菌群的影響，以期從腸道微環(huán)境的角度揭示桑葉聯(lián)合MET改善T2DM的作用機制，并為臨床上兩者聯(lián)合應用治療T2DM提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 試藥

桑葉購自徐州廣濟連鎖藥店有限公司，經(jīng)徐州醫(yī)科大學季帥副教授鑒定為?？浦参锷＃∕orus albaL.）的干燥葉；MLE為本實驗室自制[1]；MET（純度≥ 98.5%；批號：A-32611906092）（江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司）；STZ（純度≥98%；批號：WXBD1402V）（美國Sigma公司）；Trizol總RNA提取試劑、PrimeScript RT Master Mix及TB Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒（日本Takara公司）；鼠源IL-6、IL-1β、IL-10、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及β-actin上下游引物（上海生工生物工程股份有限公司）；三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、谷丙轉氨酶（ALT）及谷草轉氨酶（AST）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；胰島素、C-肽、脂多糖（LPS）試劑盒（上海嵐派有限公司）；糞便DNA分離及純化試劑盒、DEAE瓊脂糖凝膠（德國默克公司）；高保真熱啟動酶試劑盒（美國KAPA Biosystems公司）；Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina（英國New England Biolabs公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

手持組織勻漿器（美國Biospec公司）；EA-11型血糖測試儀（長沙三諾生物傳感股份有限公司）；NanoDrop 1000核酸濃度測定儀（美國Thermo 公司）；PCR儀（美國AB公司）；酶標儀（Elx808，美國Bio Tek公司）；RT-PCR儀（瑞士Roche公司）。

1.3 實驗動物

4周齡雄性C57BL/6J小鼠，體重（20±2）g（上海斯萊克實驗動物有限責任公司），動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2008-0016。飼養(yǎng)于徐州醫(yī)科大學SPF級動物房，自由攝食和飲水，每2日更換一次飲水瓶，每3日更換一次墊料，室溫保持在（22±2）℃，相對濕度（55±10）%，12 h/12 h間隔照明。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥

C57BL/6J雄性小鼠適應性飼養(yǎng)7 d后，隨機分為正常組和模型組，正常組給予普通飼料，模型組給予HFHS飼料（含60%脂肪、20%蛋白質、20%碳水化合物），4周后測空腹血糖（FBG）。造模前所有小鼠均禁食不禁水12 h，模型組小鼠按90 mg·kg-1腹腔注射STZ的檸檬酸鹽緩沖液（0.1 mmol·L-1，pH 4.5），正常組注射同等體積的檸檬酸鹽緩沖液。STZ誘導7 d后，禁食過夜測血糖，F(xiàn)BG＞11.1 mmol·L-1的小鼠認為T2DM小鼠造模成功。T2DM小鼠按FBG水平隨機分為模型組（HFHS）、MLE組（MLE）、MET組（MET）、MLE聯(lián)合MET組（CMT）。MLE組按2 g/（kg·d）（以生藥含量計算）灌胃給予MLE；MET組按200 mg/（kg·d）灌胃給予MET；CMT組同時給予2 g/（kg·d）MLE及200 mg/（kg·d）MET；另取正常小鼠設為正常對照組（NC），NC組及HFHS組均同法給予等體積溶媒，連續(xù)8周。實驗周期內NC組給予普通飼料，其他組均給予HFHS飼料，每周記錄一次體重，各組小鼠均自由飲水。第12周進行胰島素耐受試驗（ITT），第13周收集小鼠糞便并進行口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）[1]。干預結束后處死小鼠，收集血液、肝臟、附睪脂肪，用于測定生化指標及計算肝臟及附睪脂肪指數(shù)（臟器重量/體重×100%）。

2.2 血液、肝臟、附睪脂肪、糞便的采集與處理

摘除小鼠眼球取血，室溫放置30 min后，3000 r·min-1離心15 min，收集血清并分裝，-80℃保存，用于后續(xù)的檢測。小鼠取血處死后，迅速摘取肝臟及附睪脂肪，用預冷的生理鹽水沖洗、濾紙擦干并稱重，于液氮中速冷后置-80℃保存，用于后續(xù)RT-PCR實驗。在無菌條件下收集到新鮮糞便樣本后，液氮速凍30 s，保存至-80℃冰箱。

