HPLC-ELSD法和UPLC-MS/MS法評(píng)價(jià)石斛夜光丸中人參投料摻偽情況

朱韜，何頌華，李麗莉，羅軼（廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材質(zhì)量監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021）

石斛夜光丸是治療眼疾的古老傳統(tǒng)名方，處方由石斛、人參、山藥、茯苓、地黃、天冬、山羊角等25味中藥組成，現(xiàn)收載于《中國(guó)藥典》2020 年版，具有滋陰補(bǔ)腎、清肝明目的功效[1]?，F(xiàn)代臨床研究表明，石斛夜光丸用于治療干眼癥、玻璃體混濁、中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、慢性葡萄膜炎、青光眼術(shù)后、溢淚癥、肝腎陰虧型足跟痛、冠心病及心肌梗死等疾病[2-4]。處方中人參為傘形目五加科人參屬植物人參（PanaxginsengC.A.Mey）的干燥根和根莖，性溫，具有大補(bǔ)元?dú)狻⒐堂撋?、安神益智等功效；西洋參為傘形目五加科人參屬植物西洋參（PanaxquinquefoliumL.）的干燥根，性涼，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津的功效，兩者藥效區(qū)別較大，不能混用。

隨著市場(chǎng)需求不斷提升，商家追求高額利潤(rùn)，近年來(lái)不斷有報(bào)道使用西洋參混入中藥制劑冒充人參進(jìn)行投料生產(chǎn)[5-6]。2020年版《中國(guó)藥典》中對(duì)于石斛夜光丸的人參質(zhì)量控制僅涉及人參皂苷Rg1和人參皂苷Re兩個(gè)成分，但西洋參中也含有這兩種成分[7-8]，單純采用這兩個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行定性鑒別，對(duì)于是否存在西洋參摻偽投料情況無(wú)法評(píng)判。兩味藥所含化學(xué)成分極為相似，均以人參皂苷為重要活性成分，但所含皂苷種類與比例存在一定差異，如西洋參特有的擬人參皂苷F11，人參中基本沒(méi)有[5，9]。因此本試驗(yàn)以擬人參皂苷F11為特征標(biāo)志物，進(jìn)行摻偽檢查的方法研究。由于擬人參皂苷F11沒(méi)有紫外吸收，本試驗(yàn)采用了高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLC-ELSD）法，同時(shí)通過(guò)UPLC-MS/MS技術(shù)建立專屬性強(qiáng)的檢查方法，并對(duì)收集到的91批樣品進(jìn)行測(cè)試，以期對(duì)不同生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品進(jìn)行評(píng)價(jià)，為石斛夜光丸中人參摻偽投料檢測(cè)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)完善提供參考。

1 儀器與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent 6460超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent公司），ELSD 6000蒸發(fā)光檢測(cè)器（Alltech公司）；XP205電子天平（Mettler Toledo 公司，精度0.01 mg）；Milli-Q純水儀（Millipore公司）。

人參（批號(hào)：120917-201712）、西洋參（批號(hào)：120997-201810）、擬人參皂苷F11（批號(hào)：110841-201607）（中國(guó)食品藥品檢定研究院），25批不同產(chǎn)地的西洋參和13批西洋參須均購(gòu)自市場(chǎng)（經(jīng)廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所黃清泉主管中藥師鑒定為五加科植物西洋參PanaxquinquefoliumL.的干燥根和干燥根須），91批不同廠家、不同批次石斛夜光丸均為2020年國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)樣品。乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC-ELSD法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Capcell PAK C18 MGIII（S-5）（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～20 min：10%→30%A；20～45 min：30%A）；流速1.0 mL·min-1；柱溫30℃；檢測(cè)器ELSD，漂移管溫度105℃，載氣為氮?dú)猓瑲怏w流速3.0 L·min-1，增益1。

2.1.2 溶液的制備

① 對(duì)照品溶液：取擬人參皂苷F11（經(jīng)標(biāo)定，含量為99.9%）適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含100 μg的溶液，即得。

② 供試品溶液：取本品，研碎，取6 g，精密稱定；置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液100 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取濾液50 mL，置蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)铀?5 mL使溶解，加水飽和正丁醇振搖提取4次，每次25 mL，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次50 mL，再用正丁醇飽和水50 mL洗滌，分取正丁醇液，減壓濃縮，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

③ 陰性樣品溶液的制備：按規(guī)定的處方量及工藝自制缺人參的石斛夜光丸陰性樣品，按②項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

