趙 然，史文軍，王李寶，黎 慧，于志君，胡潤(rùn)豪，吳旭干，沈 輝，喬 毅，成 婕，蔣 葛，萬(wàn)夕和*

(1.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；2.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007)

脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)又名小白蝦、五須蝦，屬于甲殼亞門(Crustacea)十足目(Decapoda)長(zhǎng)臂蝦科(Palaemonidae)，由于其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，生長(zhǎng)速率快、繁殖能力強(qiáng)、適應(yīng)性廣且具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]，在江蘇沿海地區(qū)得到了快速?gòu)V泛的推廣，是我國(guó)特有的經(jīng)濟(jì)蝦類之一[2]。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的逐年擴(kuò)大，脊尾白蝦的病害問(wèn)題也愈加嚴(yán)重，近年來(lái)不斷有脊尾白蝦受不同病原危害造成養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)損失的報(bào)道，如偷死野田村病毒(Covert Mortality Nodavirus，CMNV)、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、血卵渦鞭蟲(chóng)(Hematodinuimsp.)、白斑綜合征病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)等，其中以白斑綜合征為甚，常暴發(fā)于8 月和9 月，患病池塘脊尾白蝦死亡率可達(dá)60%以上[3-9]。

自2018 年冬季以來(lái)，江蘇沿海地區(qū)池塘養(yǎng)殖的脊尾白蝦開(kāi)始出現(xiàn)一種不明原因的疾病，病蝦表現(xiàn)為僵尸狀，當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶稱之為“僵尸病”，患病脊尾白蝦體色泛紅，肌肉渾濁，反應(yīng)遲鈍，攝食減少，頭胸甲下蓄積大量乳白色液體，病蝦離水后較快死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。為更好地對(duì)該病進(jìn)行防控，實(shí)驗(yàn)對(duì)患病脊尾白蝦進(jìn)行了流行病學(xué)及病理學(xué)研究，同時(shí)開(kāi)展了病原的分離、回感及鑒定，確認(rèn)了該病的病原。相關(guān)研究結(jié)果為江蘇沿海脊尾白蝦“僵尸病”的防治提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

病原、病理學(xué)研究用樣品為2021 年3 月于江蘇省啟東黃海灘涂開(kāi)發(fā)有限公司養(yǎng)殖區(qū)采集具有典型“僵尸病”病癥的瀕死患病脊尾白蝦，對(duì)病蝦采集后低溫冷藏保存，分別用于病原分離、組織切片和透射電鏡觀察。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作人員嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)范，并按照上海海洋大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.2 流行病學(xué)調(diào)查

2018—2021 每年11 月—次年5 月，于江蘇沿海脊尾白蝦主養(yǎng)區(qū)啟東、通州灣、如東、東臺(tái)、大豐和濱海等地實(shí)地走訪，調(diào)研脊尾白蝦“僵尸病”發(fā)病特征、發(fā)病時(shí)間和發(fā)病率等情況。

1.3 病理學(xué)研究

組織病理學(xué) 取經(jīng)10%甲醛溶液固定的正常與患病脊尾白蝦肝胰腺、鰓和肌肉組織樣品，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(H.E)染色，光學(xué)顯微鏡觀察組織病理變化情況。

細(xì)胞病理學(xué) 取經(jīng)2.5%電鏡用戊二醛固定的患病脊尾白蝦肝胰腺、鰓和肌肉組織樣品，磷酸漂洗液漂洗3 次，1%鋨酸4 °C 固定2 h；ddH2O 漂洗3 次后乙醇梯度脫水，脫水濃度梯度為30%、50%、70%、80%、95%、100% (2 次)，每次 15 min，環(huán)氧丙烷過(guò)渡，812 樹(shù)脂梯度滲透后包埋，60 °C 聚合，包埋塊用Leica UC7 型超薄切片機(jī)進(jìn)行半薄定位及超薄切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色切片，用透射電鏡觀察組織超微結(jié)構(gòu)。

1.4 病原體分離、回感及鑒定實(shí)驗(yàn)

