ALK5小分子抑制劑生物活性研究進(jìn)展

李倩倩，薛曉文，2*（.中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京 200；2.中國(guó)藥科大學(xué)藥物化學(xué)教研室，南京 200）

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是一種多功能細(xì)胞因子，廣泛存在于哺乳動(dòng)物的組織細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，自20世紀(jì)70年代末被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了33個(gè)該家族成員配體，包括TGF-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、激活素、抗繆勒式管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）、生長(zhǎng)分化因子（growth and differentiation factors，GDF）和結(jié)節(jié)素（nodal）等。這些配體具有相似的結(jié)構(gòu)，并共享信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本機(jī)制，在生物體生殖細(xì)胞、胚胎和各種組織或器官中廣泛表達(dá)，與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)分化、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）重塑、衰老和細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞行為密切相關(guān)[1]。TGF-β配體通過(guò)與細(xì)胞膜表面的特異性受體（即TGF-β受體）結(jié)合才能發(fā)揮生理效應(yīng)。ALK5為T(mén)GF-βⅠ型受體中研究最為廣泛的一個(gè)亞型，抑制該亞型可以產(chǎn)生抗腫瘤等作用。本文在介紹TGF-β、相應(yīng)受體及相關(guān)信號(hào)通路的基礎(chǔ)上，對(duì)近年來(lái)報(bào)道的ALK5抑制劑的各種生物活性進(jìn)行梳理，希望為今后的ALK5抑制劑研究提供有益參考。

1 TGF-β、TGF-β受體及相關(guān)信號(hào)通路

TGF-β是一種由兩個(gè)含有112個(gè)氨基酸的單體通過(guò)二硫鍵連接的蛋白質(zhì)，目前已發(fā)現(xiàn)6種亞型，其中TGF-β1（占90%以上，活性最強(qiáng)）、TGF-β2 和TGF-β3 3種亞型常見(jiàn)于哺乳動(dòng)物體內(nèi)，它們能夠通過(guò)與TGF-βⅠ型受體（TβRⅠ，也稱(chēng)為作為激活素受體樣激酶，ALK）和Ⅱ型受體（TβRⅢ）這兩種類(lèi)型的跨膜受體的結(jié)合來(lái)觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)[2-3]。目前，已經(jīng)鑒定出7個(gè)TβRⅠ亞型（ALK1～ALK7）和5個(gè)TβRⅡ亞型，這兩種受體在所有細(xì)胞中均能表達(dá)，它們可以與相應(yīng)的TGF-β超家族成員形成特定的異性復(fù)合物進(jìn)行信號(hào)傳遞，從而發(fā)揮相應(yīng)的細(xì)胞功能。初始合成的TGF-β是以非活性前體的形式存在（即潛伏期TGF-β），需要通過(guò)潛伏TGF-β結(jié)合蛋白（latent TGF-βbinding protein，LTBP）和潛伏期相關(guān)肽（latency-associated peptide，LAP）組成的復(fù)合物激活后才能發(fā)揮相應(yīng)的生物效應(yīng)[4]。激活后的TGF-β首先與TβR Ⅱ結(jié)合進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，將ALK5募集到高度保守的富含Gly-Ser的近膜區(qū)域（GS區(qū)）使其發(fā)生構(gòu)象調(diào)節(jié)并激活[5]。然后，被激活的ALK5將信號(hào)進(jìn)一步傳遞給其下游底物SMAD蛋白——SMAD2和SMAD3，便完成了經(jīng)典的SMAD信號(hào)通路傳導(dǎo)（見(jiàn)圖1）[6]。

圖1 TGF-β/Smad 信號(hào)通路Fig 1 TGF-β/Smad signaling pathway

除了經(jīng)典的SMAD信號(hào)通路，TGF-β還可以通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）、Rho-Rock等激活非SMAD途徑，從而影響TGF-β因子下游的一些關(guān)鍵細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[7]。由于ALK5在TGF-β信號(hào)通路中起著至關(guān)重要的作用，因此被視為治療多種癌癥、纖維化疾病的重要靶點(diǎn)。近年來(lái)，ALK5抑制劑在治療其他疾病如青光眼、血腦屏障損傷及腸道疾病等方面也取得了一定的進(jìn)展[8]。