④ 陽(yáng)性樣品溶液的制備：取陰性樣品6 g 和西洋參3.4 mg（相當(dāng)于6 g 制劑中10%人參的處方量），作為陽(yáng)性樣品，按②項(xiàng)下方法制成陽(yáng)性樣品溶液。

⑤ 人參供試品溶液的制備：取人參34 mg（相當(dāng)于6 g制劑中人參的處方量），按②項(xiàng)下方法制成西洋參（須）供試品溶液。

⑥ 西洋參（須）供試品溶液的制備：分別取西洋參和西洋參須各3.4 mg，按②項(xiàng)下方法制成西洋參（須）供試品溶液。

⑦ 摻偽5%西洋參（須）樣品溶液的制備：取陰性樣品6 g 和西洋參（須）1.7 mg（相當(dāng)于6 g 制劑中5%人參的處方量），作為陽(yáng)性樣品，按②項(xiàng)下方法制成摻偽樣品溶液。

2.1.3 含量測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液5 μL、20 μL及供試品溶液10 μL，進(jìn)樣測(cè)定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算擬人參皂苷F11的含量。

2.1.4 專屬性試驗(yàn) 分別吸取對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液和對(duì)照藥材溶液各10 μL，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果西洋參和西洋參須在擬人參皂苷F11峰相應(yīng)位置顯示有對(duì)應(yīng)色譜峰，陰性樣品和人參在擬人參皂苷F11相應(yīng)位置無(wú)色譜峰，表明本方法專屬性較好，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC-ELSD法專屬性試驗(yàn)色譜圖Fig 1 HPLC-ELSD diagram of specific test

2.1.5 線性關(guān)系考察 稱取擬人參皂苷F11對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.0528、0.1055、0.3165、0.5275、1.0550 mg·mL-1的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為：Y＝1.650X+2.315，r＝0.9999。結(jié)果表明，擬人參皂苷F11在進(jìn)樣量為0.528～10.550 μg內(nèi)與峰面積對(duì)數(shù)值線性關(guān)系良好。

2.1.6 耐用性試驗(yàn) 考察3種不同品牌色譜柱[CAPCELL PAK C18 MGIII（S-5）（5 μm，4.6 mm×250 mm）、Agilent 5TC-C18（2）（5 μm，4.6 mm×250 mm）、菲羅門SuperLu C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）]，結(jié)果3種色譜柱測(cè)定人參皂苷F11的峰面積RSD為0.79%，表明方法耐用性良好。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取擬人參皂苷F11對(duì)照品溶液，連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果峰面積的RSD為1.1%，表明本法的儀器精密度較好。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批石斛夜光丸供試品（陽(yáng)性樣品），平行稱取6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成相應(yīng)溶液并測(cè)定，結(jié)果擬人參皂苷F11平均含量為149 μg·g-1，RSD為0.81%，表明本方法重復(fù)性較好。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批石斛夜光丸供試品（陽(yáng)性樣品），按“2.1.2”項(xiàng)下方法的色譜條件，每隔4 h測(cè)定一次，共測(cè)定6次，結(jié)果擬人參皂苷F11峰面積的RSD為1.4%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.10 加樣回收試驗(yàn) 取陽(yáng)性供試品6 g，精密稱定，精密加入擬人參皂苷F11對(duì)照品溶液（2.4 mg·L-1）100 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成相應(yīng)溶液并測(cè)定，結(jié)果加樣回收率為98.7%～104.4%，RSD為2.2%。

2.1.11 定量限和檢測(cè)限 精密吸取擬擬人參皂苷F11對(duì)照品溶液（1.1 mg·mL-1），逐級(jí)稀釋，進(jìn)樣測(cè)定，S/N為3∶1時(shí)確定檢測(cè)限，S/N為10∶1時(shí)確定定量限，結(jié)果擬人參皂苷F11的定量限、檢測(cè)限分別為13 μg·g-1、5.8 μg·g-1。

2.1.12 限度擬訂 按照2020版《中國(guó)藥典》四部0212藥材和飲片檢定通則規(guī)定雜質(zhì)通常不得過(guò)3%[10]；中藥成方制劑中人參與西洋參顯微鑒別較困難，故放寬限度，以摻偽5%西洋參（須）樣品中擬人參皂苷F11的含量平均值為限度。

