水產(chǎn)品中致病與腐敗菌的群體感應(yīng)抑制劑研究進(jìn)展

檀茜倩，裴建博，崔方超，李秋瑩，呂欣然，孫 彤，勵建榮,*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州 121013；2.渤海大學(xué)海洋研究院，遼寧 錦州 121013；3.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

水產(chǎn)品營養(yǎng)豐富，含有蛋白質(zhì)、必需氨基酸、生物活性肽、多不飽和脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)物質(zhì)。但消費(fèi)者食用水產(chǎn)品也會面臨一些潛在風(fēng)險(xiǎn)，主要包括物理因素（夾雜異物）、化學(xué)因素（重金屬、魚藥殘留、生物毒素）以及生物因素（細(xì)菌、病毒、寄生蟲）[1-2]等。其中生物因素對消費(fèi)者健康和漁業(yè)經(jīng)濟(jì)影響更大。致病菌（副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌等）以及腐敗菌（假單胞菌、希瓦氏菌等）的存在可能引發(fā)食源性疾病或水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)[3]，影響消費(fèi)者身體健康，同時也會造成一定浪費(fèi)和經(jīng)濟(jì)損失。因此如何保證水產(chǎn)品新鮮度以及微生物安全性是目前非常值得關(guān)注的問題[4-5]。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌的某些生物行為受到信號系統(tǒng)的調(diào)控[6]，群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）系統(tǒng)就是其中之一。細(xì)菌的QS系統(tǒng)是指細(xì)菌通過感知信號分子（也叫做自誘導(dǎo)物（autoinducers，AIs））的濃度來實(shí)現(xiàn)菌群內(nèi)部和菌間的交流以及調(diào)控多種毒力行為的產(chǎn)生[7-8]。而以細(xì)菌QS系統(tǒng)為靶點(diǎn)的群體感應(yīng)抑制劑（quorum sensing inhibitors，QSIs）可以起到阻斷或干擾QS系統(tǒng)的作用，且QSIs對細(xì)菌生長的影響較小，與抗生素等物質(zhì)對細(xì)菌的抑制機(jī)制不同，因此使用QSIs抑制細(xì)菌QS系統(tǒng)毒力因子的產(chǎn)生，不僅能夠保證水產(chǎn)品食用的新鮮度和微生物安全性[9]，也可以在一定程度上抑制細(xì)菌耐藥性形成[9]。為了更全面了解QSIs對水產(chǎn)品中細(xì)菌的控制作用，本文概述水產(chǎn)品中常見的幾種致病和腐敗菌QS系統(tǒng)的類型及其對毒力因子的調(diào)控方式，著重介紹目前天然來源（微生物源、植物源、動物源）以及人工合成QSIs的研究進(jìn)展，為水產(chǎn)品保鮮和安全控制技術(shù)開發(fā)提供參考。

1 細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)概述

在細(xì)菌QS系統(tǒng)中，AIs對細(xì)菌的基因表達(dá)和毒力因子產(chǎn)生的調(diào)控起到了非常重要的作用[10]。常見的AIs主要分為三大類（表1）：第一類為高絲氨酸內(nèi)酯（homoserine lactone，HSL）類（AI-1），主要存在于革蘭氏陰性細(xì)菌（G-）中[11]，其結(jié)構(gòu)因合成酶不同而有所差異，以N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯類（N-acyl-homoserine lactones，AHLs）最常見，其由S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）通過LuxI合成酶產(chǎn)生，4～16 個C組成的脂肪酰鏈通過酰胺鍵連接到內(nèi)酯化的高絲氨酸上，通過與LuxR受體結(jié)合開啟全局調(diào)控[12]；第二類為自誘導(dǎo)肽（autoinducing peptides，AIPs），主要存在于革蘭氏陽性細(xì)菌（G＋）中，一般包含5～17 個氨基酸，AIPs由G＋菌核糖體合成并完成對自身穩(wěn)定和功能的修飾后，通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸?shù)江h(huán)境中，當(dāng)環(huán)境中AIPs濃度超過一定閾值時會引起細(xì)菌基因表達(dá)改變并引發(fā)相應(yīng)生物行為[13]；第三類是AI-2，在G-和G＋菌中均有存在，被認(rèn)為是細(xì)菌種間交流的一種通用信號，S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosyl-homocystein，SAH）在S-腺苷高半胱氨酸核苷酸酶和LuxS酶的作用下轉(zhuǎn)化成高半胱氨酸和4,5-二羥基-2,3-戊二酮（4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione，DPD），再經(jīng)DPD自發(fā)環(huán)化形成呋喃酮類化合物[14]。

