許青松，李 兵，楊冰慧，馬金龍，洋 雯，曲 琛

(1.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600；2.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023)

Akt 又稱為蛋白激酶B (PKB)，是一種絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)蛋白激酶，在人類和小鼠中發(fā)現(xiàn)Akt 有3 種異構(gòu)體(Akt1、Akt2 和Akt3)，它們均具有高度保守的氨基酸末端pleckstrin 同源(PH)結(jié)構(gòu)域、中央激酶結(jié)構(gòu)域及包含疏水基序的羧基末端調(diào)節(jié)域，作為PI3K-AKT 信號通路的核心分子，Akt 可以激活下游多種轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞增殖、代謝、發(fā)育和存活等過程中發(fā)揮著重要作用[1]。Akt 分子的功能在癌癥發(fā)展、神經(jīng)退行性疾病、中風(fēng)和糖尿病中被普遍研究，甚至作為一些藥物潛在靶點(diǎn)被應(yīng)用于治療過程中[2]。

Akt 分子結(jié)構(gòu)和功能在水產(chǎn)動(dòng)物領(lǐng)域中的研究相對滯后，大多停留在基因的序列特征、進(jìn)化特點(diǎn)、基因克隆表達(dá)和初步功能分析[3]。諶爽等[4]在斑馬魚(Danio rerio)中成功克隆獲得了Akt基因(Akt3)，分析了其序列同源性、進(jìn)化特性，以及在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中的功能，發(fā)現(xiàn)注射Akt 后斑馬魚胚胎腦部厚度比對照組顯著增加，表明Akt 對斑馬魚胚胎腦部尺寸發(fā)育有影響。王金鳳等[5]在斑馬魚、草魚(Ctenopharyngodon idella)和尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)中研究了低溫脅迫對魚類PI3K/AKT/GSK-3β 信號通路的影響，發(fā)現(xiàn)低溫激活了PI3K/AKT/GSK-3β 信號通路，不同低溫耐受能力的魚對信號通路的響應(yīng)呈現(xiàn)出不同的情況。Wang 等[6]在香港牡蠣(Crassostrea hongkongensis)中克隆獲得了Akt基因(ChAkt1)，其廣泛表達(dá)于牡蠣胚胎形成和幼蟲發(fā)育的不同組織中，ChAkt1 在牡蠣?wèi)?yīng)對各種刺激、微生物病原體和高溫脅迫中發(fā)揮著重要作用。劉麗等[7]在仿刺參(Apostichopus japonicus)中成功克隆獲得了Akt基因(AjAkt)，并對該基因的序列特征、組織表達(dá)規(guī)律以及對燦爛弧菌(Vibrio splendidus)刺激的響應(yīng)規(guī)律進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)AjAkt基因在仿刺參機(jī)體調(diào)控細(xì)菌入侵的免疫防御中發(fā)揮重要作用。Zhou 等[8]在羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)中成功克隆獲得了Akt基因(MrAkt)，發(fā)現(xiàn)該基因在氨基氮或亞硝酸鹽急性應(yīng)激過程中高表達(dá)，為PI3K-AKT 途徑參與對蝦應(yīng)對亞硝酸鹽和氨脅迫的免疫毒理反應(yīng)提供了證據(jù)。田志環(huán)等[9]在中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)中克隆獲得Akt基因(EsAkt)的cDNA 序列，主要研究了EsAkt基因?qū)χ腥A絨螯蟹蛻殼前后肌肉生長的影響，發(fā)現(xiàn)EsAkt在蟹蛻殼過程中不同部位肌肉組織中的表達(dá)量差異與蛻殼周期關(guān)系密切，說明EsAkt參與中華絨螯蟹蛻殼引起的肌肉萎縮、生長及重建的生理過程。然而Akt基因在中華絨螯蟹免疫過程中如何發(fā)揮作用卻未見報(bào)道，本研究利用分子手段克隆獲得了中華絨螯蟹Akt基因，研究其在不同的免疫器官和組織中的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)定位，以及對脂多糖和嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的免疫響應(yīng)情況，為深入探究中華絨螯蟹免疫防御機(jī)制提供新的借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