2.1.13 摻偽樣品測(cè)定 38份摻偽樣品中擬人參皂苷F11的含量平均值為40 μg·g-1，擬訂限度為石斛夜光丸每1 g含擬人參皂苷F11不得過(guò)40 μg。

2.2 UPLC-MS/MS法

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動(dòng)相：以0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫，0～6 min：90%A；6～20 min：90%→50%A；流速：0.25 mL·min-1；柱溫：30℃，進(jìn)樣量：1 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離源，負(fù)離子方式掃描，MRM 模式檢測(cè)；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：5 L·min-1；霧化氣壓力：40 psi；鞘流氣溫度：350℃；鞘流氣流速：10 L·min-1；毛細(xì)管電壓：3 kV；噴嘴電壓：500 V；選擇m/z845.5→653.4和m/z845.5→490.9作為檢測(cè)離子對(duì)。

2.2.3 溶液的制備

① 對(duì)照品溶液：取擬人參皂苷F11對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含2 μg的混合溶液，即得。

② 供試品溶液：精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜（0.22 μm）濾過(guò)，即得。

2.2.4 專屬性試驗(yàn) 分別取“2.1.2”項(xiàng)下溶液，精密稀釋10倍，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果陰性樣品和人參色譜中，均未出現(xiàn)與擬人參皂苷F11對(duì)照品色譜保留時(shí)間相同的色譜峰，表明處方中其他藥味對(duì)該測(cè)定方法無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

圖2 UPLC-MS/MS法專屬性試驗(yàn)色譜圖Fig 2 UPLC-MS/MS chromatogram of specific test

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.05、0.1、0.2、0.4、1、2 mL，分別置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容，搖勻，進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：Y＝3.92×104X+3.04×103，r＝0.9998，在0.51～20 μg·mL-1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.6 耐用性試驗(yàn) 選取Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Agilent Eclipse C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Waters CORTECS C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）3種色譜柱，對(duì)檢出西洋參摻偽的陽(yáng)性樣品進(jìn)樣分析，結(jié)果3種色譜柱的分析結(jié)果一致，擬人參皂苷F11的峰面積RSD為2.0%，表明方法耐用性良好。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取擬人參皂苷F11對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積的RSD為1.9%，表明該儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.1.8”項(xiàng)下供試品溶液，稀釋10倍，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果色譜峰面積的RSD為1.7%，結(jié)果表明本法重復(fù)性較好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.9”項(xiàng)下供試品溶液，稀釋10倍，每隔4 h測(cè)定一次，共測(cè)定6次，結(jié)果擬人參皂苷F11峰面積RSD為1.2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.10 加樣回收試驗(yàn) 取陽(yáng)性供試品6 g，精密稱定，精密加入擬人參皂苷F11對(duì)照品溶液（2.51 mg·L-1）100 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成相應(yīng)溶液并測(cè)定，結(jié)果加樣回收率為98.03%～106.07%，RSD為3.2%。

2.2.11 檢測(cè)限和定量限 取未檢出的空白樣品制備空白基質(zhì)溶液，精密加入擬人參皂苷F11對(duì)照品（80 μg·mL-1）0.1 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣分析，按信噪比S/N≈3折算，擬人參皂苷F11的檢測(cè)限為0.6 μg·g-1；按S/N≈10折算，擬人參皂苷F11的定量限為1.9 μg·g-1。

2.2.12 限度擬訂 不同西洋參和西洋參須制成的摻偽樣品，擬人參皂苷F11的峰面積差異較大，因此以5%西洋參摻偽樣品的平均峰面積為擬訂限度的參考。

2.2.13 摻偽樣品測(cè)定 38份摻偽樣品的擬人參皂苷F11峰面積平均值為87 398.79，對(duì)應(yīng)對(duì)照品的質(zhì)量濃度為2 μg·mL-1。

2.2.14 判定原則 以擬人參皂苷F11對(duì)照品質(zhì)量濃度（2 μg·mL-1）為判定限度，規(guī)定結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為：以m/z845.5→653.4和m/z845.5→490.9提取的供試品離子流色譜中，應(yīng)不得同時(shí)出現(xiàn)擬人參皂苷F11保留時(shí)間一致的色譜峰；若同時(shí)出現(xiàn)，則供試品色譜中m/z845.5→653.4的色譜峰面積值應(yīng)不得大于對(duì)照品溶液中相應(yīng)的峰面積值。