2 ALK5抑制劑的生物活性

2.1 抗腫瘤作用

TGF-β是一種眾所周知的腫瘤促進(jìn)因子，如何通過(guò)抑制其活性而發(fā)揮抗腫瘤作用一直都是研究熱點(diǎn)。體外研究顯示，ALK5抑制劑能夠有效阻斷SMAD蛋白的磷酸化，從而減少腫瘤的轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。此外，ALK5抑制劑還可以通過(guò)阻斷癌細(xì)胞的免疫逃逸來(lái)防止腫瘤侵襲[9]。到目前為止，進(jìn)行臨床試驗(yàn)的ALK5小分子抑制劑有化合物Vactosertib（EW-7197，1）、Galunisertib（LY-2157299，2）、LY-3200882（3）和PF-06952229（4）（見(jiàn)圖2），且臨床試驗(yàn)均為實(shí)體瘤方向。其中，LY-3200882因公司戰(zhàn)略調(diào)整，于2019年停止產(chǎn)品開(kāi)發(fā)（NCT04158700）。另一產(chǎn)品PF-06952229早先用于治療具有高TGF-β特征和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）表達(dá)的晚期或轉(zhuǎn)移性癌癥患者（NCT03685591），作為單一療法并與其他治療藥物聯(lián)合使用，后也因公司的戰(zhàn)略調(diào)整，于2021年停止了該產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。

圖2 ALK5小分子抑制劑Fig 2 ALK5 small molecule inhibitors

Vactosertib是一種口服的可逆性TGF-βⅠ型受體酪氨酸激酶抑制劑，IC50為13 nmol·L-1[10]，用于治療晚期/轉(zhuǎn)移性癌癥等。目前，針對(duì)晚期/轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）、轉(zhuǎn)移性胰腺導(dǎo)管腺癌和骨髓增生異常綜合征等多種實(shí)體瘤的臨床試驗(yàn)正在展開(kāi)。2017年，該化合物在美國(guó)被授予孤兒藥稱(chēng)號(hào)，用于治療肝細(xì)胞癌。2020年，Vactosertib/紫杉醇聯(lián)合用藥在美國(guó)獲得孤兒藥資質(zhì)，用于治療轉(zhuǎn)移性胃腺癌。2021年，該產(chǎn)品被指定為孤兒藥，用于治療胰腺癌。最近，Park等[11]研究表明，口服Vactosertib可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激、EMT、癌癥干細(xì)胞（CSC）和纖維化來(lái)克服放療在乳腺癌治療中的局限性，因此，Vactosertib聯(lián)合放療在臨床上可能更適用于乳腺癌患者。

目前禮來(lái)公司對(duì)于Galunisertib（IC50＝56 nmol·L-1）的研究正處于Ⅱ期臨床開(kāi)發(fā)階段（NCT01246986），用于治療肝細(xì)胞癌、膠質(zhì)瘤和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，而該藥物用于骨髓增生異常綜合征治療的Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗(yàn)已經(jīng)完成[12]。用于治療轉(zhuǎn)移性胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌、轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌和子宮或卵巢癌肉瘤等的早期臨床試驗(yàn)也已經(jīng)或正在進(jìn)行中。2013年，作為歐盟指定孤兒藥，Galunisertib用于治療肝細(xì)胞癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤。

