酸棗仁中黃酮類成分的研究進(jìn)展

李寶劍，楊遠(yuǎn)貴*，宋忠興，唐志書，2*（.陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心/秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點實驗室（培育），陜西 咸陽 72083；2.中國中醫(yī)科學(xué)院，北京 00700）

酸棗仁為鼠李科棗屬植物酸棗的干燥成熟種子，有生、炒兩種用法，主要分布在我國陜西、山西、河北等地[1]?！侗静菥V目》記載：“棗仁，味酸性收，故主肝病，寒熱結(jié)氣，酸痹久泄，臍下滿痛之癥。”研究發(fā)現(xiàn)，酸棗仁成分多達(dá)130余種，包括黃酮類、皂苷類、生物堿類、脂肪酸類等，具有鎮(zhèn)靜安眠、抗抑郁、抗氧化、抗炎、改善學(xué)習(xí)記憶等藥理作用[2]。臨床廣泛應(yīng)用于酸棗仁湯、歸脾湯、天王補(bǔ)心湯、棗仁安神顆粒、天王補(bǔ)心丸、柏子養(yǎng)心丸等中成藥。

酸棗仁總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.94%，是酸棗仁的主要活性成分之一，其結(jié)構(gòu)主要有黃酮、二氫黃酮、黃酮醇和異黃酮等。黃酮是廣泛存在于自然界、種類繁多且具有廣泛生物活性的成分，是中藥中一類重要的有效成分[3]。研究表明，酸棗仁中黃酮類成分具有鎮(zhèn)靜安眠、抗焦慮、抗氧化、改善記憶障礙、保護(hù)心臟等生物活性[4]。近年來，已有酸棗仁化學(xué)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)、分析方法和生物活性的相關(guān)報道，本文通過對酸棗仁中黃酮類成分化學(xué)結(jié)構(gòu)、提取方法、分析方法和生物活性進(jìn)行歸納，以期為其開發(fā)利用提供參考。

1 酸棗仁中的黃酮類成分

黃酮類化合物是一種多酚類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣，但總體骨架由15個碳原子（C6-C3-C6）組成A、B環(huán)，通過雜環(huán)吡喃環(huán)連接[5]。截至目前，共從酸棗仁中發(fā)現(xiàn)報道了44個黃酮類成分（見表1和圖1），其中黃酮31個（化合物1～31），黃酮醇8個（化合物32～39），二氫黃酮2個（化合物40～41），異黃酮3個（化合物42～44）[6-26]。這些黃酮類成分大多以黃酮苷的形式存在，主要為碳苷和氧苷，此外，還有少量氮苷。葡萄糖主要與黃酮類成分中3位和7位羥基脫水縮合成氧苷，與3位、6位和8位碳脫水縮合成碳苷。研究發(fā)現(xiàn)，B環(huán)中的羥基結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)活性氧（ROS）和活性氮（RNS）清除，發(fā)揮抗氧化作用[27]。此外，黃酮的特殊結(jié)構(gòu)還可以減少高度氧化的自由基，從而減少ROS形成，減少氧化應(yīng)激反應(yīng)。這一特性使其成為有效的過氧自由基、超氧化物和過氧亞硝酸根自由基清除劑，并進(jìn)一步發(fā)揮多方面疾病的藥理活性[5]。

表1 酸棗仁中黃酮類成分Tab 1 Composition of flavonoids in Ziziphi Spinosae Semen

圖1 酸棗仁中黃酮類成分化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Chemical structures of the flavonoids in Ziziphi Spinosae Semen

2 酸棗仁中黃酮類成分的提取方法

高效的提取方式，對酸棗仁化學(xué)成分及其藥理作用的研究具有重要意義。目前酸棗仁中黃酮類成分的提取方法主要有浸提法、加熱回流法、超聲波輔助提取法、酶提法和其他提取方法（見表2）[28-46]。

表2 不同方法提取酸棗仁中黃酮類成分的工藝參數(shù)Tab 2 Process parameters for extracting flavonoids from Ziziphi Spinosae Semen using different methods

浸提法和加熱回流法作為酸棗仁中黃酮類成分傳統(tǒng)提取方法，研究多采用單因素法與正交試驗或與響應(yīng)面法相結(jié)合，以酸棗仁中總黃酮提取率為指標(biāo)，對其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。研究發(fā)現(xiàn)，影響加熱回流提取工藝時的因素作用大小的順序為：醇濃度＞提取時間＞回流次數(shù)＞加醇量[33]。