3 樣品含量測(cè)定

對(duì)91批石斛夜光丸進(jìn)行檢測(cè)，采用HPLCELSD法，結(jié)果35批樣品擬人參皂苷F11含量超出擬訂限度；采用UPLC-MS/MS法檢測(cè)，結(jié)果35批樣品擬人參皂苷F11質(zhì)量濃度大于2 μg·mL-1。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 石斛夜光丸中擬人參皂苷F11的含量Tab 1 Content of pseudoginsenoside F11 in Shihu Yeguang pills

4 討論

4.1 檢測(cè)方法的選擇

本試驗(yàn)對(duì)擬人參皂苷F11的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，考察了溶劑回流法和超聲提取法，比較了不同溶劑提?。状肌?0%甲醇、50%甲醇）、不同溶劑用量（50、100、150 mL）、不同提取時(shí)間（45、60、90 min）、洗滌次數(shù)對(duì)提取的影響，最終選擇了本研究的提取方法。

人參與西洋參的區(qū)分方法有薄層色譜和性狀鑒別[11]。本研究前期對(duì)薄層色譜方法進(jìn)行了探索，由于薄層色譜靈敏度低，處方中藥味較多，干擾斑點(diǎn)影響嚴(yán)重，不適用于石斛夜光丸中西洋參的檢查。人參在石斛夜光丸中為原粉入藥，因此不能通過(guò)性狀進(jìn)行鑒別。ELSD作為通用型檢測(cè)器，可快速完成對(duì)無(wú)紫外吸收化學(xué)成分的定性與定量分析，HPLC-ELSD法減少中藥制劑中紫外吸收強(qiáng)的成分的干擾，特別適用于測(cè)定皂苷類成分含量[12-14]。本研究使用的兩種檢測(cè)方法，UPLC-MS/MS法專屬性強(qiáng)，分析時(shí)間短，而HPLC-ELSD法簡(jiǎn)便，儀器檢測(cè)成本比較低，均適用于石斛夜光丸中擬人參皂苷F11的檢測(cè)。

4.2 擬人參皂苷F11的裂解途徑

擬人參皂苷F11為皂苷類化合物，質(zhì)譜裂解中主要丟失母核上連接的糖苷碎片，負(fù)離子模式下質(zhì)譜響應(yīng)較好，顯示較強(qiáng)的[M+HCOO]-m/z845.5的準(zhǔn)分子離子峰，母離子峰為m/z799.6 [MH]-，先脫去一分子鼠李糖（rha）得到碎片離子（m/z653.4），再脫去一分子葡萄糖（glc），得到m/z490.9的碎片離子，裂解途徑見(jiàn)圖3。

圖3 擬人參皂苷F11質(zhì)譜裂解途徑Fig 3 Fragmentation pathway of pseudoginsenoside F11

4.3 評(píng)價(jià)石斛夜光丸中人參摻偽投料情況

本研究結(jié)果顯示，35批石斛夜光丸檢出含有西洋參，不合格率為38.5%，18家生產(chǎn)企業(yè)中8家企業(yè)樣品檢出擬人參皂苷F11超出限度，可見(jiàn)人參摻偽問(wèn)題嚴(yán)重。中成藥中人參多以粉末入藥，西洋參與人參以粉末入藥時(shí)極為相似難以通過(guò)外觀進(jìn)行有效區(qū)分，多數(shù)中成藥現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)以人參皂苷Rb1、Re和Rg1作為檢驗(yàn)指標(biāo)，西洋參各部位（莖葉、主根、須根、蘆頭、根皮、根心等）均含人參皂苷Rb1、Re和Rg1，僅含量存在差異，以總量計(jì)含量大于人參[15-18]。調(diào)研發(fā)現(xiàn)，西洋參價(jià)格與人參相當(dāng)甚至更高，而西洋參須和西洋參邊角料價(jià)格僅為西洋參價(jià)格的20%左右。因此，不法商家以西洋參須或西洋參邊角料代替人參投料。

4.4 總結(jié)

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的中成藥人參中西洋參摻偽問(wèn)題較為嚴(yán)重，亟需得到重視。本研究首次建立了HPLCELSD法測(cè)定石斛夜光丸中擬人參皂苷F11的含量，同時(shí)建立了UPLC-MS/MS法，兩種方法都能夠準(zhǔn)確有效地判斷石斛夜光丸中是否有西洋參摻偽投料，為評(píng)價(jià)石斛夜光丸等含人參中成藥中人參投料情況提供了技術(shù)支持。