中華絨螯蟹購自江蘇連云港中華絨螯蟹養(yǎng)殖場，在18～20 °C 的淡水中暫養(yǎng)，每天定時(shí)換水并投喂適當(dāng)?shù)酿D料，暫養(yǎng)7 d 后用于實(shí)驗(yàn)。6 周齡雌性昆明小鼠購于大連醫(yī)科大學(xué)，暫養(yǎng)7 d 后用于多克隆抗體的制備。嗜水氣單胞菌由大連海洋大學(xué)葉仕根博士提供，脂多糖(LPS)和大腸桿菌(Escherichia coli) 0111:B4 購自Sigma Aldrich 公司。

1.2 樣品采集

中華絨螯蟹[(80±5) g]，使用一次性無菌注射器從第三步足基部插入采集血淋巴，并按體積比1∶1 與抗凝劑(氯化鈉510 mmol/L、檸檬酸200 mmol/L、葡萄糖100 mmol/L、檸檬酸三鈉30 mmol/L，pH 7.3)混勻，800×g，4 °C，離心10 min，收集血淋巴細(xì)胞。然后在冰上取蟹的肝胰腺、心臟、胃、鰓、肌肉、腸道等組織，液氮速凍，-80 °C保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)過程中操作人員嚴(yán)格遵守國家和相關(guān)部門倫理規(guī)范，并按照“大連民族大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)”制定的規(guī)章制度執(zhí)行。

1.3 免疫刺激實(shí)驗(yàn)

本研究以LPS 和嗜水氣單胞菌為免疫刺激物進(jìn)行免疫刺激實(shí)驗(yàn)[10]。用PBS 溶液稀釋LPS，終濃度為100 μg/mL，用PBS 重懸嗜水氣單胞菌至1×107CFU/mL，隨機(jī)挑選暫養(yǎng)的健康中華絨螯蟹[(20±2) g] 108 只，平均分為3 組(PBS 組、LPS 組和嗜水氣單胞菌組)，分別向各組中華絨螯蟹注射100 μL PBS、100 μL LPS 和100 μL 嗜水氣單胞菌溶液，注射0、3、6、12、24 和48 h 后，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)挑選6 只中華絨螯蟹，收集血淋巴細(xì)胞。

1.4 RNA 提取、cDNA 合成及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

參考Yu 等[11]RNA 提取、cDNA 合成及實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)的方法，利用Trizol 試劑(Invitrogen，美國)進(jìn)行中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞總RNA 的提取，然后用分光光度計(jì)Nanodrop 2000 (Thermo Scientific，美國)對提取出的RNA進(jìn)行定量分析，取2 μL RNA 用于瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性。按照試劑盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa，日本)的說明書要求進(jìn)行cDNA 的反向合成。以獲得的cDNA 為模板，使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(TaKaRa，日本)，按說明書要求設(shè)置PCR 反應(yīng)體系和程序，結(jié)合表1 中基因類別和引物序列，以中華絨螯蟹的β-actin基因作為內(nèi)參基因，利用ABI-Q6-Flex 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果按照2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算。

表1 研究中采用的引物序列Tab.1 Primers used in this study

1.5 原核表達(dá)、蛋白純化及多克隆抗體制備

分析目的基因和表達(dá)載體的序列組成特點(diǎn)，選擇合適的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性的5'端帶有酶切位點(diǎn)的引物(表1)，將酶切后的目的片段和表達(dá)載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到克隆感受態(tài)Trans 5α 中，對測序正確的菌株進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)及質(zhì)粒提取，再將提取的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21(DE3)，使用12% 的SDS-PAGE 進(jìn)行電泳，并利用考馬斯染色法驗(yàn)證重組蛋白的表達(dá)。將pGEX4T-1(Novagen)作為重組表達(dá)的載體，pGEX4T-1 重組質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)后，蛋白帶有一段具有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶蛋白標(biāo)簽(GST-Tag)的序列。獲得重組蛋白后進(jìn)行尿素濃度梯度透析復(fù)性，使用獲得的復(fù)性蛋白對6 周齡雌性小鼠進(jìn)行4 次免疫，制備多克隆抗體，眼球摘除法將小鼠血樣收集到1.5 mL 離心管中，離心收集上層血清作為制備的多克隆抗體，利用Western blot 法檢測制備的中華絨螯蟹Akt 多克隆抗體的效果[12]。

