頂空氣相色譜和頂空氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定20種中藥材中磷化鋁的殘留量

王月玲，戚鵬飛，吳福祥，邵長(zhǎng)春，徐雪梅*，楊金草（1.蘭州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，蘭州 70050；2.國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（食品中農(nóng)藥獸藥殘留監(jiān)控），蘭州 70050；.甘南藏族自治州藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅 合作 747000）

磷化鋁是國(guó)內(nèi)外糧食貯藏中普遍使用的高效殺蟲(chóng)劑，遇水或酸可產(chǎn)生磷化氫氣體，該氣體是殺蟲(chóng)的有效成分，其穿透性強(qiáng)，易揮散，且對(duì)霉菌也有抑制作用[1]。近年來(lái)，藥材市場(chǎng)上廣泛采用磷化鋁熏蒸來(lái)代替硫磺熏蒸藥材應(yīng)用于中藥材貯存[2-4]，經(jīng)過(guò)磷化鋁熏蒸處理的中藥材可防蟲(chóng)5～6個(gè)月[5]。本課題組前期市場(chǎng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，市場(chǎng)上普遍存在磷化鋁熏蒸中藥材的情況，尤其是從每年的春季驚蟄至秋季寒露期間，熏蒸尤為普遍，在甘肅省地產(chǎn)大宗中藥材中，以黨參熏蒸最甚，黃芪、當(dāng)歸次之。

然而熏蒸產(chǎn)生的磷化氫屬于劇毒易燃?xì)怏w，在熏蒸過(guò)程中如處理不當(dāng)會(huì)造成較為嚴(yán)重的后果，一般會(huì)引起以神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)損害為主的全身性疾病[6]，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致心、肝、腎等重要器官衰竭等[7-8]。熏蒸后磷化氫氣體還容易殘留在藥材中，其安全性尚缺乏系統(tǒng)的研究。目前，中藥材中尚無(wú)直接檢測(cè)磷化鋁的方法，磷化氫的檢測(cè)方法也較匱乏和落后，主要有鉬藍(lán)比色法、滴定法、離子色譜法等[9-11]，這些方法的前處理操作均較復(fù)雜，方法穩(wěn)定性差，靈敏度較低，專(zhuān)屬性不強(qiáng)，易造成假陽(yáng)性結(jié)果[12]，并且需要較大的取樣量。近年來(lái)，頂空氣相色譜法廣泛應(yīng)用于食品[13-14]、藥品[15-17]、化妝品[18]等樣品中揮發(fā)性和半揮發(fā)性有機(jī)物的分析，也應(yīng)用于煙草、水果等基質(zhì)中磷化氫的檢測(cè)[19-22]，相比傳統(tǒng)磷化氫檢測(cè)方法，該法具有前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，但目前該方法對(duì)中藥材中磷化鋁殘留方面的研究十分有限[23-24]。因此，本試驗(yàn)選擇甘肅省市售中藥材、中藥飲片中易生蟲(chóng)的品種（其中包括部分甘肅省地產(chǎn)中藥材品種）黨參、大黃、黃芪、桔梗、枸杞子、款冬花、當(dāng)歸、杏仁、澤瀉、白芷、土鱉蟲(chóng)、柏子仁、皂角、肉蓯蓉、桑白皮、天花粉、防己、瓜蔞、酸棗仁、板藍(lán)根作為研究對(duì)象，采用頂空氣相色譜（HSGC）和頂空氣相色譜-質(zhì)譜（HSGCMS）法建立此20種中藥材、中藥飲片中磷化鋁殘留量的檢測(cè)方法，并通過(guò)對(duì)樣品中磷化鋁的殘留量進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為科學(xué)評(píng)價(jià)中藥材的安全性提供數(shù)據(jù)參考，為中藥材市場(chǎng)監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料

1.1 儀器

島津GC-2010 Plus氣相色譜儀（日本島津），配置火焰光度檢測(cè)器（FPD）和頂空進(jìn)樣系統(tǒng)（DANI HSS 86.50 Plus）；安捷倫7890B-7000D（GS-MS）氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配置安捷倫7697A頂空進(jìn)樣器，Agilent HP-PLOT/Q-PT毛細(xì)管柱（30 m×0.53 mm，40 μm）（美國(guó)安捷倫）；MettlerToledo ME403型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Milli-Q超純水儀（美國(guó)Millipore公司）；Vortexer 渦旋混勻儀（上海嘉鵬科技有限公司）；10、1000、5000 μL魯爾頭閥門(mén)型氣體密封針（上海玻利鴿有限公司）；帶密封翻蓋橡膠塞的600 mL玻璃瓶（徐州榮昌玻璃制品有限公司）；20 mL頂空鉗口樣品瓶及其PTFE硅膠墊瓶蓋（安捷倫）；封口均質(zhì)袋（比克曼生物科技有限公司）。