超聲波輔助提取法是指中藥材被提取溶劑浸潤和滲透，使有效成分析出并溶解于提取溶劑，通過組織細(xì)胞內(nèi)外的濃度差和滲透壓差進(jìn)行擴(kuò)散，進(jìn)一步得到浸提液的一種提取方法，具有節(jié)能、高效等優(yōu)點[47]。近年來有學(xué)者采用響應(yīng)面法對提取酸棗仁中黃酮類物質(zhì)的方法進(jìn)行了優(yōu)化，進(jìn)一步提高了提取效率[36-37，39-42]。采用正交試驗優(yōu)化超聲輔助提取時，發(fā)現(xiàn)各因素作用大小的順序為：液固比＞乙醇濃度＞提取時間＞提取溫度＞功率[38]。

酶提取法是指通過酶類物質(zhì)破壞植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)使其有效成分從細(xì)胞質(zhì)中溶解分離出來的一種提取方法，常用的酶主要有纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等。近些年關(guān)于酸棗仁中黃酮類成分提取工藝研究發(fā)現(xiàn)，采用纖維素酶和復(fù)合酶作為提取用酶，在復(fù)合酶的工藝改進(jìn)研究中，其提取率相比于水提法效率提高了54.67%[46]。酶提法具有高效、環(huán)保、便利等優(yōu)點，具有較大的開發(fā)潛力。

酸棗仁中黃酮類成分提取方法研究較多，其中浸提法和加熱回流法中影響提取率的因素主要是溶劑的濃度、料液比、提取時間、提取次數(shù)等；超聲波輔助提取法縮短了提取時間，相比于加熱回流更節(jié)能環(huán)保，其提取率主要受超聲功率、溶劑濃度、提取時間、料液比影響；酶提法提取率主要受酶的種類、pH值、提取時間等影響。在酸棗仁中黃酮類成分提取工藝改進(jìn)中，超聲波輔助提取法應(yīng)用最為廣泛，提取率高且適合進(jìn)一步大規(guī)模應(yīng)用于工業(yè)化提取，可進(jìn)一步對其在酸棗仁中黃酮類成分的提取工藝優(yōu)化進(jìn)行深入研究，為工業(yè)化提取和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供便利。

3 酸棗仁中黃酮類成分的分析方法

酸棗仁中黃酮類成分的分析測定已有較多相關(guān)研究，主要方法有紫外分光光度法、高效液相色譜法和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等。本文對幾種方法進(jìn)行總結(jié)歸納（見表3）[29，48-64]。

表3 酸棗仁中黃酮類成分的不同分析方法Tab 3 Different methods for the analysis of flavonoids in Ziziphi Spinosae Semen

3.1 紫外分光光度法

紫外分光光度法是常用的一種分析方法，具有應(yīng)用廣泛、靈敏度高、選擇性好、準(zhǔn)確度高、適用濃度范圍廣、分析成本低、操作簡便且快速等優(yōu)點[65]。此方法已廣泛應(yīng)用于酸棗仁中總黃酮的分析定量，為提取工藝改進(jìn)提供了依據(jù)[29，48-50]。由于紫外分光光度法無法對單一的黃酮類化合物含量進(jìn)行檢測，因此限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。

3.2 HPLC法

HPLC法是一種重要的定性定量分析方法，具有高速、高效、高靈敏度、應(yīng)用范圍廣、樣品量少等優(yōu)點[66]。楊旭等[67]建立了酸棗仁黃酮的HPLC指紋圖譜，并鑒定出其中的8個特征峰成分為維采寧-Ⅱ、牡荊素葡萄糖苷、異斯皮諾素、斯皮諾素、6'''-pyridyloylspinosin、6'''-對羥基苯甲酰斯皮諾素、6'''-阿魏酰斯皮諾素、6'''-對香豆酰斯皮諾素。此外，HPLC也應(yīng)用于酸棗仁中藥復(fù)方的含量測定，其中以斯皮諾素和6'''-阿魏酰斯皮諾素含量為代表，HPLC在相關(guān)成分的體內(nèi)代謝分布研究方面也取得了很大進(jìn)展，為臨床用藥提供了理論支持[51-53]。HPLC在酸棗仁中黃酮類成分分析中發(fā)揮著重要作用，并在藥動學(xué)研究中可高效快速地對目標(biāo)成分進(jìn)行定性定量分析。

3.3 SFC法

SFC法是以超臨界流體作為流動相的一種色譜方法，具有高效、經(jīng)濟(jì)環(huán)保、黏度低、流動速度快等優(yōu)點，相比于HPLC、SFC柱效更高，分離時間更短，效率更高[68]。酸棗仁中黃酮類成分槲皮素、異槲皮苷等也有一些采用SFC分析的少量報道。作為一種新興分析方法，在酸棗仁中黃酮類成分的分析中應(yīng)用較少，但此方法因為其節(jié)能高效的優(yōu)點，可作為酸棗仁黃酮類成分分離分析的重要工具。