1.6 細(xì)胞免疫熒光檢測

利用無菌注射器抽取中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞，4%多聚甲醛重懸血淋巴細(xì)胞，固定10 min?；靹蚝蟮渭拥蕉嗑圪嚢彼岚坏妮d玻片上，室溫靜置2 h，使細(xì)胞緊貼載玻片。采用0.5% Triton X-10對細(xì)胞進(jìn)行透化處理10 min，3%胎牛血清蛋白(BSA)封閉1 h，再用3% BSA 稀釋液對制備的Akt 多克隆抗體進(jìn)行稀釋(1∶500，體積比)，室外孵育1 h，洗滌后用BSA 稀釋帶有Alexa Fluer 488 標(biāo)簽的抗體(1∶1 000，體積比)，避光孵育1 h，再用3% BSA 稀釋DAPI，在樣品上滴加50 μL 稀釋液對細(xì)胞核進(jìn)行染色，室溫靜置10 min，避光。洗滌后用20 μL 50%甘油進(jìn)行封閉，蓋片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.7 RNA 干擾

用siRNA 位點(diǎn)預(yù)測軟件對EsAkt 進(jìn)行分析，選擇包含siRNA 位點(diǎn)較多的區(qū)間片段進(jìn)行干擾引物設(shè)計(jì)(表1)。合成對應(yīng)的干擾片段，以中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞的cDNA 作為模板，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化，用作雙鏈RNA(dsRNA)的合成模板。此外，還需要合成綠色熒光蛋白(EGFP)的dsRNA作為對照。dsRNA 的合成使用in vitroTranscription T7 試劑盒(TaKaRa)。dsRNA 準(zhǔn)備好后，挑選36 只暫養(yǎng)7 d 的中華絨螯蟹并隨機(jī)分為3 組(正常組、dsEGFP 組及dsEsAkt 組)，每組12 只。正常組、dsEGFP 組及Akt 干擾組分別注射100 μL PBS、100 μL EGFP 和 100 μL Akt 的 dsRNA，dsRNA 的終濃度都為1 μg/μL。并按照上述方法分別在注射后0 和24 h 進(jìn)行血淋巴細(xì)胞收集，用于RNA 提取和qRT-PCR 分析。

1.8 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 20 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用單因素方差分析方法(ANOVA)對不同處理組差異進(jìn)行比較。P＜0.05 代表差異顯著，P＜0.01 代表差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 中華絨螯蟹Akt 基因序列分析

從NCBI 和中華絨螯蟹基因組(PRJNA305216)獲得了中華絨螯蟹Akt的序列信息，并利用特異性引物及PCR 技術(shù)克隆得到了相關(guān)序列(命名為EsAkt)。利用生物信息學(xué)技術(shù)分析，EsAkt的cDNA全長2 200 bp，其中開放閱讀框(ORF)為1 545 bp，編碼514 個(gè)氨基酸。通過SMART 結(jié)構(gòu)域分析表明，EsAkt 分子包含3 個(gè)保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域：PH 結(jié)構(gòu)域、中心催化結(jié)構(gòu)域(S_TKc)和羧基端疏水結(jié)構(gòu)域(S_TK_X) (圖1)。

圖1 EsAkt 核酸序列、氨基酸序列和結(jié)構(gòu)域分析(a) EsAkt 核酸序列和氨基酸序列，*表示為終止密碼子(TGA)；(b) EsAkt 結(jié)構(gòu)域。Fig.1 Nucleotide,deduced amino acid sequence and protein domain of EsAkt(a) nucleotide and deduced amino acid sequence of EsAkt，* represents the stop codon (TGA),(b) protein domain of EsAkt.

2.2 中華絨螯蟹Akt 基因組織分布

利用qRT-PCR 技術(shù)分析EsAkt基因mRNA 在各組織(腸、胃、心臟、血淋巴細(xì)胞、鰓、肝胰腺和肌肉)中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，EsAkt的mRNA 在所有被檢測的組織中呈現(xiàn)組成型表達(dá)，在免疫相關(guān)組織(如肝胰腺、鰓和血淋巴細(xì)胞)中的表達(dá)量相對較高。EsAkt在肌肉、肝胰腺、鰓、血淋巴細(xì)胞、心臟和胃中的表達(dá)分別為腸表達(dá)水平的18.11±1.29 倍(P＜0.05)、11.45±1.61 倍(P＜0.05)、5.48±0.41 倍 (P＜0.05)、2.47±0.44 倍 (P＜0.05)、2.40±0.19 倍(P＜0.05)和1.08±0.09 倍(P＞0.05) (圖2)。

圖2 EsAkt mRNA 在各組織中的相對表達(dá)量1.腸，2.胃，3.心臟，4.血淋巴細(xì)胞，5.鰓，6.肝胰腺，7.肌肉。柱形圖上不同的字母代表組間存在顯著差異(P＜0.05)。Fig.2 Relative mRNA expression of EsAkt in different tissues1.intestine,2.stomach,3.heart,4.hemocytes,5.gills,6.hepatopancreas,7.muscle.Different letters indicate that there were significant differences between groups (P＜0.05).