病原菌分離與純化 用75%乙醇擦拭典型患病脊尾白蝦體表，無(wú)菌操作下取其血淋巴液接種于LB 培養(yǎng)基27 °C 培養(yǎng)48 h 后，平板上生長(zhǎng)出均一菌落，顯微鏡下表現(xiàn)為酵母形態(tài)。經(jīng)劃線純化并接種PDA 平板再次純培養(yǎng)，用PDA 液體培養(yǎng)基27 °C 振蕩培養(yǎng)，收集菌液與60%甘油，按體積比為3∶1 的比例混合，-80 °C 保存?zhèn)溆谩?/p>

人工回感實(shí)驗(yàn) 健康脊尾白蝦取自江蘇省海洋水產(chǎn)研究所如東海水蝦類良種基地，經(jīng)檢測(cè)無(wú)病原。隨機(jī)挑選1 000 尾規(guī)格相近，平均體長(zhǎng)(5.5±0.5) cm，平均體重(2.8±0.6) g，健康、活力好的個(gè)體于室內(nèi)水泥池暫養(yǎng)。暫養(yǎng)用水為經(jīng)過(guò)濾、消毒沉降1 周的自然海水，鹽度25、水溫(18.0±0.5) °C。每天換水1/3，投喂適量商品配合飼料。取暫養(yǎng)1 周的健康脊尾白蝦進(jìn)行回感實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)采用注射法。將分離純化后的菌株于PDA 液體培養(yǎng)基27 °C 培養(yǎng)36 h，混勻后，取5 mL 菌液于已滅菌的離心管中，2 000 r/min、4 °C、離心3 min后去上清液，然后加等體積滅菌生理鹽水漂洗，相同條件下離心，去上清液，重復(fù)漂洗3 次后獲得注射用原菌液，4 °C 保存?zhèn)溆?。用滅菌生理鹽水將原菌液分別稀釋4、8 和16 倍后進(jìn)行注射，濃度分別為1.29×109、6.46×108和3.23×108CFU/mL，注射劑量為20 μL/尾，每組200 尾蝦；對(duì)照組注射等量滅菌生理鹽水。注射后各組脊尾白蝦分別暫養(yǎng)于500 L PVC 塑料桶中，暫養(yǎng)用水為經(jīng)過(guò)濾、消毒沉降1 周的自然海水，鹽度25、水溫(18.0±0.5) °C。每天換水1/3，投喂適量的商品配合飼料?；馗袑?shí)驗(yàn)期間，各組所用設(shè)備均獨(dú)立使用，嚴(yán)禁混用，每天觀察并記錄脊尾白蝦的癥狀與死亡情況，對(duì)出現(xiàn)癥狀明顯的患病白蝦進(jìn)行病原分離鑒定。采用改良寇氏法計(jì)算分離菌株對(duì)脊尾白蝦的半致死量：

式中，Xk為死亡率最高組的對(duì)數(shù)劑量，d為對(duì)數(shù)組距，ΣP為各組死亡率之和。

病原菌掃描電鏡觀察 取分離純化后的病原菌樣品置于2.5%戊二醛中固定2～4 h，磷酸漂洗液漂洗3 次，1%鋨酸4 °C 固定2 h；雙蒸水漂洗3 次后乙醇梯度脫水，脫水濃度梯度為30%、50%、70%、85%、95%、100% (2 次)，每次 15 min，醋酸異戊酯置換，臨界點(diǎn)干燥儀干燥及離子濺射儀鍍膜后，樣品置于掃描電鏡臺(tái)上，轉(zhuǎn)移進(jìn)入樣品艙，HITACHI Regulus 8100 型掃描電鏡拍照。

