劉延鳳,盧紅華,孫建合,伊磊,張貴民

(魯南制藥集團股份有限公司,國家手性制藥工程技術研究中心,山東 臨沂 273400)

西吡氯銨是一種陽離子季銨化合物,用于治療單純性牙齦炎,作為首選機械性去除局部病因的方法,對牙齒無著色,對口腔粘膜無刺激,能減少牙菌斑的形成[1-2]。西吡氯銨以吡啶、氯代十六烷為起始物料,一步反應合成。氯代十六烷為具有警示結構的鹵代烷烴類化合物[3],還可能會引入相近鏈長的氯代十四烷、氯代十五烷、氯代十七烷與氯代十八烷[4]。西吡氯銨含片中氯代烷烴類雜質的研究尚未有文獻報道,其中氯代十六烷既是工藝雜質又是可能產生的降解產物,需要重點關注。根據(jù)人用藥品注冊技術要求國際協(xié)調會(International Conference on Harmonization,ICH)M7[5]指南規(guī)定,單官能團烷基氯化物的TD50在36～108 mg/(kg·d),按更為嚴格的36 mg/(kg·d),根據(jù)西吡氯銨含片的最大日服用量8 mg·d-1,用線性外推法計算,以上氯代烷烴類雜質的限度均不得過標示量的0.45%,嚴控為0.1%。本研究采用氣相色譜-質譜聯(lián)用法(GC-MS)檢測西吡氯銨含片中氯代烷烴類雜質的含量,用萃取法處理樣品,使水溶性好的西吡氯銨和水溶性差的待測成分分別溶于水相和有機相,避免了西吡氯銨進入色譜儀遇熱分解以致待測成分測得量偏離實際值,同時,采用硝酸銀沉降水相中的氯離子,進一步消除了西吡氯銨中十六烷基降解生成氯代十六烷的反應條件。

1 儀器與材料

1.1 儀器

7890B-7000D型氣相色譜質譜儀(美國安捷倫公司);MS205DU型電子分析天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 材料

氯代十四烷對照品(純度:98.3%,阿拉丁試劑有限公司);氯代十五烷對照品(純度:99.4%,山東新時代藥業(yè)有限公司);氯代十六烷對照品(純度:98.0%,上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司);氯代十七烷對照品(純度:99.3%,山東新時代藥業(yè)有限公司);氯代十八烷對照品(純度:98.3%,上海麥克林生化科技股份有限公司);西吡氯銨含片(山東新時代藥業(yè)有限公司,批號220501、220502、220503,含量>98.0%);正己烷(德國默克公司,色譜純);硝酸銀(國藥集團股份有限公司,分析純)。

2 方法與結果

2.1 色譜及質譜條件

色譜柱HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),以5%苯基-95%甲基聚硅氧烷為固定液;初始柱溫為60 ℃,保持1 min后,以30 ℃·min-1的速率升溫至300 ℃,保持3 min;進樣口溫度350 ℃;載氣為氦氣;柱流速1.0 mL·min-1;分流比10∶1;進樣量1 μL。電子轟擊離子化(EI)模式電離,多反應監(jiān)測模式(MRM)定量分析;離子源電壓-70 eV;離子源溫度230 ℃;接口溫度300 ℃;監(jiān)測離子對m/z 91→55。

2.2 溶液配制

2.2.1 空白溶劑

取正己烷作為空白溶劑。

2.2.2 對照品溶液

分別取各雜質對照品約13 mg,精密稱定,置量瓶中,用正己烷定容稀釋制成每1 mL中各約含1.3 μg的混合溶液,作為對照品貯備液。精密量取對照品貯備液0.1 mL,置10 mL量瓶中,用正己烷稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.2.3 供試品溶液

取西吡氯銨含片研細,取細粉約25 mg(相當于西吡氯銨0.067 mg),精密稱定,置具塞玻璃試管中,精密加入5 mL硝酸銀溶液(取硝酸銀約200 mg,置100 mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻),超聲5 min,精密加入5 mL正己烷萃取,取上清液,即得。

2.3 專屬性

取“2.2”項下空白溶劑和對照品溶液,分別依法測定,記錄色譜圖。結果顯示,空白溶劑對待測成分無干擾;對照品溶液中,氯代十四烷的保留時間為8.098 min、氯代十五烷的保留時間為8.489 min、氯代十六烷的保留時間為8.861 min、氯代十七烷的保留時間為9.217 min、氯代十八烷的保留時間為9.574 min,各組分間均能較好分離。

2.4 精密度、重復性試驗

精密量取“2.2”項下對照品貯備液0.1 mL置10 mL量瓶中,用正己烷定量稀釋至刻度,搖勻,重復測定6次,計算氯代十四烷、氯代十五烷、氯代十六烷、氯代十七烷與氯代十八烷峰面積的RSD分別為1.23%,1.08%,1.19%,1.59%與2.01%。結果表明,本法精密度良好。