2.3 EsAkt 多克隆抗體制備及細(xì)胞定位

重組EsAkt 質(zhì)粒在表達(dá)菌株BL21 (DE3)中利用IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，然后用GST 柱進(jìn)行重組蛋白純化。結(jié)果顯示，純化后的rEsAkt 條帶單一，蛋白分子量約為86 ku (圖3-a)。將純化得到的rEsAkt 進(jìn)行多克隆抗體的制備，利用Western blot檢驗(yàn)抗體的特異性，EsAkt 的多克隆抗體可以識別rEsAkt (圖3-b)。利用免疫熒光技術(shù)檢測EsAkt蛋白在血淋巴細(xì)胞中的細(xì)胞定位情況，綠色代表EsAkt 蛋白的分布，藍(lán)色代表DAPI 標(biāo)示的細(xì)胞核，EsAkt 蛋白主要以彌散狀的形式分布在血淋巴細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(圖4)。

圖3 EsAkt 重組蛋白的SDS-PAGE 及Western blot 分析(a) M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)，1.EsAkt 對照菌液(未加IPTG)，2.EsAkt 誘導(dǎo)菌液(IPTG 誘導(dǎo))，3.純化EsAkt 重組蛋白；(b) 1.Western blot 檢驗(yàn)EsAkt 多克隆抗體。Fig.3 SDS-PAGE and Western blot analysis of EsAkt(a) M.standard protein molecular weight marker,1.negative control for rEsAkt (without IPTG induction),2.IPTG induced rEsAkt,3.purified rEsAkt protein;(b) 1.Western blot analysis of rEsAkt with prepared anti-EsAkt antibody.

圖4 EsAkt 在血淋巴細(xì)胞中的定位(a) 明場下的細(xì)胞形態(tài)，(b) EsAkt 的陽性信號呈現(xiàn)綠色，(c) DAPI對細(xì)胞核染色呈現(xiàn)藍(lán)色，(d) 疊加圖確定EsAkt 的分布。Fig.4 Subcellular localization of EsAkt in hemocytes(a) morphology of hemocytes were shown in bright field,(b) positive signals of EsAkt were shown in green,(c) nucleus stained by DAPI were shown in blue,(d) merge map to determine the distribution of EsAkt.

2.4 免疫刺激后血淋巴細(xì)胞中EsAkt 的表達(dá)

本研究利用LPS 和嗜水氣單胞菌對中華絨螯蟹進(jìn)行免疫刺激，LPS 刺激3 和6 h 后，EsAkt的mRNA 表達(dá)量開始升高，分別為PBS 組的1.59±0.30 倍(P＜0.05)和2.81±0.15 倍(P＜0.01)。刺激12和24 h 后，EsAkt的mRNA 表達(dá)量繼續(xù)上升，分別為對照組3.95±0.30 倍和4.35±0.22 倍(P＜0.01)。刺激48 h 后，EsAkt的mRNA 表達(dá)量有所降低，但仍是PBS 組的2.62±0.29 倍(P＜0.01) (圖5)。嗜水氣單胞菌分別刺激3 和6 h 后，EsAkt的mRNA表達(dá)量逐漸升高，分別為PBS 組的3.52±0.29 倍和9.05±0.99 倍(P＜0.01)。刺激12 和24 h 后，EsAkt的mRNA 表達(dá)量下降，分別為PBS 組的6.62±3.34倍和3.46±0.53 倍(P＜0.01)。刺激48 h 后，EsAkt的mRNA 表達(dá)量恢復(fù)正常(1.40±0.21 倍，P＞0.05)。

圖5 免疫刺激后血淋巴細(xì)胞EsAkt mRNA 的表達(dá)模式(a) 脂多糖刺激后EsAkt 在血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)情況，(b) 嗜水氣單胞菌刺激后EsAkt 在血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)情況，PBS 為對照組。“*”代表P＜0.05，“**”代表P＜0.01，為組間差異。Fig.5 Temporal mRNA expression of EsAkt after immune challenges in hemocytes(a) temporal expression of EsAkt after LPS stimulation,(b) temporal expression of EsAkt after A.hydrophila stimulation;PBS was used as control.One asterisk indicates significant difference at P＜0.05,and two asterisks indicate extremely significant difference at P＜0.01;the differences are between groups.