病原菌分子生物學(xué)鑒定 離心收集上述分離純化后的菌株，用酵母DNA 抽提試劑盒(Solarbio，中國(guó))提取病菌的總基因組DNA 作為PCR模板。采用SSU 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，上游引物SSUF: 5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′；下游引物SSUR: 5′-TGATCCTCCTGCAGGTTCAC CTAC-3′。30 μL 反應(yīng)體系：上下游引物各1.0 μL，DNA 模板1.0 μL，PCR Premix 15.0 μL，ddH2O 補(bǔ)足至30 μL。反應(yīng)條件：94 °C 預(yù)變性10 min；94 °C變性30 s，59 °C 退火30 s，72 °C 延伸1 min，循環(huán)35 次；72 °C 終延伸10 min。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，預(yù)計(jì)片段大小約1 700 bp。模板擴(kuò)增純化產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將病原菌株18SrRNA基因序列提交至GenBank，并將數(shù)據(jù)與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，選擇相似度較高的序列和不同種屬的序列，使用MEGA 7.0 軟件采用Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

患“僵尸病”脊尾白蝦的主要癥狀 患病脊尾白蝦表現(xiàn)出攝食下降或停止攝食、行動(dòng)緩慢、反應(yīng)遲鈍，離水不久便會(huì)死亡?；疾〖刮舶孜r體表泛紅，附肢腫大呈白濁狀，頭胸甲與附肢連結(jié)處呈腫脹突出，打開(kāi)頭胸甲發(fā)現(xiàn)肝胰腺糜爛，內(nèi)部有大量乳白色組織滲出液聚集，肌肉出現(xiàn)不同程度的液化，呈不透明的白色，血淋巴液也由正常時(shí)的透明色轉(zhuǎn)變?yōu)槿榘咨?圖版Ⅰ)。

主要流行病學(xué)特點(diǎn) 脊尾白蝦“僵尸病”于2018 年冬季開(kāi)始在啟東黃海灘涂開(kāi)發(fā)有限公司養(yǎng)殖區(qū)首先出現(xiàn)，呈慢性傳播，病情向鄰近地區(qū)蔓延特點(diǎn)明顯，上年發(fā)病的池塘下年一般都會(huì)復(fù)發(fā)。周年跟蹤調(diào)查顯示，脊尾白蝦“僵尸病”發(fā)生的主要流行時(shí)間從11 月開(kāi)始即可被發(fā)現(xiàn)，一直到次年5 月，其中高峰期多為2—5 月，此期間海水溫度為15～22 °C。從2018 年冬季到2021 年春季，該病的發(fā)生越來(lái)越嚴(yán)重，特別是在脊尾白蝦主產(chǎn)區(qū)啟東、東臺(tái)等地；發(fā)病率一般為5%～30%，死亡率為3%～10%。該病主要感染個(gè)體比較大的脊尾白蝦，夏季或早秋無(wú)該病的發(fā)生。江蘇北部沿海脊尾白蝦與貝類混養(yǎng)模式中未見(jiàn)發(fā)生。相關(guān)調(diào)查結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 近3 年江蘇沿海地區(qū)脊尾白蝦“僵尸病”發(fā)病率及死亡率調(diào)查情況Tab.1 Incidence of "zombie disease" and mortality of E.carinicauda in coastal areas of Jiangsu Province in the past three years %

2.2 病理學(xué)

圖版Ⅰ 患病脊尾白蝦癥狀1.自然患病脊尾白蝦和健康脊尾白蝦的對(duì)比圖，病蝦附肢腫大呈白濁狀(→)；2.肝胰腺糜爛(→)；3.頭胸甲下蓄積大量乳白色組織滲出液(→)；4.剪斷尾柄可見(jiàn)乳白色血淋巴流出(→)。圖中左邊均為患病脊尾白蝦，右邊為健康脊尾白蝦。Plate Ⅰ Symptoms of diseased E.carinicauda1.comparison of naturally diseased and healthy E.carinicauda,the appendages of diseased E.carinicauda were swollen,white and cloudy;2.the hepatopancreas was erosive (→);3.a large amount of milky tissue exudate accumulates under carapace (→);4.milky haemolymph was seen when the tail handle was cut off (→).The diseased E.carinicauda on the left and healthy E.carinicauda on the right.