3.4 LC-MS法

LC-MS具有進(jìn)樣量少、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點，此外，該方法結(jié)合了色譜分離能力強(qiáng)和質(zhì)譜定性能力強(qiáng)的優(yōu)點，可準(zhǔn)確測定分子量，確定分子式，對化合物的結(jié)構(gòu)鑒定至關(guān)重要[69]。

酸棗仁中黃酮類成分多，單一成分含量較少。質(zhì)譜具有高靈敏度，可以對酸棗仁中含量低的黃酮類成分進(jìn)行準(zhǔn)確定性定量分析，并分析出結(jié)構(gòu)信息等，提高分析效率[70]。在液質(zhì)聯(lián)用法研究中，建立了UPLC/ESI-Q-Orbitrap、HPLC-MS、HPLC-ESI-MS/MS、HPLC-DAD等多種方法[61-68]。LC-MS法因高效、準(zhǔn)確的優(yōu)點，將逐漸成為酸棗仁中黃酮類成分分析的主要方法。

4 酸棗仁中黃酮類成分的生物活性

酸棗仁中黃酮類成分具有鎮(zhèn)靜安眠、抗焦慮、抗氧化、改善記憶、保護(hù)心臟、抗腫瘤等多種生物活性，相關(guān)作用機(jī)制方面研究也取得很大進(jìn)展，對酸棗仁中黃酮類成分的藥用價值提供了充分的理論支持。

4.1 鎮(zhèn)靜安眠、抗抑郁

鎮(zhèn)靜安眠、抗抑郁是酸棗仁在傳統(tǒng)中醫(yī)應(yīng)用中最主要的功效。關(guān)于失眠和抑郁的發(fā)病機(jī)制目前主要有以下幾種假說：單胺類及其受體假說、神經(jīng)內(nèi)分泌假說、神經(jīng)元損傷假說和細(xì)胞分子機(jī)制假說等，其中“神經(jīng)遞質(zhì)假說”得到研究者的普遍認(rèn)可[71]。研究發(fā)現(xiàn)，酸棗仁中黃酮類成分主要通過調(diào)節(jié)5-羥色氨（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）、γ-氨基丁酸（GABA）三種神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮鎮(zhèn)靜安眠、抗抑郁的藥理作用[72]。Zhang等[73]研究發(fā)現(xiàn)，斯皮諾素可能通過下調(diào)C-Fos表達(dá)，從而降低神經(jīng)元放電發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠的生物活性。研究發(fā)現(xiàn)，酸棗仁總黃酮可以下調(diào)谷氨酸（GLU）、上調(diào)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）發(fā)揮解郁安神的藥理活性[55]。此外，Jiang等[74]研究發(fā)現(xiàn)，酸棗仁中黃酮的鎮(zhèn)靜安眠能力弱于酸棗仁皂苷，酸棗仁多糖無鎮(zhèn)靜安眠作用。

4.2 抗氧化

氧化應(yīng)激是指在正常生理狀態(tài)下，機(jī)體氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡[75]。相關(guān)研究得出酸棗仁中黃酮類成分如斯皮諾素、當(dāng)藥黃素、異牡荊素、6'''-阿魏酰斯皮諾素等具有顯著的抗氧化活性[5]，其主要是通過清除和減少自由基產(chǎn)生，可進(jìn)一步應(yīng)用于藥品和護(hù)膚品中。薛曉芳等[76]對酸棗不同部位的抗氧化活性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，酸棗仁中黃酮成分抗氧化能力最強(qiáng)，其他部位抗氧化能力依次是：葉片＞果皮＞花＞果實＞果肉。

4.3 改善記憶

記憶障礙是一種發(fā)生于中樞神經(jīng)的退行性疾病，以阿爾茨海默病為代表。相關(guān)的發(fā)病機(jī)制主要有以下幾種假說：細(xì)胞凋亡假說、神經(jīng)突觸假說、膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)假說、氧化應(yīng)激損傷假說[77]。

研究發(fā)現(xiàn)，該類成分對由β-淀粉樣蛋白（Aβ）誘導(dǎo)的記憶障礙具有明顯改善作用，這可能是通過上調(diào)海馬組織中磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、細(xì)胞環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（CREB）和BDNF水平發(fā)揮改善認(rèn)知功能障礙的作用[78]。研究發(fā)現(xiàn)，斯皮諾素可能是通過激活核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子（Nrf2），上調(diào)血紅素加氧酶1（HO-1）表達(dá)，抑制ROS產(chǎn)生，進(jìn)而減少β-淀粉樣蛋白-42（Aβ1-42）產(chǎn)生和聚集發(fā)揮改善記憶的藥理作用[79]。總之，酸棗仁中黃酮類成分對認(rèn)知障礙的改善功能顯著，研究其作用機(jī)制，可為阿爾茨海默病等記憶疾病的藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