2.5 EsAkt 干擾后凋亡相關(guān)基因的表達(dá)

利用dsRNA 對EsAkt基因進(jìn)行干擾，結(jié)果顯示，dsRNA 注射24 h 后，干擾組EsAkt的mRNA表達(dá)量顯著低于正常組(0.38±0.21 倍，P＜0.05)，正常組和dsEGFP 組中EsAkt的mRNA 表達(dá)量無顯著差異(P＞0.05) (圖6-a)。此外，為探究EsAkt是否參與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因表達(dá)，在EsAkt干擾后檢測凋亡相關(guān)基因EsCaspase-3-like的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)EsAkt 干擾組的EsCaspase-3-like表達(dá)量顯著上調(diào)，為正常組的2.69±0.92 倍(P＜0.05) (圖6-b)。

圖6 EsAkt 干擾及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)(a) EsAkt 在血淋巴細(xì)胞中的干擾效率，(b) 抑制EsAkt 后EsCaspase-3-like 的表達(dá)情況。1.正常組，2.dsEGFP 組，3.dsEsAkt 組?！?”代表P＜0.05。Fig.6 Inhibition of EsAkt and expression of apoptosis related gene(a) efficiency of EsAkt inhibition,(b) mRNA expression level of EsCaspase-3-like after the inhibition of EsAkt.1.normal group,2.dsEGFP group,3.dsEsAkt group."*" indicates significant difference at P＜0.05.

3 討論

面對日益嚴(yán)峻的養(yǎng)殖環(huán)境，中華絨螯蟹病害防御基礎(chǔ)理論研究卻很薄弱，豐富中華絨螯蟹免疫防御基礎(chǔ)理論知識，尋找安全有效的病害防控方法成為中華絨螯蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中亟待解決的問題，本研究針對這一問題，主要探索Akt 在中華絨螯蟹免疫防御中的功能和作用機(jī)制。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)，克隆獲得EsAkt的cDNA 全長，結(jié)果與田志環(huán)等[9]報(bào)道的中華絨螯蟹Akt序列一致。EsAkt 分子包含PH 結(jié)構(gòu)域、中心催化結(jié)構(gòu)域(S_TKc)和羧基端疏水結(jié)構(gòu)域(S_TK_X) 3 個(gè)保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，符合典型的Akt 結(jié)構(gòu)域特征[13]。EsAkt的mRNA 在所有被檢測的組織中呈現(xiàn)組成型表達(dá)，這與之前在斑馬魚[4]、香港牡蠣[6]、仿刺參[7]和羅氏沼蝦[8]中報(bào)道的情況類似，說明Akt在各組織中廣譜表達(dá)，提示可能參與多種生命活動(dòng)。在甲殼動(dòng)物中，肝胰腺、鰓和血淋巴細(xì)胞是其免疫過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和重要參與者，這些免疫器官或組織在受到外界刺激后能快速做出響應(yīng)，分泌凝集素、抗菌肽和溶菌酶等免疫分子，有效清除入侵的病原體[14]。本研究中發(fā)現(xiàn)，EsAkt在免疫相關(guān)組織(如肝胰腺、鰓、血淋巴細(xì)胞)中的表達(dá)量相對較高，預(yù)示Akt 可能參與中華絨螯蟹的免疫防御反應(yīng)。此外，基于EsAkt 蛋白的細(xì)胞定位研究表明，EsAkt 蛋白主要是以彌散狀的形式分布在血淋巴細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。這與已報(bào)道的人和小鼠的Akt 分布情況一致[15]，活化的Akt 可以磷酸化多種酶、激酶和轉(zhuǎn)錄因子等下游分子，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的作用。EsAkt的細(xì)胞定位進(jìn)一步證明其具有保守的功能，可能在細(xì)胞免疫和維持穩(wěn)態(tài)的過程中發(fā)揮重要作用。