組織切片觀察 脊尾白蝦鰓由鰓絲和鰓軸組成，健康脊尾白蝦的組織切片結(jié)果顯示，肌肉中肌纖維呈彎曲狀緊密排列，肌束間隙較?。桓我认傩」苄螤顖A潤(rùn)，排列緊密，管腔橫截面呈不規(guī)則多角形，各小管之間存在結(jié)締組織，功能性細(xì)胞均清晰可見(jiàn)。

患病脊尾白蝦的組織切片觀察結(jié)果顯示，病蝦的鰓絲較腫大，鰓腔出現(xiàn)空泡變性，部分鰓腔中定殖了大量的酵母，鰓軸中大量細(xì)胞破碎，無(wú)明顯細(xì)胞結(jié)構(gòu)；肌纖維排列較為松散，失去原有彎曲排列形態(tài)，肌束間隙變大；肝胰腺小管出現(xiàn)空泡化，基膜破裂，管腔體積變大，各小管之間排列松散，并發(fā)現(xiàn)大量定殖的菌體(圖版Ⅱ)。

透射電鏡觀察 組織透射電鏡結(jié)果顯示，在患病脊尾白蝦鰓絲基膜內(nèi)有酵母的存在，大小形態(tài)均與致病菌掃描電鏡結(jié)果一致；在肌肉中細(xì)胞核染色質(zhì)呈半月?tīng)罹奂诤四じ浇?，形成?xì)胞凋亡的特征，肌漿網(wǎng)呈囊泡化擴(kuò)張，肌絲結(jié)構(gòu)紊亂，部分肌絲溶解斷裂。在肝胰腺中，肝小管基膜外存在大量酵母菌，這與組織病理學(xué)結(jié)果一致，還發(fā)現(xiàn)肝胰腺分泌細(xì)胞中線粒體腫脹空泡化，殘存線粒體腔，其中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也表現(xiàn)出囊泡化擴(kuò)張(圖版Ⅲ)。

2.3 病原學(xué)研究結(jié)果

病原菌分離 在LB 培養(yǎng)基上，從患病脊尾白蝦血淋巴中分離得到了一株優(yōu)勢(shì)菌，優(yōu)勢(shì)度大于95%，在PDA 培養(yǎng)基上對(duì)該菌進(jìn)行純化培養(yǎng)，生長(zhǎng)表現(xiàn)良好，命名為MQ2101。27 °C 條件下培養(yǎng)48 h 后能形成直徑為1～3 mm 的米黃色隆起菌落，邊緣整齊(圖1)。

圖1 PDA 培養(yǎng)基上菌株MQ2101 的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain MQ2101 on PDA plate

人工回感實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組中3 組均在感染第1 天出現(xiàn)死亡，1/4 原菌液組第5 天全部死亡，7 d后各組存活率分別為0%、5%和11.5%。對(duì)照組在7 d 內(nèi)均未死亡，存活率為100% (圖2)。人工回感后的脊尾白蝦表現(xiàn)出與自然患病白蝦相同的癥狀(圖版Ⅳ)，且從回感染后脊尾白蝦中也分離出了一株優(yōu)勢(shì)菌，與菌株MQ2101 的菌落形態(tài)、生長(zhǎng)特性完全一致，表明分離得到的菌株MQ2101為脊尾白蝦“僵尸病”病原菌，且對(duì)脊尾白蝦具有較強(qiáng)的致病性。

圖2 菌株MQ2101 人工回感實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Artificial infection results of the strain MQ2101

圖版Ⅱ 患“僵尸病”脊尾白蝦組織病理學(xué)觀察1.健康脊尾白蝦鰓組織切片；2.患病脊尾白蝦鰓組織切片，鰓腔出現(xiàn)空泡化(→)，定殖在鰓絲中的菌體(〇)；3.健康脊尾白蝦肌肉切片；4.患病脊尾白蝦肌肉組織切片，肌纖維排列較為松散，呈直線狀排列(〇)；5.健康脊尾白蝦肝胰腺切片；6.患病脊尾白蝦肝胰腺切片，肝胰腺中肝胰腺小管出現(xiàn)空泡化(→)，管腔體積變大(▲)，發(fā)現(xiàn)大量定殖的菌體(〇)。Plate Ⅱ Histopathological observation of diseased E.carinicauda1.pathohistological observation of gill from healthy E.carinicauda;2.pathohistological observation of gill from diseased E.carinicauda.Vacuolization appeared in the gill cavity (→),and the bacteria colonized in gill filament (〇);3.pathohistological observation of muscle from healthy E.carinicauda;4.pathohistological observation of muscle from diseased E.carinicauda.The muscle fibers arranged loosely and arranged in a straight line (〇);5.pathohistological observation of hepatopancrea from healthy E.carinicauda;6.pathohistological observation of hepatopancrea from diseased E.carinicauda,the hepatopancrea tubules in the hepatopancreas became vacuolated (→),the lumen volume became larger (▲),a large number of colonized bacteria were found (〇).