2.3 血液生化指標的測定

按照試劑盒的操作步驟測定各組小鼠血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT和AST含量。采用血糖儀測定血清中FBG濃度；按照試劑盒的操作步驟，采用ELISA法測定小鼠血清中胰島素、C-肽及LPS的濃度。用胰島素抵抗穩(wěn)態(tài)模型（homeostatic model assessment for insulin resistance，HOMA-IR）計算胰島素抵抗指數(shù)，HOMA-IR＝空腹血糖水平（FPG，mmol·L-1）×空腹胰島素水平（FINS，μU·mL-1）/22.5。

2.4 RT-PCR檢測肝臟中炎癥因子mRNA的水平

各基因的上下游引物見表1。實驗結束后取小鼠肝臟組織，依試劑盒法提取總RNA、進行逆轉錄反應獲得cDNA。以上述cDNA為模板，將鼠來源的β-Actin、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10上下游引物稀釋到10 μmol·L-1，使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒法進行RT-PCR 反應，以β-Actin基因為內參，校正每個樣本目的基因的Ct值，以2-△△Ct值計算基因相對表達水平。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences used in the experiment

2.5 腸道菌群分析

取小鼠新鮮糞便，按試劑盒操作要求提取糞便細菌DNA；采用核酸濃度測定儀測定DNA濃度及純度；利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量后，合格的DNA采用16S rDNA片段V3和V4區(qū)通用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）進行擴增；采用2%瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)純化后根據(jù)Illumina MiSeq平臺標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構建PE 2×300的文庫，并進行測序。測得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、過濾后的有效數(shù)據(jù)，使用QIIME2軟件進行過濾，獲得最終的擴增序列變體（amplicon sequence variants，ASV）以及特征表。隨后，使用QIIME2軟件將得到的ASV與數(shù)據(jù)庫比對及α多樣性分析。結合環(huán)境因素進行Spearman相關性分析。

2.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 8軟件進行數(shù)據(jù)和繪圖處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s），兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，假設檢驗水準按α＝0.05判定，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 對體重、FBG周期性變化及臟器指數(shù)的影響

由圖1A～1D結果可知，給藥周期內，MET、MLE及兩者聯(lián)合用藥，均不顯著改變T2DM小鼠體重增加。MET及MLE單獨給藥均不能顯著改善T2DM小鼠的臟器指數(shù)改變，但兩者聯(lián)合用藥可明顯降低T2DM小鼠的肝臟指數(shù)（P＜0.05）。MET組、MLE組及CMT組小鼠的FBG水平從第6周開始下降，但差異無統(tǒng)計學意義，而實驗結束后上述干預組的小鼠FBG水平均顯著低于HFHS組（P＜0.01），但聯(lián)合用藥與單獨用藥之間無顯著性差異。

由圖1E～1H中可見，MET、MLE及兩者聯(lián)合，均可顯著降低T2DM小鼠的FBG、空腹胰島素、HOMA-IR指數(shù)及C-肽（P＜0.05或0.01），且聯(lián)合用藥組和單獨給藥組之間無明顯差異。OGTT及ITT的結果見圖1I～1J，由圖1可知，MLE單獨用藥及與MET聯(lián)合用藥，均可提高T2DM小鼠的口服葡萄糖耐受性及腹腔注射胰島素耐受性（P＜0.05或0.01），而MET單獨給藥則不能對抗HFHS飲食導致的葡萄糖及胰島素耐受。

3.2 對血脂、炎癥及肝功能的影響

由圖2A～2D可知，MLE單用及聯(lián)合用藥，均可顯著降低T2DM小鼠血清中TG、TC及LDL-C的水平（P＜0.05或0.01），MET單用僅可降低T2DM小鼠血清中LDL-C的水平（P＜0.05），且聯(lián)合用藥組與單獨用藥之間無明顯差異；而MET、MLE及兩者聯(lián)合，對T2DM小鼠血清中HDL-C均無明顯影響。