取西吡氯銨含片(批號220501)細粉約25 mg,精密稱定,置具塞玻璃離心管中,精密加入5 mL硝酸銀溶液,加入對照品貯備液100 μL,超聲5 min,精密加入5 mL正己烷萃取,取上清液,平行配制6份,依法測定。氯代十四烷、氯代十五烷、氯代十六烷、氯代十七烷與氯代十八烷測得含量的RSD分別為0.097%,0.10%,0.13%,0.06%與0.22%。結果表明,本法重復性良好。

2.5 線性與范圍

精密量取對照品貯備液1 mL置10 mL量瓶中,用正己烷定量稀釋至刻度,搖勻,作為線性貯備液。精密量取線性貯備液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mL分別置10 mL量瓶中,用正己烷稀釋至刻度,搖勻,作為線性系列標準溶液。分別依法測定,記錄色譜圖。以各組分的質量濃度c(ng·mL-1)為橫坐標,峰面積A為縱坐標進行線性回歸,回歸方程為氯代十四烷:A=22.296c+1.623,r=0.999 9;氯代十五烷:A=16.256c+0.393,r=0.999 8;氯代十六烷:A=10.528c+3.443,r=0.999 6;氯代十七烷:A=6.967c-0.312,r=0.999 8;氯代十八烷:A=5.337c-2.148,r=0.999 7。結果表明,待測成分在質量濃度2.6～26 ng·mL-1內,線性關系良好。

2.6 回收率

取西吡氯銨含片(批號220501)細粉約25 mg,精密稱定,置具塞玻璃離心管中,精密加入5 mL硝酸銀溶液,分別加入對照品貯備液80,100,120 μL,超聲5 min,分別精密加入5 mL正己烷萃取,取上清液,作為80%～120%回收率試驗溶液,每個濃度制備三份。分別依法測定,記錄各成分的峰面積。結果顯示,各成分的平均回收率(n=9)與RSD分別為氯代十四烷:101.28%,2.89%;氯代十五烷:101.96%,3.39%;氯代十六烷:102.02%,2.1%;氯代十七烷:101.30%,3.1%;氯代十八烷:102.55%,3.8%;方法準確度高。

2.7 定量限與檢測限

取各成分對照品溶液逐級稀釋,分別以信噪比S/N為10和3時的溶液作為定量限溶液與檢測限溶液。定量限溶液重復測定6次,氯代十四烷、氯代十五烷、氯代十六烷、氯代十七烷和氯代十八烷峰面積的RSD(n=6)依次為:3.1%,3.2%,3.5%,3.1%和3.0%;定量限質量濃度依次為0.82,1.27,1.35,3.54和4.39 ng·mL-1;檢測限質量濃度依次為0.41,0.64,0.68,1.77和2.20 ng·mL-1;表明本法靈敏度高。

2.8 穩(wěn)定性

取“2.2”項下對照品溶液與供試品溶液,分別于室溫放置0,2,4,6,8,10,12 h時,按“2.1”項下條件進樣測定。結果顯示,12 h內待測成分峰面積的RSD均小于10.0%,保留時間的RSD均小于2.0%,表明對照品溶液與供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

2.9 耐用性

先后改變初始柱溫(58,62 ℃)、升溫速率(28,32 ℃·min-1)、柱流速(0.9,1.1 mL·min-1),取“2.2”項下空白溶劑、對照品溶液與100%回收率溶液,分別依法測定,考察樣品中待測成分檢出情況。結果表明,不同耐用性條件下,待測成分檢出結果與標準條件無明顯差異,耐用性好。

2.10 樣品測定

取三批樣品,按“2.2”項下方法配制對照品溶液與供試品溶液,按“2.1”項下條件進樣測定,按外標法以峰面積計算。圖1結果顯示三批樣品中待測成分均未檢出。

圖1 典型色譜圖

3 結論

西吡氯銨含片中載藥量較低,受輔料影響,難以配制得到含較高濃度西吡氯銨的樣品,采用液相色譜法、氣相色譜法靈敏度均不能達到檢測要求。采用氣質聯(lián)用法,隨進樣口溫度升高,氯代十六烷的檢出含量逐漸增大,表明樣品在較高的汽化溫度下降解;而進樣口溫度太低,沸點較高的待測成分不能完全汽化,重復性差。本研究中,創(chuàng)新性地采用萃取法配制樣品,利用西吡氯銨與氯代烷烴類雜質的溶解性差異,使兩者分置兩相溶液中,取含有待測組分的有機相作為供試品溶液,既避免了樣品降解對測定結果的干擾,又可達到準確檢驗待測組分的目的。于水相中加入硝酸銀,使氯離子沉降,消除了樣品降解的條件,同時,鹽析效應提高了萃取效率。經試驗,對照品溶液萃取前后待測成分的濃度無明顯差異,回收率接近100%,表明待測成分可被充分萃取進入有機相。采用離子監(jiān)測模式對本法的線性與范圍、精密度、回收率、定量限與檢測限、溶液穩(wěn)定性進行了驗證,結果顯示,本法的準確性好、靈敏度高、溶液穩(wěn)定性好,可用于西吡氯銨含片中氯代烷烴類雜質的檢測。