圖版Ⅲ 患“僵尸病”脊尾白蝦組織透射電鏡觀察1，2.鰓中鰓絲基膜內(nèi)部存在菌體(→)；3.肌細(xì)胞細(xì)胞核中染色質(zhì)呈半月?tīng)罹奂诤四じ浇?→)，肌漿網(wǎng)呈囊泡化擴(kuò)張(▲)；4.肌絲結(jié)構(gòu)紊亂，部分肌絲溶解斷裂(〇)；5.肝小管基膜外聚集了大量菌體，部分正在進(jìn)行出芽繁殖(→)；6.肝胰腺分泌細(xì)胞中線粒體空泡化，殘存線粒體腔(→)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈囊泡化擴(kuò)張(〇)。Plate Ⅲ Transmission electron microscopic observation on the tissue of diseased E.carinicauda1 and 2.there were bacteria in the basement membrane in the gill filament(→);3.the chromatin in the nucleu of the muscle cell was gathered around the nuclear membrane in a semilunar shape (→),the sarcoplasmic reticulum was vesicled and expanded (▲);4.myofilament structure was disordered,and some myofilaments were dissolved and broken (〇);5.a large number of bacteria accumulated outside the basement membrane of the liver tubule,and some were undergoing budding reproduction(→);6.mitochondria in secretory cell of the hepatopancrea were vacuolated (→),and the endoplasmic reticulum were vesicularized and expanded (〇).

根據(jù)人工回感實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用改良寇氏法初步計(jì)算脊尾白蝦在注射菌株MQ2101 后3 d 時(shí)的LD50=1.39×107CFU/尾。

掃描電鏡觀察 菌株MQ2101 的掃描電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌體呈橢圓形，繁殖方式為出芽繁殖，在部分菌體表面發(fā)現(xiàn)多重出芽留下的芽痕，表現(xiàn)出酵母的形態(tài)。從視野中隨機(jī)選取10 個(gè)菌體測(cè)量大小，結(jié)果顯示，單個(gè)菌體長(zhǎng)度為(1.53～2.88) μm，平均長(zhǎng)度為(1.96±0.43) μm，寬度為(0.9～1.44) μm，平均寬度為(1.23±0.17) μm (圖版Ⅴ)。

病原菌分子生物學(xué)鑒定 通過(guò)SSU 引物對(duì)MQ2101 菌株進(jìn)行特異性擴(kuò)增，獲得的目的片段長(zhǎng)度為1 703 bp。將基因序列提交至GenBank，登錄號(hào)為MW876247.1。對(duì)目的序列進(jìn)行BLASTN比對(duì)，結(jié)果顯示菌株MQ2101 與二尖梅奇酵母(Metschnikowia bicuspidata)一致性高達(dá)99.82%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示，MQ2101 菌株與二尖梅奇酵母自然聚為一支，親緣關(guān)系較近(圖3)，結(jié)合該菌體的形態(tài)及其大小特點(diǎn)，判定菌株MQ2101 為二尖梅奇酵母。

圖版Ⅴ 菌株MQ2101 掃描電鏡觀察1.正在進(jìn)行出芽繁殖的酵母(→)，出芽繁殖后留在酵母表面突出的芽痕(▲)；2.測(cè)量菌體的長(zhǎng)度、寬度。Plate Ⅴ Scanning electron microscope photograph of strain MQ21011.yeast undergoing budding reproduction (→),the bud scar left on the surface of the yeast after budding reproduction (▲);2.measuring the length and width of the bacteria.

