尼可地爾鼻腔給藥制劑的處方前研究

楊蕾，彭俊文，谷福根*（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學藥學院，呼和浩特 010110；.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，呼和浩特 010050）

尼可地爾是一種新型硝酸酯類化合物，同時也是一種鉀離子通道開放劑，通過雙重機制改善心肌缺血，可用于冠心病及各類心絞痛治療[1-2]。與傳統(tǒng)硝酸類抗心肌缺血藥相比，它具有療效確切、不良反應少、耐受性好等特點，是目前臨床抗心肌缺血首選藥物之一[3]。尼可地爾現(xiàn)上市劑型有口服片劑與注射劑。前者吸收起效緩慢、生物利用度低，不適用于心絞痛的緊急治療，后者屬于侵入性給藥，會給患者帶來一定痛苦，且需協(xié)助用藥，用藥依從性差，此外，給藥前需要配藥、消毒等操作，易延誤疾病的治療。鼻腔給藥具有給藥方便、吸收起效快、生物利用度高等特點，作為快速治療重要手段，已成為部分鎮(zhèn)痛藥、退熱藥、癲癇與偏頭痛治療藥的理想給藥途徑而受到國內(nèi)外高度關注，也是目前制劑領域研究的熱點[4-5]。另外，尼可地爾熔點低、使用劑量小，且相對分子量低，這些性質均符合鼻腔給藥的基本要求。藥物溶解度、溶液化學穩(wěn)定性是制備溶液型鼻腔給藥必須要考慮的主要因素，而藥物油水分配系數(shù)的大小又與其經(jīng)鼻黏膜吸收難易程度密切相關[6]。鑒于尼可地爾在結構上屬于具有硝酸酯側鏈的煙酰胺類化合物，故pH值可能對其溶液化學穩(wěn)定性、油水分配系數(shù)及溶解度有重要影響；此外，為進一步改善藥物經(jīng)鼻黏膜吸收，鼻腔制劑處方中常需加入吸收促滲劑，因而有必要篩選尼可地爾經(jīng)鼻黏膜吸收的理想促滲劑?；谏鲜龇治觯疚膶⑼瓿赡峥傻貭柋乔唤o藥制劑的處方前研究工作，旨在為今后研制該藥物溶液型鼻腔給藥新制劑提供重要理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀（包括SPD-20A紫外-可見檢測器，日本島津公司）；TP-6智能透皮試驗儀（天津市鑫洲科技有限公司）；PHS-3C型pH計（上海儀電科學儀器有限公司）；AB265-S型電子分析天平（瑞士梅特勒·托利多公司）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Arioso UP 900型超純水器（韓國Human公司）；101型電熱鼓風干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）。

1.2 試藥

尼可地爾對照品（純度：99.5%，批號：k1710021，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；HP-β-CD（純度：98%，山東新大精細化工有限公司）；SBE-β-CD（純度：99%，山東新大生物科技有限公司）；DM-β-CD（純度：98%，山東濱洲智源生物科技有限公司）；正辛醇（AR，天津市化學試劑有限公司，批號：20200401）；生理鹽水（批號：2104153404，石家莊四藥有限公司）；水為雙蒸水，甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 尼可地爾含量測定方法建立

2.1.1 色譜條件[7]色譜柱：InertSustain C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（48∶52）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：254 nm；柱溫：36℃；進樣量：10 μL。

2.1.2 專屬性試驗 以50%甲醇溶液為溶劑，配制質量濃度為80 μg·mL-1的尼可地爾溶液。取上述尼可地爾溶液適當體積于10 mL具塞刻度試管中，分別以0.1 mol·L-1鹽酸溶液、0.01 mol·L-1氫氧化鈉溶液、0.5%過氧化氫溶液稀釋至刻度，搖勻，然后置于80℃恒溫條件下放置，分別于適當時間取樣，進樣分析，其中，以0.1 mol·L-1鹽酸溶液、0.01 mol·L-1氫氧化鈉溶液所制樣品，需在進樣前以相同濃度堿或酸溶液進行中和。結果見圖1，在該色譜條件下，尼可地爾與其降解產(chǎn)物能夠很好地分離，表明該分析方法專屬性強；此外，尼可地爾溶液在酸性及堿性條件下均不穩(wěn)定，但在強氧化條件下較穩(wěn)定。