目前處于臨床前研究的ALK5抑制劑較多，其中有3個(gè)結(jié)構(gòu)值得關(guān)注。Zhang等[13]利用基于分子對(duì)接的虛擬篩選對(duì)商業(yè)天然產(chǎn)物庫(kù)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)黃酮苷山柰酚3-O-龍膽雙糖苷（KPF 3-O-G，5）（見(jiàn)圖2，IC50＝2.589 mol·L-1）是一種有效的ALK5抑制劑，這是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的為數(shù)不多的天然產(chǎn)物類(lèi)ALK5抑制劑。該化合物能夠通過(guò)直接與ALK5的ATP位點(diǎn)結(jié)合，抑制Smad2的磷酸化以及Smad4的表達(dá)，從而減少細(xì)胞增殖并抑制TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和侵襲。體內(nèi)研究表明，KPF 3-O-G給藥（40 mg·kg-1）能夠減少人卵巢癌異種移植小鼠模型中的腫瘤生長(zhǎng)，且無(wú)明顯毒副作用，表明KPF3-O-G具有開(kāi)發(fā)成為腫瘤治療藥物的潛力。Xu等[14]以L(fǎng)Y-3200882為先導(dǎo)，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行藥效團(tuán)分析和分子對(duì)接研究，對(duì)分子中的連接環(huán)進(jìn)行替換，得到了一系列4-（吡啶-4-氧基）-3-（3，3-二氟環(huán)丁基）吡唑衍生物，其中活性最好的化合物6（見(jiàn)圖2）（IC50＝30 nmol·L-1）的體外、體內(nèi)活性及藥代動(dòng)力學(xué)特征均優(yōu)于LY-3200882，表現(xiàn)出良好的抗腫瘤療效。此外，由于p38α絲裂原活化蛋白激酶（p38αMAPK）對(duì)腫瘤壞死因子-α具有重要調(diào)控作用，因此，抑制p38αMAPK被視為治療腫瘤的一種有效手段[15-16]。近年來(lái)，對(duì)于ALK5及p38αMAPK雙靶點(diǎn)抑制劑的研究，也取得了較好的結(jié)果。Liu等[17]在前人研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)合成了4-（1H-吲唑-5-基）-5-（6-甲基吡啶-2-基）-1H-咪唑和4-（1-甲基-1H-吲唑-5-基）-5-（6-甲基吡啶-2-基）-1H-咪唑兩個(gè)系列的化合物，并評(píng)估了它們對(duì)ALK5和p38αMAPK的抑制作用，結(jié)果顯示，化合物J-1090（7，見(jiàn)圖2）對(duì)兩者均表現(xiàn)出了強(qiáng)大的抑制作用，IC50值均為4 nmol·L-1。進(jìn)一步的體外研究表明，該化合物能夠通過(guò)抑制TGF-β誘導(dǎo)的EMT來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。

2.2 抗纖維化作用

TGF-β1最初被發(fā)現(xiàn)時(shí)，便因其能夠刺激軟瓊脂中培養(yǎng)的大鼠成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，而被認(rèn)為是纖維化的主要細(xì)胞因子[18]。研究表明，在多種ECM積累引起纖維化的器官中都能夠觀察到TGF-β的過(guò)表達(dá)[19-20]。因此，抑制ALK5不失為對(duì)抗各種器官纖維化的有效策略。目前，抗纖維化作用的ALK5小分子抑制劑均處于臨床前研究階段，尚未有藥物進(jìn)入臨床研究階段。

Yue等[21]在MPLW515L和JAK2V617F小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)Galunisertib無(wú)論在體內(nèi)還是體外，均能夠消除由于骨髓纖維化引起的膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ的持續(xù)過(guò)量產(chǎn)生，明顯改善了小鼠的骨髓纖維化程度，為阻斷ALK5作為骨髓纖維化治療策略提供了臨床前依據(jù)。Ferreira等[22]使用GW-788388（8，見(jiàn)圖2）對(duì)克氏錐蟲(chóng)（來(lái)自哥倫比亞毒株的102種寄生蟲(chóng)）感染后的小鼠進(jìn)行口服治療（3 mg·kg-1），發(fā)現(xiàn)GW-788388 有效逆轉(zhuǎn)了富含連接蛋白-43的細(xì)胞間斑塊的損傷，并減少了心臟組織的纖維化，因此，抑制TGF-β通路可能是美洲錐蟲(chóng)病心臟病慢性期心臟纖維化治療的重要且可靠的策略。