圖版Ⅳ 自然感染與人工回感的脊尾白蝦1.自然發(fā)病(左)與健康(右)脊尾白蝦；2.人工回感組(左)與對(duì)照組(右)的脊尾白蝦。Plate Ⅳ E.carinicauda of natural infection and artificial re-pathogenic1.naturally infected (left) and healthy E.carinicauda (right);2.E.carinicauda of artificial infection group (left) and control group (right).

3 討論

脊尾白蝦“僵尸病”是近幾年來(lái)在江蘇沿海盛行的一種疾病，發(fā)病季節(jié)主要集中在冬春之交?；疾〖刮舶孜r主要表現(xiàn)出體色發(fā)紅、反應(yīng)遲鈍、攝食下降，打開(kāi)頭胸甲能發(fā)現(xiàn)有大量乳白色液體蓄積。這種癥狀與2008 年許文軍等[10]在浙江地區(qū)發(fā)現(xiàn)的患“白濁病”脊尾白蝦較為相似，患“白濁病”脊尾白蝦游動(dòng)緩慢，體色發(fā)白，打開(kāi)頭胸甲可以發(fā)現(xiàn)肝胰腺糜爛，血淋巴液呈濁白色，其病原經(jīng)鑒定為血卵渦鞭蟲(chóng)(Hematodiniumsp.)，是一種寄生在海水甲殼類中的腰鞭蟲(chóng)，能大量寄生于甲殼類動(dòng)物的血腔、肌肉和肝胰腺中[11]。但由血卵渦鞭蟲(chóng)引起的脊尾白蝦“白濁病”主要暴發(fā)于夏季高溫季節(jié)，冬季幾乎檢測(cè)不到發(fā)病，因此，江蘇沿海地區(qū)脊尾白蝦“僵尸病”與浙江脊尾白蝦的白濁病流行病學(xué)特點(diǎn)有明顯差異。本研究從患病脊尾白蝦血淋巴中分離純化出菌株MQ2101，經(jīng)回感實(shí)驗(yàn)確定了其為脊尾白蝦“僵尸病”的病原菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和18SrRNA序列擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定其為二尖梅奇酵母，這是首次發(fā)現(xiàn)二尖梅奇酵母在海水脊尾白蝦養(yǎng)殖中具有致病性的報(bào)道。

酵母是一種單細(xì)胞真核微生物，屬兼性厭氧菌[12]。一些有益酵母菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中也常被當(dāng)作飼料添加劑使用[13-14]，而有關(guān)水產(chǎn)動(dòng)物酵母菌致病的案例也有研究報(bào)道。目前已知的水產(chǎn)動(dòng)物致病酵母有葡萄牙假絲酵母(Candida lusitaniae)[15]、莫格球擬酵母(Torulopsis mogii)[16]、漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)[17]等。葡萄牙假絲酵母可以侵染三疣梭子蟹使其患乳化病，病蟹蟹體消瘦，各組織乳化嚴(yán)重，發(fā)病死亡率可達(dá)40%。莫格球擬酵母感染羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)主要暴發(fā)于親蝦越冬時(shí)，病蝦步足發(fā)紅、肝胰腺糜爛，死亡率可達(dá)90%。漢遜德巴利酵母感染羅氏沼蝦發(fā)生于12 月—次年2 月，病蝦體色泛黃，全身肌肉和血淋巴呈白濁狀。本研究所分離出的致病酵母為二尖梅奇酵母，是梅奇酵母屬的一種，與其同屬的美極梅奇酵母(M.pulcherrima)有較強(qiáng)的生物拮抗功能，能夠抑制芒果炭疽病的發(fā)生[18]，梅奇酵母XY201 (M.zizyphicola)則常被用來(lái)抑制冬棗采后的病原真菌[19]。關(guān)于二尖梅奇酵母作為病原菌的案例也有報(bào)道，2003 年在臺(tái)灣省就有報(bào)道二尖梅奇酵母與屎腸球菌(Enterococcus faecium)混合感染羅氏沼蝦[20]，發(fā)病時(shí)間集中在10 月—次年3 月，最高死亡率達(dá)到48%，平均死亡率為25%，病蝦表現(xiàn)為食欲不振，體色呈黃褐色，肝胰腺腫大，肌肉渾濁，血淋巴呈乳白色，在肌肉組織中還發(fā)現(xiàn)了大小不同的淡黃色斑點(diǎn)。同年又有報(bào)道二尖梅奇酵母作為單獨(dú)致病菌致使大鱗鉤吻鮭(Oncorhynchus tshawytscha)患病死亡[21]，主要是由于捕食感染二尖梅奇酵母的成年鹵蟲(chóng)而患病，死亡率達(dá)到34%，在病魚(yú)內(nèi)臟中發(fā)現(xiàn)大量白色黏連與腫塊，內(nèi)臟與腹腔有大量酵母細(xì)胞聚集。2020 年4 月，遼寧省發(fā)生中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)患“牛奶病”[22-23]，總體發(fā)病率達(dá)30%，病蟹活力較差，步足發(fā)白易脫落，打開(kāi)頭胸甲可見(jiàn)明顯白色牛奶狀液體，經(jīng)鑒定該病病原也為二尖梅奇酵母。結(jié)合此次研究可以發(fā)現(xiàn)，二尖梅奇酵母感染甲殼類動(dòng)物多發(fā)于低溫季節(jié)(10 月—次年5 月)，這是目前已報(bào)道的二尖梅奇酵母感染性疾病的共同特點(diǎn)。