2.1.3 標準曲線的制備 精密稱取尼可地爾對照品適量，以50%甲醇溶液為溶劑，制得質量濃度為500.0 μg·mL-1的尼可地爾儲備液。將上述尼可地爾儲備液，以50%甲醇稀釋不同倍數(shù)，分別制得質量濃度為 2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0 μg·mL-1的尼可地爾系列對照品溶液。進樣分析，記錄藥物色譜峰面積。以尼可地爾質量濃度（C，μg·mL-1）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標，求得回歸方程為：A＝3255.5C-1713.7（r＝0.9997），表明尼可地爾在2.5～80.0 μg·mL-1內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.1.4 精密度試驗 分別取5.0、20.0、60.0 μg·mL-1的尼可地爾對照品溶液，日內(nèi)重復測定5次，連續(xù)測定5 d，計算方法的日內(nèi)及日間RSD值。結果該方法的日內(nèi)RSD在0.23%～0.63%，日間RSD在0.60%～1.6%（n＝5），表明該方法的精密度良好。

2.1.5 回收試驗 配制5.0、20.0、60.0 μg·mL-1尼可地爾對照品溶液，每個濃度各5份，進樣分析，記錄尼可地爾峰面積，并根據(jù)隨行標準曲線方程，計算方法的回收率。結果低、中、高濃度尼可地爾的回收率分別為103.12%、96.72%、98.52%，RSD分別為0.92%、0.67%、0.39%，表明該方法的準確度較高。

2.1.6 檢測限與定量限 將標準曲線下尼可地爾最低濃度對照品溶液逐步稀釋，以信噪比S/N＝3時，藥物濃度作為方法的檢測限，以S/N＝10時，藥物濃度作為方法的定量限。結果該方法的檢測限為0.05 μg·mL-1，定量限為0.15 μg·mL-1。

2.2 尼可地爾溶液化學穩(wěn)定性研究

按照《中國藥典》2020年版四部中“緩沖液”項下方法，分別配制pH值為2.0、4.5、6.0、7.0、8.0、10.0、12.0的系列緩沖液。

精密稱取尼可地爾適量，加50%甲醇溶液溶解，制得質量濃度為1000.0 μg·mL-1的尼可地爾儲備液。取尼可地爾儲備液，加蒸餾水稀釋，制得質量濃度為80.0 μg·mL-1的尼可地爾溶液。取尼可地爾溶液1 mL置于10 mL試管中，分別加入上述不同pH值系列緩沖液至10 mL，搖勻，密封，于80℃恒溫條件下放置，分別于0、2、4、8 h取樣，放冷至室溫，進樣分析，測定反應液中尼可地爾的濃度并計算藥物降解百分率，結果見圖2?？梢?，尼可地爾溶液隨著介質pH的增加，其降解百分率總體呈現(xiàn)上升趨勢；且隨著加熱時間的延長，藥物的降解百分率也隨之增加。此外，在pH 2.0的強酸條件下藥物溶液的降解速度最慢，而pH值在4.5～8.0時藥物溶液的降解速度較pH 2.0時明顯增大，但在此pH值范圍內(nèi)，不同pH值下藥物降解速度基本相似，而尼可地爾溶液在pH 10.0及以上強堿性條件下，其降解速度顯著加快，化學穩(wěn)定性最差，如在pH值為12時，2 h內(nèi)藥物已基本降解完全。

圖2 尼可地爾溶液在不同pH條件下的降解曲線（n＝3）Fig 2 Degradation curves of nicorandil solution under different pH conditions（n＝3）

2.3 尼可地爾油水分配系數(shù)的測定

2.3.1 油水平衡時間測定 配制pH值分別為2.0、4.5、6.0、7.0、8.0、10.0、12.0的系列緩沖液作為水相，以經(jīng)過水飽和的正辛醇作為油相。

取質量濃度為1000 μg·mL-1的尼可地爾儲備液，分別加入不同pH值水相進行稀釋，制得質量濃度為32 μg·mL-1的尼可地爾系列水相溶液。取尼可地爾水相溶液10 mL，置于具塞錐形瓶中，加入相同體積油相，密塞，于25℃恒溫振蕩器中振蕩，分別于0、20、40、60、120、180 min在水相中取樣，再用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，進樣分析，測定水相中尼可地爾的濃度。實驗結果可見，當恒溫振搖120 min時，不同pH值水相中尼可地爾的濃度已達恒定，故將該藥物在油相、水相中分配平衡時間設為120 min。