由圖2E～2G可知，MLE單用及聯(lián)合用藥，均顯著降低T2DM小鼠血清中LPS、ALT及AST水平（P＜0.05或0.01）；MET單用僅可降低T2DM小鼠血清中LPS水平（P＜0.05）；且聯(lián)合用藥和單獨用藥之間無顯著性差異。

由圖2H～2K可見，MLE單用可明顯降低T2DM小鼠肝臟中TNF-α和IL-1β的mRNA的表達，升高IL-10mRNA的表達（P＜0.05），但對IL-6mRNA表達無顯著影響；MET單用可明顯降低T2DM小鼠肝臟中TNF-α和IL-1β的mRNA的表達（P＜0.05或0.01），但對IL-6及IL-10mRNA表達無明顯影響；而兩者聯(lián)合用藥僅可降低T2DM小鼠肝臟中TNF-α和IL-6的mRNA表達（P＜0.05）。

3.3 對腸道微生物的影響

3.3.1α多樣性分析α多樣性分析用于反映各樣本的微生物群落豐富度和多樣性。常用的α多樣性分析包括Chao1、Pielou_e、Shannon和Simpson。其中Chao1用來估計樣本群落中包含的物種總數(shù)；Pielou_e是均勻度指數(shù)；Shannon指樣本中的分類總數(shù)及其占比；Simpson表征群落內物種分布的多樣性和均勻度。這些多樣性指數(shù)越大，代表群落多樣性越高，物種分布越均勻。由表2可知，NC組小鼠腸道微生物群落內物種分布較均勻，HFHS組小鼠糞便中微生物的物種均勻度較NC組減少。與HFHS組相比，MET組無明顯變化；MLE組小鼠糞便樣本中物種數(shù)目減少（P＜0.01）；CMT組小鼠糞便中微生物的物種總數(shù)、均勻度、分類總數(shù)及其占比均減少（P＜0.05）。

表2 小鼠糞便中腸道微生物多樣性(n＝8，±s)Tab 2 Alpha diversity indexes in fecal sample of mice (n＝8，±s)

表2 小鼠糞便中腸道微生物多樣性(n＝8，±s)Tab 2 Alpha diversity indexes in fecal sample of mice (n＝8，±s)

注：與NC組相比，*P＜0.05；與HFHS組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。Note：vs the NC group，*P＜0.05；vs the HFHS group，#P＜0.05，##P＜0.01.

組別Chao1Pielou_eShannonSimpson NC374.39±54.520.71±0.106.06±0.930.95±0.06 HFHS368.96±84.780.61±0.12*5.23±1.150.87±0.14 MLE281.74±48.67##0.58±0.074.72±0.620.88±0.05 MET343.88±71.130.56±0.094.67±0.880.84±0.09 CMT287.51±37.10#0.51±0.07#4.13±0.55#0.82±0.08

3.3.2 菌群群落結構分析 根據(jù)物種注釋結果，選取各樣本和各組在門及屬水平上相對豐度排名前10的物種，生成物種相對豐度柱形圖，結果如圖3所示。門水平上，各組糞便樣本中主要的門分類水平有：擬桿菌門（Bacteroidota）、厚壁菌門（Firmicutes）、脫硫桿菌門（Desulfobacterota）、疣微菌門（Verrucomicrobiota）和放線菌門（Actinobacteriota）為主要優(yōu)勢菌門。屬水平上，按所占比例依次為Muribaculaceae、棲糞桿菌屬（Faecalibaculum）、阿克曼菌（Akkermansia）、乳桿菌屬（Lactobacillus）等。