PI3K-AKT 信號在細(xì)胞增殖、細(xì)胞代謝調(diào)控、細(xì)胞發(fā)育及存活等多種細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也參與宿主抵抗外源刺激物引起的免疫過程。Tang 等[16]在克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)中對銅離子應(yīng)激引起的免疫反應(yīng)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)PI3K-AKT 信號通路參與其中，免疫相關(guān)基因被上調(diào)表達(dá)，提示重金屬銅可以引起克氏原螯蝦氧化應(yīng)激和免疫反應(yīng)。Kong 等[17]對凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)由溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)引起的免疫反應(yīng)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)PI3K-AKT信號通路被激活，從而增加抗菌肽(LvPEN4)的表達(dá)，提高機(jī)體對溶藻弧菌的抵抗力。Ruan 等[18]克隆了凡納濱對蝦Akt基因(LvAkt)，發(fā)現(xiàn)在白斑綜合征病毒(WSSV)感染對蝦的早期階段，LvAkt表達(dá)上調(diào)，而PI3K 特異性抑制劑可以降低病毒基因轉(zhuǎn)錄水平，提示PI3K-AKT 信號可能在凡納濱對蝦對抗WSSV 的免疫應(yīng)答中起重要作用。細(xì)菌性病害是中華絨螯蟹養(yǎng)殖過程中的主要致病因素之一，LPS 是構(gòu)成革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的重要成分，可以用于模擬革蘭氏陰性菌的攻擊，而嗜水氣單胞菌屬于革蘭氏陰性菌，是中華絨螯蟹養(yǎng)殖過程中的主要致病菌之一[19]。本研究中LPS 刺激后3～24 h，EsAkt的mRNA 表達(dá)量逐漸升高，在刺激后48 h 才開始下降，嗜水氣單胞菌刺激6 h 后，EsAkt的mRNA 表達(dá)水平達(dá)到最高，隨后逐漸降低，并在48 h 恢復(fù)到正常水平，中華絨螯蟹對嗜水氣單胞菌的響應(yīng)速率比LPS 更快，強(qiáng)度更高。EsAkt免疫應(yīng)激變化趨勢與香港牡蠣ChAkt1 響應(yīng)溶藻弧菌和酵母菌變化趨勢相近，都是先升高，后降低的過程[6]。

甲殼動(dòng)物免疫系統(tǒng)主要由細(xì)胞免疫和體液免疫組成，其中細(xì)胞免疫通常是指血淋巴細(xì)胞直接參與的防御反應(yīng)，主要包括細(xì)胞吞噬、包囊和黑化作用及凋亡等過程[20]。目前已在一些甲殼動(dòng)物中觀察到細(xì)胞皺縮、線粒體膜電位消失、膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸暴露在外側(cè)以及凋亡小體的形成等經(jīng)典的凋亡特征[21]。細(xì)胞凋亡是免疫系統(tǒng)的一個(gè)重要調(diào)控特性，可以有效清理機(jī)體老化、受損或是存在潛在危險(xiǎn)的細(xì)胞(如病毒感染細(xì)胞)，對維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)具有重要意義。Caspases 是重要的半胱氨酸依賴的特異性蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著核心作用。在墨吉對蝦(Penaeus merguiensis)[22]、凡納濱對蝦[23]、斑節(jié)對蝦(P.monodon)[24]和中華絨螯蟹[25]等甲殼動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了凋亡相關(guān)的多種Caspase基因，較多的研究中采用注射細(xì)菌、病毒等方法對甲殼動(dòng)物進(jìn)行免疫刺激，來探究Caspase基因在甲殼動(dòng)物免疫中的作用。Caspase-3 在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要的作用，在中華絨螯蟹中，Wu 等[26]首次發(fā)現(xiàn)EsCaspase-3-like基因，并發(fā)現(xiàn)其在甲殼動(dòng)物血細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要的作用。本研究中采用dsRNA 對EsAkt基因進(jìn)行干擾后，凋亡相關(guān)基因EsCaspase-3-like表達(dá)水平顯著上調(diào)，提示EsAkt可能通過調(diào)控Caspase 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)的作用。本研究結(jié)果豐富了中華絨螯蟹PI3K-AKT 信號通路研究的基本資料，為進(jìn)一步探究甲殼動(dòng)物免疫防御機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

（作者聲明本文無實(shí)際或潛在的利益沖突）