2.3.2 油水分配系數(shù)的測定 將不同pH值藥物水相溶液與相同體積油相混合，在25℃恒溫振蕩器中振蕩120 min后，在水相中取樣，同法處理后進樣分析，測定不同pH值水相中藥物的濃度。根據(jù)公式：P＝（C0-Cw）/Cw，計算不同pH下藥物的油水分配系數(shù)P。式中，C0是水相中藥物初始濃度，Cw是分配平衡后水相中藥物濃度。結果測得，尼可地爾在正辛醇-水中的P值為2.31，而藥物在正辛醇/不同pH值緩沖液中尼可地爾的P值變化，見圖3?？梢姡峥傻貭柕腜值隨著pH值增大而呈波動式增加，在pH值為6.0時，P值出現(xiàn)一定程度下降，而后又逐漸增大。

圖3 尼可地爾的P值隨pH變化的曲線（n＝3）Fig 3 P change curve of nicorandil under various pHs（n＝3）

2.4 溶解度的考察[8]

分別取適當體積水、丙二醇、PEG400及pH值分別為2.0、4.5、6.0、8.0 磷酸鹽緩沖液，置于0.5 mL EP管中，均加入過量尼可地爾，超聲處理，觀察藥物溶解情況，直至藥物不再溶解。然后，將樣品置于25℃恒溫振蕩器中繼續(xù)振搖72 h，使藥物溶解達飽和狀態(tài)。將EP管以10 000 r·min-1離心10 min，取上清液以0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液以50%甲醇溶液稀釋適當倍數(shù)后，進樣分析，計算尼可地爾在不同溶劑中的溶解度，結果見表1?？梢姡趐H值2.0～8.0內(nèi)，尼可地爾的溶解度隨介質pH的增加而總體呈減小趨勢，而其在丙二醇中的溶解度與在水中的溶解度基本相似，在PEG400中的溶解度卻較小。

表1 尼可地爾在不同溶劑中的平衡溶解度(n＝3)Tab 1 Equilibrium solubility of nicorandil in different solvents(n＝3)

2.5 促滲劑的篩選

以鼻腔給藥制劑中使用廣泛、安全性高的3種β-CD水溶性衍生物DM-β-CD、HP-β-CD、SBE-β-CD為候選促滲劑[9]，篩選尼可地爾鼻用制劑的最佳促滲劑。

取新宰殺羊鼻黏膜，采用Franz立式擴散池法，完成藥物滲透性試驗。試驗時，將鼻黏膜剪成適宜大小，固定于擴散池接口處，黏膜側朝向供給池，以生理鹽水為接收液，在供給池內(nèi)加0.1%尼可地爾供試液1.0 mL，內(nèi)含5%β-CD水溶性衍生物，水浴溫度設為34℃，攪拌速率為300 r·min-1，分別于20、40、60、90、120、180 min，從接收池中取樣1.0 mL，并立即補充同體積等溫生理鹽水。按“2.1.1”項下色譜條件，測定樣品中尼可地爾的濃度。樣品中尼可地爾的定量方程為：A＝2883.9C+2199（r＝0.9999），尼可地爾在0.2～80.0 μg·mL-1與峰面積呈良好線性關系。方法的日內(nèi)精密度在0.18%～0.72%，日間精密度在0.41%～2.3%（n＝5）。

依據(jù)藥物累積滲透量（Qn，μg·cm-2）計算公式[10]：計算不同時間尼可地爾的累積滲透量。式中，V0為接收液體積，Cn為第n個取樣點的藥物濃度，Vi為第i次取樣體積，Ci為第i次取樣接收液中藥物濃度，A為有效透皮面積，以Qn對時間t作圖，繪制尼可地爾經(jīng)鼻黏膜的滲透曲線，結果見圖4?？梢姡?%SBE-β-CD對尼可地爾經(jīng)鼻黏膜吸收的促滲作用最強，5%HP-β-CD的促滲作用次之，而5%DM-β-CD卻抑制藥物的鼻黏膜滲透。

圖4 不同促滲劑對尼可地爾經(jīng)離體羊鼻黏膜滲透量的影響（n＝3）Fig 4 Effect of different absorption enhancers on the permeation amount of nicorandil via in vitro sheep nasal mucosa（n＝3）

因此，確定了SBE-β-CD為最佳促滲劑，進一步考察其濃度對促滲效果的影響，方法同前。分別考察了1.0%、3.0%、5.0%、7.0% SBE-β-CD對尼可地爾的促滲作用，結果見圖5?？梢?，當SBE-β-CD 濃度較低時，隨著濃度的增加，其促滲作用隨之增加，當濃度為5.0%時，其促滲效果達到最大，此后，隨著濃度增加，其促滲作用下降。因此，5.0%SBE-β-CD作為尼可地爾鼻腔給藥制劑的最佳促滲劑。