圖3 各組小鼠腸道微生物物種分布圖Fig 3 Microbial species distribution of mouse gut microbiota

3.3.3 組間物種差異分析 利用MetaStat方法對兩組間的物種豐度數(shù)據(jù)進行t檢驗得到P值，并根據(jù)P值篩選出具有組間顯著性差異的物種，門、屬水平的組間顯著性分析結果見圖4。門水平上，MET可明顯降低T2DM小鼠糞便中Bacteroidota的相對豐度、升高Proteobacteria的相對豐度（P＜0.05）；MLE可明顯降低Desulfobacterota的相對豐度（P＜0.05）；而兩者聯(lián)合不僅明顯影響上述三個細菌的豐度，還可明顯逆轉單用MET或MLE不能改變的Cyanobacteria、Deferribacterota、Firmicutes三種細菌的豐度改變（P＜0.05或0.01），且對Bacteroidota、Firmicutes相對豐度的改善作用明顯好于單用MET或MLE（P＜0.05或0.01）。屬水平上，MET干預可明顯降低T2DM小鼠糞便中Anaerovorax、Citrobacter、Clostridioides、Clostridium_methylpentosum、Gastranaerophilales、Peptococcus及Tuzzerella的相對豐度，升高Akkermansia及Parvibacter的相對豐度（P＜0.05或0.01）；MLE干預可明顯降低T2DM小鼠糞便中Acetatifactor、Anaerovorax、Bilophila、Citrobacter、Clostridium_methylpentosum、Colidextribacter、Eisenbergiella、Eubacterium_xylanophilum、GCA-900066575、Intestinimonas、Lachnospiraceae_FCS020、Lachnospiraceae_NK4A136、Oscillibacter、Peptococcus、Tuzzerella的相對豐度（P＜0.05或0.01）；而兩者聯(lián)合不僅可明顯改善T2DM小鼠糞便中上述細菌的相對豐度，還可影響Clostridia_vadinBB60、Eubacterium_siraeum、Harryflintia、Mucispirillum、Romboutsia等細菌的豐度改變，且對Akkermansia、Bilophila、Clostridioides、Colidextribacter、Eubacterium_siraeum、Gastranaerophilales、GCA-900066575、Intestinimonas、Lachnospiraceae_FCS020、Lachnospiraceae_NK4A136、Parvibacter、Peptococcus、Romboutsia、Tuzzerella的改善作用明顯好于單用MET或MLE（P＜0.05或0.01）。

圖4 小鼠腸道中門水平（A）及屬水平（B）上的差異微生物Fig 4 Differential microbiota at the phylum（A）and genus（B）level in the gut of mice

3.3.4 相關性分析 為了確定腸道微生物群的改變與宿主表型之間是否存在潛在關聯(lián)，本研究采用Spearman相關性分析探究屬水平的差異細菌與生化參數(shù)之間的相關性，結果如圖5所示。Acetatifactor、Anaerovorax、Bilophila、Clostridia_vadinBB60、Clostridium_methylpentosum、Clostridioides、Colidextribacter、Gastranaerophilales、GCA-900066575、Harryflintia、Intestinimonas、Oscillibacter、Peptococcus與FBG顯著正相關；Romboutsia與C-肽顯著正相關；Clostridia_vadinBB60、Gastranaerophilales、Romboutsia與TC顯著正相關；Colidextribacter、GCA-900066575、Harryflintia、Intestinimonas、Oscillibacter與TG顯著正相關；Clostridioides、Mucispirillum、Romboutsia與LDL-C顯著正相關，而Parvibacter與LDL-C顯著負相關；Anaerovorax、Clostridium_methylpentosum、GCA-900066575、Harryflintia、Intestinimonas、Oscillibacter、Peptococcus與HDL-C顯著正相關；Clostridium_methylpentosum與體重顯著負相關；Acetatifactor、Bilophila、Colidextribacter、Gastranaerophilales、Intestinimonas、Oscillibacter與IL-1β正相關；Clostridium_methylpentosum、Eubacterium_xylanophilum、GCA-900066575、Intestinimonas與IL-6正相關；Colidextribacter、Lachnospiraceae_NK4A136、Oscillibacter與IL-10正相關；Anaerovorax、Clostridium_methylpentosum、Colidextribacter、Eubacterium_xylanophilum、GCA-900066575、Intestinimonas、Oscillibacter與TNF-α正相關。