4.4 保護(hù)心臟

心臟疾病是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一，已經(jīng)成為全球的主要公共衛(wèi)生問題。研究顯示，斯皮諾素和6'''-阿魏酰斯皮諾素可減少心肌酶釋放和細(xì)胞凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞急性心臟缺血再灌注損傷[80]。任靜娜等[81]研究發(fā)現(xiàn)，異牡荊素可以降低大鼠心室肌細(xì)胞瞬時外向鉀電流，對急性心肌梗死、心律失常等疾病具有很好的心臟保護(hù)功能。研究發(fā)現(xiàn)，酸棗仁中的斯皮諾素和6'''-阿魏酰斯皮諾素對心臟保護(hù)的作用機(jī)制可能與其降低糖原合成酶激酶3β（GSK3β）在Tyr216處的磷酸化有關(guān)，從而發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞的活性[82]。

4.5 抗腫瘤

癌癥已經(jīng)成為威脅人類生命的頭號殺手，在我國以肺癌、胃癌、腸癌等為主要代表的相關(guān)腫瘤發(fā)病率逐年升高。研究發(fā)現(xiàn)，異牡荊素具有抗非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的活性，其可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來抑制NSCLC細(xì)胞活性和自我更新，促進(jìn)其凋亡[83]。異牡荊素還可以抑制癌癥干細(xì)胞并誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，可能是通過抑制腫瘤細(xì)胞存活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實現(xiàn)的[84]。Cao等[85]研究發(fā)現(xiàn)，酸棗仁中黃酮類成分可以通過抑制錳超氧化物歧化酶（MnSOD）和FoxM1的表達(dá)，從而降低肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞（HCSLC）的致癌性，并且顯著抑制攜帶HCSLC裸鼠的腫瘤生長。以上研究表明酸棗仁中黃酮類成分具有顯著抗腫瘤活性，對其作用機(jī)制的深入研究可為抗腫瘤藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

4.6 其他方面

近年來酸棗仁中黃酮類成分在其他方面的生理活性也有研究，如抑制黑色素、減輕糖尿病腎損傷、減緩骨質(zhì)疏松、保肝等。研究發(fā)現(xiàn)，6'''-阿魏酰斯皮諾素可以抑制小眼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）和酪氨酸酶表達(dá)、抑制總MITF磷酸化的MITF蛋白表達(dá)和抑制環(huán)磷酸腺苷（cAMP）介導(dǎo)的CREB磷酸化，通過cAMP-CREB-MITF軸轉(zhuǎn)導(dǎo)從而抑制黑色素生成[86]。有研究表明，斯皮諾素在細(xì)胞和人類皮膚模型中都具有抑制黑色素的生物活性，其作用機(jī)制可能是通過與酪氨酸酶結(jié)合并競爭性抑制[87]。高群等[88]研究發(fā)現(xiàn)，酸棗仁黃酮可通過調(diào)節(jié)腎組織氧化應(yīng)激與抗氧化系統(tǒng)的平衡失調(diào)，抑制腎細(xì)胞凋亡而減輕糖尿病大鼠的腎損傷，從而延緩糖尿病腎病進(jìn)展。肖鳳琴等[89]通過對全氟辛烷磺酸（PFOS）誘導(dǎo)的氧化性肝損傷小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，酸棗仁黃酮通過上調(diào)小鼠肝組織中Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平，發(fā)揮其保肝的藥理活性。

5 結(jié)語

酸棗仁在中醫(yī)中應(yīng)用十分廣泛，黃酮作為其主要活性成分，具有鎮(zhèn)靜安眠抗抑郁、改善記憶、抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)心臟等多種藥理活性，在藥物、保健品、食品等領(lǐng)域的開發(fā)和研究都具有巨大潛力。盡管對于酸棗仁中黃酮類成分的提取工藝、分析方法、化學(xué)結(jié)構(gòu)及生物活性方面研究較多，但在酸棗仁中黃酮類成分的劑型開發(fā)、藥動學(xué)、生物化學(xué)合成等方面研究還不夠深入。由于酸棗仁中黃酮類成分多樣，發(fā)揮生物活性的成分復(fù)雜，可能是多種成分共同發(fā)揮某一種生物活性，也可能是一種成分發(fā)揮多種生物活性，因此，有必要對其成分和生物活性之間相互關(guān)系進(jìn)行研究。