圖5 SBE-β-CD濃度對尼可地爾經(jīng)離體羊鼻黏膜滲透的影響（n＝3）Fig 5 Effect of SBE-β-CD concentrations on permeation amount of nicorandil via in vitro sheep nasal mucosa（n＝3）

3 討論

本文首先建立了HPLC法測定尼可地爾含量的方法，該方法專屬性強、操作簡單、線性范圍大、精密度與準確度良好。因尼可地爾結構上屬于硝酸酯類化合物，具有易水解的特性，其溶液化學穩(wěn)定性易受介質pH的影響。尼可地爾溶液穩(wěn)定性研究結果顯示，藥物溶液在強酸性pH條件下穩(wěn)定性最好，在弱酸性與中性pH下穩(wěn)定性次之，而在強堿性pH下穩(wěn)定性最差，這是由于在堿性條件下，尼可地爾易發(fā)生專屬性堿催化水解反應，生成降解產(chǎn)物N-（2-羥乙基）-煙酰胺的緣故，該結果與文獻報道基本一致[11-12]。

有研究證實，當藥物油水分配系數(shù)為-1＜logP＜2，在此范圍內(nèi)藥物通過被動擴散較易透過細胞膜[13]。本文測定結果顯示，在pH 4.5～12內(nèi)，尼可地爾的P值在2.2～4.5，其logP大致在0.33～0.65，在正辛醇-水中的logP為0.36，均處于藥物最佳吸收范圍內(nèi)，預期經(jīng)鼻腔黏膜較易吸收。尼可地爾的P值隨pH值增大而呈波動式增加，其原因可能是由于其結構上同時含有酰胺基與吡啶環(huán)，使藥物總體呈現(xiàn)弱堿性，導致其P值隨pH值的變化不同于一般弱堿的變化規(guī)律[14-15]。

其次，本文采用飽和溶液法測定了尼可地爾溶解度，發(fā)現(xiàn)在強酸性pH條件下，該藥物的溶解度最大，隨著介質pH值增大，藥物溶解度總體呈逐漸下降趨勢，這可能是由于尼可地爾屬于弱堿性化合物，在強酸性pH值下，有部分藥物發(fā)生解離，以離子形式存在，從而增加藥物的溶解度，而隨著介質pH值逐漸增加，絕大部分藥物以分子形式存在，故溶解度明顯降低。此外，還發(fā)現(xiàn)尼可地爾在丙二醇中的溶解度與其在水中相似，均遠大于在PEG400中的溶解度。鑒于尼可地爾上市口服片劑的規(guī)格為5 mg，而人單側鼻孔每次給藥體積范圍應為100～200 μL[16]，本文測得該藥物在常溫下水中的溶解度大于70 mg·mL-1，完全可滿足制備溶液型鼻用制劑要求，因此，可考慮以水作為制備尼可地爾鼻腔制劑的理想溶劑。

最后，離體鼻黏膜滲透性試驗結果發(fā)現(xiàn)，候選的3種促滲劑中，HP-β-CD與SBE-β-CD均可明顯促進尼可地爾的經(jīng)鼻黏膜吸收，但后者促滲效果更好；相反，DM-β-CD則表現(xiàn)為明顯抑制該藥物經(jīng)鼻黏膜的滲透作用，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因尚不明確，可能與β-CD母體結構上取代基的不同有關。此外發(fā)現(xiàn)，不同濃度SBE-β-CD的促滲作用大小順序為：5.0%SBE-β-CD＞7.0%SBE-β-CD≈3%SBE-β-CD＞1.0%SBE-β-CD，表明SBEβ-CD對尼可地爾的促滲效果具有一定程度的濃度依賴性：在低濃度時，促滲作用隨其濃度增加而增強，當濃度達到5%時，其促滲效果最大，進一步提高SBE-β-CD的濃度，其促滲作用不再增加，這一現(xiàn)象與文獻報道結果類似[17]。

人體鼻腔正常生理pH值范圍為5.5～6.5，平均值為6.4[18]，綜合考慮尼可地爾溶液化學穩(wěn)定性、油水分配系數(shù)、溶解度和對鼻黏膜可能產(chǎn)生的刺激性，制備該藥物鼻腔制劑的pH值應控制在6.0～6.5為宜，而其最佳促滲劑為5.0%SBE-β-CD。后續(xù)將通過體內(nèi)藥動學研究來驗證制劑在體內(nèi)吸收以及生物利用度情況。