圖5 屬水平上的差異微生物與生化指標之間Spearman相關性分析熱圖Fig 5 Heatmap of Spearman correlation analysis between differential gut microbiota at genera level and biochemical indexes

4 討論與結論

T2DM已成為危害人類健康的重要社會問題，作為一線基礎降糖藥使用的MET，其對T2DM所伴隨的慢性炎癥、血脂代謝紊亂、肝功能損傷及其他并發(fā)病的防治作用尚未得到有效臨床驗證[4]，而桑葉含有生物堿、黃酮及酚酸類等成分[5-6]，對T2DM的血糖、血脂、氧化應激、炎癥等方面發(fā)揮多環(huán)節(jié)的調節(jié)作用[1-3，7]。據(jù)此，本研究從藥效互補或協(xié)同角度，對MLE和MET的聯(lián)合治療作用進行了評價，并從腸道微生物角度探討其潛在機制。

T2DM的典型病理特征包括血糖升高、胰島β細胞功能受損、胰島素抵抗、免疫功能低下等。持續(xù)高水平血糖可促進葡萄糖向脂肪轉化，進而引起脂質代謝紊亂及血清TG、TC、LDL-C水平的升高及HDL-C水平的降低，而高脂飲食誘發(fā)的肥胖或超重又可引發(fā)慢性低度炎癥，進而導致胰島素抵抗或T2DM。本研究發(fā)現(xiàn)MLE單用可降低T2DM小鼠血清中FBG、INS、C-肽、TG、TC、LDL-C的水平，改善T2DM小鼠的胰島素抵抗及對葡萄糖及胰島素的耐受能力，但對T2DM小鼠的體重、臟器指數(shù)及HDL-C血清水平無明顯影響；單用MET僅可改善T2DM小鼠血清中FBG、INS、C-肽、LDL-C的水平及胰島素抵抗；兩者合用不僅呈現(xiàn)出MLE及MET之間的互補效果，改善T2DM小鼠的上述指標，還可改善兩者單用均不能影響的T2DM小鼠的肝臟指數(shù)。炎癥可引發(fā)胰島素抵抗，并推動T2DM的發(fā)生發(fā)展，而高脂飲食所致脂肪堆積可提升促炎因子的水平，誘發(fā)炎癥及肝功能受損。LPS為革蘭氏陰性菌的細胞壁降解產(chǎn)物，可激活Toll樣受體4（TLR4）-髓樣分化因子（MyD88）-核因子κB（NF-κB）或者TLR4-MyD88-c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號通路，導致TNF-α、IL-1β、IL-6釋放增加。本研究發(fā)現(xiàn)，MLE單用可明顯降低T2DM小鼠血清LPS、AST、ALT水平及肝臟中TNF-α、IL-1β的表達，但對IL-6及IL-10的表達無影響；MET單用僅可降低T2DM小鼠血清LPS水平及肝臟TNF-α及IL-1β的表達；而兩者聯(lián)用，不僅呈現(xiàn)出了MLE與MET之間的互補作用，且可改善兩者均不能影響的IL-6的表達。上述結果提示，MLE與MET之間存在一定程度的互補和協(xié)同作用，可全面改善T2DM小鼠的炎癥、肝臟損傷、糖脂代謝異常。