1.2 試藥

56%磷化鋁（濟(jì)南天邦化工有限公司）；硫酸（純度：98%，分析純，重慶川東化工有限公司）；純化水（Milli-Q 超純水儀自制）；其余試劑均為分析純。

中藥材、中藥飲片在甘肅蘭州、定西及安徽亳州藥材市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)，共20個(gè)品種252批次，具體信息見(jiàn)表 1，樣品均經(jīng)蘭州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院戚鵬飛主管藥師鑒定為正品。

表1 樣品收集信息表Tab 1 Sample collection information table

2 方法與結(jié)果

2.1 定量分析

2.1.1 氣相色譜法分離條件 島津GC-2010 Plus氣相色譜儀配置火焰光度檢測(cè)器、磷濾光片、Agilent HP-PLOT/Q-PT毛細(xì)管柱（30 m×0.53 mm，40 μm）；檢測(cè)器溫度250℃；升溫程序?yàn)槌跏?0℃保持10 min，升至200℃保持2 min；進(jìn)樣口溫度220℃，分流進(jìn)樣，分流比10∶1；載氣：高純氮30 mL·min-1，氫氣 62.5 mL·min-1，空氣90 mL·min-1，柱流量 2 mL·min-1。頂空進(jìn)樣器條件：氣相循環(huán)時(shí)間20 min，頂空瓶平衡溫度50℃，平衡時(shí)間10 min，采用振蕩模式。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 磷化氫標(biāo)準(zhǔn)貯備氣體的制備：取磷化鋁片1片，稱(chēng)重為3.232 g，置于600 mL玻璃瓶中，加水10 mL，迅速蓋緊翻蓋橡膠塞密封，室溫下靜置2 d[25]，作為磷化氫標(biāo)準(zhǔn)貯備氣體。用氣體密封針吸取標(biāo)準(zhǔn)貯備氣5.0 mL，注入另一600 mL密封玻璃瓶中，輕輕晃動(dòng)使混合均勻，作為磷化氫標(biāo)準(zhǔn)原氣。用氣體密封針吸取標(biāo)準(zhǔn)原氣1.0 mL，注入另一600 mL密封玻璃瓶中，輕輕晃動(dòng)使混合均勻，作為磷化氫標(biāo)準(zhǔn)氣體。

磷化氫標(biāo)準(zhǔn)貯備氣的含量標(biāo)定：參照SN/T4395—2015中的標(biāo)定方法[26]，在一個(gè)可密封的50 mL試劑瓶中，預(yù)先加入10 mL95%的乙醇和20 mL1.5%的氯化汞溶液，吸取5.0 mL磷化氫標(biāo)準(zhǔn)貯備氣注射到此瓶中，充分振搖后，把瓶口倒置約30 s 使其反應(yīng)完全，用甲基紅作指示劑，用氫氧化鈉滴定液（0.05 mol·L-1）滴定至黃色終點(diǎn)（或電位滴定儀滴定），根據(jù)消耗的氫氧化鈉滴定液的體積計(jì)算出磷化氫標(biāo)準(zhǔn)貯備氣體的含量。標(biāo)定數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 磷化氫標(biāo)準(zhǔn)貯備氣及標(biāo)準(zhǔn)氣體含量Tab 2 Content of standard reserve gas and standard gas of phosphine

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：分別吸取標(biāo)準(zhǔn)氣體0、100、200、500、1000、2000、3000和5000 μL（分別約相當(dāng)于磷化氫0、0.9976、1.9952、4.9880、9.9760、19.9520、29.9280和49.8800 ng）注入預(yù)先加有5.0 mL5%硫酸的20 mL頂空瓶中，渦旋10 s，即得系列對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取供試品粉碎，混勻，精密稱(chēng)取1 g，置20 mL頂空瓶中，加入5.0 mL 5%硫酸溶液，迅速壓蓋封口，渦旋10 s，即得。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 用氣密針吸取標(biāo)準(zhǔn)磷化氫氣體3000 μL（約相當(dāng)于磷化氫30 ng），注入預(yù)先加有5.0 mL 5%硫酸的20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，平行6份，渦旋10 s，進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得磷化氫峰面積RSD為1.3%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下系列對(duì)照品溶液，注入氣相色譜儀測(cè)定。以磷化氫質(zhì)量（ng）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝2.496×105X-2.540×105（r＝0.9966），結(jié)果表明磷化氫在1～50 ng內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.6 專(zhuān)屬性 將未經(jīng)磷化鋁熏制的白芷樣品作為陰性樣品，經(jīng)過(guò)熏制的白芷樣品作為陽(yáng)性樣品，分別取磷化氫標(biāo)準(zhǔn)氣體、陰性樣品、陽(yáng)性樣品各適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備成溶液，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明：陰性樣品溶液色譜圖中未出現(xiàn)與對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰，陽(yáng)性樣品溶液色譜圖中色譜峰保留時(shí)間與對(duì)照品一致，且無(wú)雜質(zhì)峰干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 不同溶液的氣相色譜圖Fig 1 Gas chromatograms of different solutions