Rezníckova等[23]設(shè)計(jì)并合成了一系列以2，3，4-取代的5，5-二甲基-5，6-二氫-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑結(jié)構(gòu)為核心的衍生物，其中化合物9（見(jiàn)圖2）活性最好，對(duì)ALK5的IC50值為80 nmol·L-1。細(xì)胞研究表明，這些化合物能夠通過(guò)引起Smad2/3的劑量依賴(lài)性去磷酸化，阻斷Smad2/3向TGF-β刺激的細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位，呈現(xiàn)出抗纖維化作用。Zhu等[24]報(bào)道了一系列含有[1，2，4]三唑并[1，5-a]吡啶-6-基部分的化合物，并評(píng)估了這些化合物對(duì)ALK5和p38α激酶的抑制活性，發(fā)現(xiàn)在吡唑環(huán)的4-位插入苯并[c][1，2，5]噻二唑-5-基部分可顯著提高ALK5激酶的活性。其中最有效的化合物10（見(jiàn)圖2）的IC50值為30 nmol·L-1，對(duì)p38α激酶的選擇性指數(shù)為235，是LY-2157299的59倍，與EW-7197相當(dāng)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色、蛋白質(zhì)印跡和RT-PCR測(cè)定結(jié)果均顯示化合物10有效抑制了TGF-β誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞（HSC）活化，對(duì)肝纖維化治療表現(xiàn)出極高的治療潛力，有望成為治療肝纖維化的臨床前候選藥物。Zheng等[25]設(shè)計(jì)合成了多種噻吩并[3，2-c]吡啶-2-基吡唑衍生物，并評(píng)價(jià)了它們對(duì)ALK5的抑制活性，發(fā)現(xiàn)化合物 J-1063（11，見(jiàn)圖2）（IC50＝30 nmol·L-1）能夠有效抑制TGF-β誘導(dǎo)的活化HSC的纖維化和炎癥，減少硫代乙酰胺誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化中巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，其延緩肝纖維化的進(jìn)展及抑制伴隨的炎癥的能力明顯優(yōu)于Galunisertib。該化合物不僅具有優(yōu)越的藥理作用，而且合成相對(duì)簡(jiǎn)單，是治療和預(yù)防肝纖維化的有希望的候選藥物。

Xie等[26]通過(guò)虛擬篩選和藥效團(tuán)構(gòu)建設(shè)計(jì)并合成了一種新型ALK5小分子抑制劑Cpd-0225（12，見(jiàn)圖2），生物活性研究表明該化合物能夠通過(guò)阻斷Smad依賴(lài)性和非Smad依賴(lài)性信號(hào)通路，發(fā)揮腎保護(hù)作用，在體外或體內(nèi)均能發(fā)揮作用，且在相同劑量下，比SB-431542（13，見(jiàn)圖2）具有更好的抗纖維化作用，有望成為治療慢性腎病的有效臨床候選藥物。此外，由于對(duì)成纖維細(xì)胞具有較好的抑制作用，SB-431542最新用于青光眼小梁切除術(shù)后濾過(guò)泡瘢痕化的防治，且有望替代早先使用的絲裂霉素C等細(xì)胞毒類(lèi)藥物，因?yàn)锳LK5抑制劑具有更低的細(xì)胞毒性[27]。

2.3 促進(jìn)腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元

腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS）由腸壁中的肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)叢組成，該系統(tǒng)主要包含腸膠質(zhì)細(xì)胞和腸神經(jīng)元。多種不良因素，如炎癥、衰老、飲食改變、代謝紊亂等，都可能導(dǎo)致腸神經(jīng)元損傷或ENS功能失調(diào)，從而引起胃腸動(dòng)力和感覺(jué)功能障礙，如胃輕癱、腸易激綜合征和先天性巨結(jié)腸等[28-30]。對(duì)于患有先天性巨結(jié)腸的兒童，手術(shù)切除整個(gè)腸道結(jié)腸或部分結(jié)腸仍然是治療的主要選擇，但這種治療不能預(yù)防生命后期發(fā)生的小腸結(jié)腸炎、便秘或失禁等終生并發(fā)癥。盡管在成人腸道中產(chǎn)生新神經(jīng)元的手段相對(duì)有限，但添加新的腸神經(jīng)元來(lái)替代受損的神經(jīng)元將仍是修復(fù)ENS功能障礙的解決方案。

Medina等[31]研究發(fā)現(xiàn)，SD-208（14，見(jiàn)圖2）能夠通過(guò)TGF-β/ALK5/SMAD通路參與實(shí)驗(yàn)性腸纖維化的發(fā)病機(jī)制，在厭氧菌和三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的動(dòng)物模型中，有效抑制由于Smad2和Smad3的磷酸化以及ALK5蛋白、組織金屬蛋白酶抑制劑-1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase,TIMP）和Ⅰ型膠原α2（α2 type 1 collagen,COL1α2）重組蛋白表達(dá)上調(diào)產(chǎn)生的纖維化。Shi等[32]發(fā)現(xiàn)在正常成年小鼠模型中，用RepSox（15，見(jiàn)圖2）3及10 mg/（kg·d）灌胃，持續(xù)給藥2周，結(jié)果顯著促進(jìn)了ENS中腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化，并對(duì)小鼠的胃腸道運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生了一定的影響。EW-7197和LY-257299也能產(chǎn)生與SD-208相似的效果，并且利用shRNA下調(diào)腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中ALK5的表達(dá)也會(huì)產(chǎn)生類(lèi)似效果，進(jìn)一步證實(shí)了ALK5信號(hào)通路在腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)變中發(fā)揮了重要作用。這些結(jié)果表明，抑制ALK5可能是一種有前途的治療腸道疾病的有效策略。