越來越多的證據(jù)表明，腸道菌群失調所致細菌毒素、短鏈脂肪酸、膽汁酸、內源性大麻素類似物、碳水化合物、氨基酸等代謝產(chǎn)物水平變化與肥胖及T2DM的炎癥、胰島素抵抗、脂質代謝紊亂等密切相關[8]。肥胖及T2DM宿主的糞便中，通常呈現(xiàn)較高豐度的Firmicutes、Proteobacteria、Cyanobacteria及較低豐度的Bacteroidetes，而MET或桑葉干預可逆轉上述細菌的豐度[9-10]；本研究同樣發(fā)現(xiàn)T2DM小鼠糞便中Firmicutes、Cyanobacteria的豐度顯著增加，而Bacteroidetes的豐度顯著降低；但本研究還發(fā)現(xiàn)，T2DM小鼠糞便中Proteobacteria的豐度顯著降低，MET可進一步降低T2DM小鼠糞便中Bacteroidetes豐度的、增加Proteobacteria的豐度，MLE并不能顯著改善上述細菌門的豐度，推測可能與模型、MLE及MET用量不同有關；而MLE及MET的聯(lián)合使用可明顯對抗T2DM小鼠糞便中Firmicutes、Proteobacteria、Cyanobacteria的豐度增加及Bacteroidetes的豐度降低。另外，本研究尚發(fā)現(xiàn)，T2DM小鼠糞便中Deferribacterota及Desulfobacterota的豐度顯著增加，而MLE僅可降低Desulfobacterota的豐度，與MET聯(lián)合則可同時逆轉這兩個細菌門的豐度增加。

從屬水平看，既往研究表明，Acetatifactor及Bilophila與膽汁酸代謝異常密切相關，而Mucispirillum與炎癥密切相關，在肥胖或T2DM宿主糞便中呈現(xiàn)較高水平[11]；Parvibacter與血清LDL-C水平成負相關，Akkermansia與腸道通透性成負相關，均為有益菌，在肥胖宿主糞便中呈現(xiàn)較低豐度[12]；另外，Anaerovorax、Citrobacter、Colidextribacter、Clostridioides、Eisenbergiella、Eubacterium_siraeum、Gastranaerophilales、Intestinimonas、Lachnospiraceae_NK4A136、Oscillibacter、Peptococcus及Tuzzerella[4，10，13-18]在肥胖或T2DM宿主腸道中均呈現(xiàn)較高豐度，與本研究結果相同。然而，既往研究表明Clostridia_vadinBB60與FBG顯著負相關，Clostridium_methylpentosum及Eubacterium_xylanophilum為產(chǎn)短鏈脂肪酸菌，Romboutsia及Lachnospiraceae_FCS020為有益菌，在肥胖或T2DM宿主體內均呈現(xiàn)較低豐度[19]，而本研究的結果正好相反，推測這種矛盾的結果可能與模型動物、飲食不同有關。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)GCA-900066575及Harryflintia在T2DM小鼠糞便中呈現(xiàn)較高的豐度。藥物干預改變疾病狀態(tài)下細菌豐度，是其發(fā)揮作用的潛在機制之一。與以前研究一致的是[1，10，12]，本研究同樣發(fā)現(xiàn)MET可明顯改善T2DM小鼠糞便中Gastranaerophilales、Peptococcus、Akkermansia的豐度，而MLE可明顯改善Oscillibacter的豐度。本研究還發(fā)現(xiàn)，MET可明顯改善T2DM小鼠糞便中Anaerovorax、Citrobacter、Clostridium_methylpentosum、Clostridioides、Parvibacter及Tuzzerella的豐度；MLE可明顯改善T2DM小鼠糞便中Acetatifactor、Anaerovorax、Bilophila、Citrobacter、Clostridium_methylpentosum、Colidextribacter、Eisenbergiella、Eubacterium_xylanophilum、GCA-900066575、Intestinimonas、Lachnospiraceae_FCS020、Lachnospiraceae_NK4A136、Peptococcus及Tuzzerella的豐度；而兩者聯(lián)合不僅可明顯改善T2DM小鼠糞便中上述所有菌屬的豐度，且可明顯改善兩者均不能影響的Clostridia_vadinBB60、Eubacterium_siraeum、Harryflintia、Mucispirillum及Romboutsia等細菌的豐度。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MLE聯(lián)合MET可明顯改善T2DM小鼠體內的炎癥及糖脂代謝紊亂，這種改善作用與其調控腸道菌群失調密切相關，且MLE與MET之間呈現(xiàn)一定程度上的互補及協(xié)同作用。