2.1.7 檢測(cè)限與定量限測(cè)定 將標(biāo)準(zhǔn)氣體逐步稀釋?zhuān)鶕?jù)磷化氫色譜峰信噪比為S/N≈10，計(jì)算該方法的定量限為0.9976 μg·kg-1；S/N≈3時(shí)計(jì)算該方法檢測(cè)限為0.0665 μg·kg-1。

2.1.8 加樣回收試驗(yàn) 取白芷樣品粉末，稱(chēng)取約0.5 g，置20 mL頂空瓶中，加入5.0 mL5%硫酸溶液，迅速壓蓋封口，分別加入200、300、500μL的磷化氫標(biāo)準(zhǔn)氣體，每個(gè)質(zhì)量濃度平行3份，渦旋10 s，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，低、中、高濃度平均加樣回收率分別為88.9%（RSD＝6.2%）、84.8%（RSD＝1.5%）、82.3%（RSD＝2.1%）。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取經(jīng)磷化鋁熏制的白芷樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、18、24 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得磷化氫峰面積RSD為1.3%，表明溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.10 重復(fù)性試驗(yàn) 取經(jīng)磷化鋁熏制的白芷樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果磷化氫平均含量為0.056 mg·kg-1，RSD為3.8%。

2.2 定性分析

2.2.1 氣相色譜-質(zhì)譜條件 安捷倫7890B-7000D（GS-MS）氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配置安捷倫7697A頂空進(jìn)樣器、Agilent HP-PLOT/Q-PT毛細(xì)管柱（30 m×0.53 mm，40 μm）；色譜柱升溫程序：50℃保持5 min，以50℃·min-1速率升溫至200℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度：200℃；傳輸線溫度：200℃；載氣：氦氣；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比：10∶1；電子轟擊能量：70 eV；離子源溫度：200℃；倍增器電壓：自動(dòng)調(diào)諧值；柱流量：1.0 mL·min-1；質(zhì)量掃描范圍：19～80 amu；掃描方式：離子監(jiān)測(cè)掃描SIM，檢測(cè)離子：m/z31、33、34。

頂空進(jìn)樣器條件：加熱箱溫度50℃，定量環(huán)溫度95℃，傳輸線溫度105℃，氣相循環(huán)時(shí)間20 min，進(jìn)樣瓶加熱平衡時(shí)間10 min，加壓時(shí)間0.2 min，定量環(huán)充滿時(shí)間0.2 min，定量環(huán)平衡時(shí)間0.2 min，進(jìn)樣時(shí)間1.0 min。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 用氣體密封針吸取標(biāo)準(zhǔn)貯備氣0.2 mL，注入預(yù)先加有5.0 mL5%硫酸的20 mL頂空瓶中，渦旋10 s，即得系列對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 同“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法。

2.2.4 檢測(cè)限的測(cè)定 將標(biāo)準(zhǔn)氣體逐步稀釋?zhuān)钡搅谆瘹渖V峰信噪比為S/N≈3時(shí)，計(jì)算出該方法的檢測(cè)限為0.0023 μg·g-1。

2.3 樣品的測(cè)定和檢測(cè)結(jié)果判定

將檢出磷化鋁的陽(yáng)性樣品按“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定。

定量分析采用外標(biāo)法計(jì)算磷化氫含量，為保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性，平行測(cè)定2份，并計(jì)算相對(duì)偏差。如果平行樣相對(duì)偏差≤20%，則認(rèn)為定量數(shù)據(jù)可靠，其含量按2份檢材的平均值計(jì)算。如果平行樣相對(duì)偏差＞20%，則認(rèn)為定量數(shù)據(jù)不可靠，應(yīng)重新檢驗(yàn)。樣品中磷化鋁殘留量檢測(cè)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表3 中藥材、中藥飲片樣品中磷化鋁殘留量檢測(cè)數(shù)據(jù)Tab 3 Aluminum phosphide residues in samples of Chinese medicinal materials and Chinese herbal slices