有關(guān)脊尾白蝦中二尖梅奇酵母的的致病機(jī)制和其在養(yǎng)殖環(huán)境中的感染傳播途徑及具體的防治措施都尚不明確，有待進(jìn)一步研究。Chen 等[24]提出酵母是在池塘水或沉積物中通過(guò)與蝦口或鰓的接觸而進(jìn)入蝦體內(nèi)，被宿主血淋巴吞噬并包裹在膜狀液泡內(nèi)，在有限的復(fù)制條件下保持存活，當(dāng)水溫降低時(shí)宿主對(duì)酵母的易感性提高，酵母就在血淋巴中快速繁殖，最終溶解并大量釋放酵母細(xì)胞。在蝦血淋巴中發(fā)現(xiàn)的非常高濃度的酵母細(xì)胞也證實(shí)了這一點(diǎn)，低水溫下蝦體對(duì)酵母的易感性也解釋了為何白蝦在冬季才開(kāi)始大規(guī)模暴發(fā)“僵尸病”。Moore 等[21]認(rèn)為大鱗鉤吻鮭是通過(guò)攝食感染二尖梅奇酵母的成年鹵蟲(chóng)而患病，酵母通過(guò)鹵蟲(chóng)作為介質(zhì)進(jìn)入魚(yú)體腸道內(nèi)，在腸道內(nèi)成熟，通過(guò)開(kāi)裂的方式主動(dòng)釋放針狀子囊孢子，針尖狀的形態(tài)賦予了子囊穿透宿主腸內(nèi)層的能力，這就使得酵母從腸道開(kāi)始滲透感染，最后蔓延到全身。脊尾白蝦出現(xiàn)“僵尸病”典型癥狀時(shí)，已經(jīng)進(jìn)入感染后期，增加了該病的治療難度。建議養(yǎng)殖過(guò)程中加強(qiáng)預(yù)防意識(shí)，貫徹防大于治的原則，選擇優(yōu)質(zhì)苗種，加強(qiáng)投喂管理，密切關(guān)注環(huán)境溫度，保持養(yǎng)殖水體穩(wěn)定平衡，實(shí)施養(yǎng)殖環(huán)境生態(tài)調(diào)控，另外可以投放一些肉食性魚(yú)類，捕食感染的病蝦，切斷傳播鏈，實(shí)現(xiàn)脊尾白蝦的健康養(yǎng)殖。

（作者聲明本文無(wú)實(shí)際或潛在的利益沖突）