2.4 血腦屏障保護(hù)作用

研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞中TGF-β受體的條件性基因敲除或TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)的藥理學(xué)抑制均能夠逆轉(zhuǎn)老年小鼠的血腦屏障受損（blood brain barrier disruption，BBBD）。同時(shí)，在接受TGF-β抑制治療的患有血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的老年人群受試者中，發(fā)現(xiàn)同樣的信號(hào)通路被激活[33]。

Atis等[34]通過(guò)使用SB-431542對(duì)血管緊張素（angiotensin，ANG）Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓小鼠進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)SB-431542能夠降低由于ANGⅡ輸注引起的BBB對(duì)白蛋白Alexa fluor 594的滲透性的增加，因此抑制TβRⅠ可以防止高張力條件下BBBD，可作為一種新的治療方式來(lái)保護(hù)高血壓患者的大腦。Preininger等[35]使大鼠海馬體長(zhǎng)期暴露于血清白蛋白，通過(guò)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞應(yīng)激誘導(dǎo)的早衰，發(fā)現(xiàn)在對(duì)BBBD大鼠模型每日使用ALK5抑制劑IPW-53715（結(jié)構(gòu)未見(jiàn)公布）進(jìn)行給藥后，海馬組織中衰老星形膠質(zhì)細(xì)胞的負(fù)擔(dān)顯著減輕，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了ALK5抑制劑IPW-5371能夠有效預(yù)防BBBD。

2.5 降低眼壓作用

青光眼是一種進(jìn)行性眼部疾病，可導(dǎo)致不可逆的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡，是全球視力喪失的主要原因。由于現(xiàn)有藥物或治療方法均會(huì)產(chǎn)生耐藥性或者不同程度的不良反應(yīng)如心律失常和支氣管收縮等，因此亟需開(kāi)發(fā)治療青光眼的新療法[36-37]。

眼內(nèi)壓（intra-ocular pressure，IOP）升高是青光眼發(fā)生和發(fā)展最重要的危險(xiǎn)因素，降低IOP已被證明可有效治療青光眼。IOP由房水的產(chǎn)生和流出控制，小梁網(wǎng)是房水從眼睛排出的主要途徑。Aoshima等[38]研究表明，ALK5抑制劑SB-431542能夠通過(guò)抑制小梁網(wǎng)中ECM的產(chǎn)生達(dá)到降低IOP的目的，并且其作用優(yōu)于Rho相關(guān)的卷曲蛋白激酶抑制劑Y-27632，每日一次重復(fù)使用可增強(qiáng)小鼠的IOP降低效果。因此，ALK5抑制劑或許可以作為治療青光眼的新療法進(jìn)行開(kāi)發(fā)。

3 小結(jié)與展望

TGF-β幾乎滲透到人體內(nèi)各生物學(xué)過(guò)程中的方方面面，形成了一個(gè)巨大的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，其生物活性的研究一直都在進(jìn)行中。ALK5作為T(mén)GF-β/Smad信號(hào)通路中不可或缺的一環(huán)，其抑制劑在TGF-β抑制劑中占據(jù)著舉足輕重的地位。雖然至今尚未有ALK5小分子抑制劑被批準(zhǔn)上市，但目前在研藥物中，EW-7197和LY-2157299在臨床試驗(yàn)中均有良好的表現(xiàn)，并且不少活性好的新型小分子抑制劑也不斷被發(fā)現(xiàn)。尤其是具有ALK5抑制活性的天然產(chǎn)物也逐漸被發(fā)現(xiàn)，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造也呈現(xiàn)出廣闊的前景。在生物活性方面，ALK5小分子抑制劑除了具有抗腫瘤和纖維化作用以外，在腸道疾病、BBBD和青光眼治療等方面也有一定的價(jià)值?？傊S著對(duì)ALK5小分子抑制劑的研究深入，更多安全有效的ALK5小分子抑制劑將進(jìn)入臨床發(fā)揮治療作用。