定性分析中，m/z選擇31、33、34作為監(jiān)測(cè)離子，34的響應(yīng)值相對(duì)比較高，因此選擇34作為特征離子豐度比參考離子。在相同條件下進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)，樣品中磷化氫的色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液一致，且在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中，磷化氫的質(zhì)譜特征離子與標(biāo)準(zhǔn)溶液一致，特征離子豐度比與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液相比，相對(duì)偏差不超過(guò)表4規(guī)定的范圍，空白樣品無(wú)干擾，則可判斷檢材樣品中檢出磷化氫。

表4 特征離子豐度比的最大允許相對(duì)偏差范圍Tab 4 Maximum allowable relative deviation of characteristic ion abundance ratio

檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示，20種中藥材、中藥飲片均有不同程度的磷化鋁殘留檢出。其中，土鱉蟲(chóng)中的檢出率最高，達(dá)到100%；黃芪、款冬花、黨參、瓜蔞、防己、肉蓯蓉、當(dāng)歸、桑白皮、杏仁次之，檢出率達(dá)50% 以上，天花粉、白芷等淀粉含量高的樣品檢出率較低。

基于殘留量數(shù)據(jù)分析可見(jiàn)，殘留量最高的是當(dāng)歸，最大達(dá)到0.4623 mg·kg-1；黃芪次之，最大殘留量為0.0774 mg·kg-1；土鱉蟲(chóng)、桔梗、杏仁較低。由此可見(jiàn)，中藥材部分品種中磷化鋁殘留量高于中國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2021食品中農(nóng)藥最大殘留量國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定中谷物、油料和油脂、蔬菜中磷化鋁殘留量限度0.05 mg·kg-1，也高于歐洲議會(huì)和理事會(huì)規(guī)定的國(guó)際糧食限量標(biāo)準(zhǔn)（0.01 mg·kg-1）及國(guó)際食品法典委員會(huì)針對(duì)干制蔬菜、干制水果、香料等中磷化氫殘留量的限量標(biāo)準(zhǔn)（0.01 mg·kg-1）。

3 討論

3.1 試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用氣相色譜法-火焰光度檢測(cè)器（GSFPD-P）定量、氣相色譜-質(zhì)譜法（GS-MS）定性的設(shè)計(jì)，主要是由于GS-FPD-P對(duì)含磷化合物有高選擇性、高靈敏度，而磷化鋁殘留量是一個(gè)痕量檢測(cè)，因此選擇GS-FPD-P定量更為適宜。然而中藥材種類(lèi)繁多，成分復(fù)雜，GS-FPD-P在定性方面會(huì)受其他一些含磷揮發(fā)性成分的干擾，因此，選擇GS-MS對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)一步確認(rèn)。

3.2 磷化鋁標(biāo)準(zhǔn)氣體的含量標(biāo)定

參照SN/T 4395—2015對(duì)磷化鋁標(biāo)準(zhǔn)氣體含量進(jìn)行標(biāo)定，用甲基紅作指示劑，溶液顏色由橙色變?yōu)辄S色。在實(shí)際操作中，由于橙色與黃色顏色比較接近，目測(cè)觀察顏色突躍有一定困難，影響終點(diǎn)判定，因此建議采用電位滴定法。

3.3 色譜柱的考察

在氣相色譜分析中，為達(dá)到理想的分離效果，考察了4種色譜柱，分別是安捷倫HP-5氣相色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）、HP-PLOT/Q-PT 色譜柱（30 m×0.53 mm，40 μm）、DB-1701色譜柱（30 m×030 m×0.32 mm，0.25 μm）和島津Rtx-624色譜柱（30 m×0.25 mm，1.40 μm）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除HP-PLOT/Q-PT柱外，其他3種色譜柱對(duì)磷化氫均無(wú)保留，出峰時(shí)間均在3 min以?xún)?nèi)，且峰形存在不同程度的分叉；HP-PLOT/Q-PT柱出峰時(shí)間約在8 min左右，峰形光滑對(duì)稱(chēng)，理論板數(shù)高，滿足分析方法需求。

3.4 影響穩(wěn)定性因素

在穩(wěn)定性試驗(yàn)中，溶液在10 h內(nèi)濃度基本穩(wěn)定，10 h后逐漸減小，分析原因可能是由于磷化氫化學(xué)性質(zhì)活潑，能與氧氣發(fā)生反應(yīng)所致。在檢測(cè)中建議供試品溶液在10 h內(nèi)進(jìn)樣。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了HSGC和HSGCMS法測(cè)定20種中藥材中磷化鋁殘留量的方法，該方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，專(zhuān)屬性好，適用于中藥材、中藥飲片中殘留的磷化鋁的檢測(cè)。