表1 常見AIs類型Table 1 Types of common autoinducers (AIs)

2 水產(chǎn)品中常見致病和腐敗菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)類型

水產(chǎn)品中常見致病菌有金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、弧菌等。在G＋菌中，S.aureus主要存在于冷凍水產(chǎn)品，其QS系統(tǒng)調(diào)控生物被膜和毒力因子的過程需要輔助基因調(diào)節(jié)（accessory gene regulator，Agr）系統(tǒng)參與，其中Agr系統(tǒng)中的agrB和agrD基因編碼跨膜蛋白和AgrD前肽，AgrB蛋白參與AgrD轉(zhuǎn)化為AIP并釋放的過程，agrC和agrA基因則用來編碼感應(yīng)激酶和對AgrC/AgrA兩組分系統(tǒng)做出應(yīng)答調(diào)控[15]。另一種常見的G＋食源性細(xì)菌L.monocytogenes的QS系統(tǒng)與S.aureus類似，雖然L.monocytogenes基因組中已被證實(shí)包含與AI-2有關(guān)的pfs和luxS基因，但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)AI-2并不是L.monocytogenes的AIs，L.monocytogenes的基因組中不含與誘導(dǎo)、跨膜蛋白和雙組分系統(tǒng)相關(guān)的comX、comQ和comP/comA基因，agrD基因比agrA基因?qū).monocytogenes致病和生物被膜形成等毒力行為的影響更大[16]。

在G-菌中，P.aeruginosa已經(jīng)被證實(shí)包含4 種QS系統(tǒng)：LasI/LasR系統(tǒng)、RhlI/RhlR系統(tǒng)、PqsR參與的喹諾酮（Pseudomonasquinolone signal，PQS）系統(tǒng)以及在低磷酸鹽條件下起作用的2-(2-羥基苯基)-噻唑-4-甲醛（2-(2-hydroxyphenyl)-thiazole-4-carbaldehyde，IQS）系統(tǒng)[17]，這4 個系統(tǒng)通過一系列的級聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌毒力行為的調(diào)控。其中LasR位于級聯(lián)反應(yīng)上游，可與特定AHLs結(jié)合，激活下游包括lasI、rhlI/R、pqsR和pqsABCDE在內(nèi)的大量基因表達(dá)[18]。副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是另一種水產(chǎn)中比較常見G-弧菌，常污染牡蠣等貝類，未經(jīng)煮熟食用可引起胃腸炎和敗血癥等疾病，其為AI-2型QS系統(tǒng)，低AIs濃度可促進(jìn)V.parahaemolyticus中aphA基因的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)其III型分泌系統(tǒng)（type III secretion system，T3SS）分泌毒素，高AIs濃度時AI-2可與受體蛋白OpaR結(jié)合抑制T3SS1中轉(zhuǎn)錄激活蛋白ExsA的活性，降低V.parahaemolyticus生物被膜的形成、運(yùn)動能力和毒素的分泌[19-20]；哈維弧菌（Vibrio harveyi）同屬AI-2型QS系統(tǒng)[21]。

水產(chǎn)中的腐敗菌以G-菌居多，包括熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）在內(nèi)的多種假單胞菌、希瓦氏菌（Shewanella）和蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）等。其中P.fluorescens主要為AHLs型QS系統(tǒng)，已發(fā)現(xiàn)LuxI/LuxR以及Pcol/PcoR兩種類型[22]。Shewanella是魚和蝦等水產(chǎn)品冷藏過程中的特定腐敗菌[23]，其QS系統(tǒng)主要包含AI-1和AI-2兩種信號分子，其產(chǎn)生的二酮哌嗪類（diketopiperazines，DKPs）化合物可與LuxR結(jié)合通過上調(diào)torT和trxB基因表達(dá)增強(qiáng)致腐能力[24-25]。H.alvei則經(jīng)常引起真空包裝水產(chǎn)品的腐敗，并對低溫有較強(qiáng)適應(yīng)性，目前研究認(rèn)為H.alvei為AHLs型QS系統(tǒng)，已發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的AHLs信號分子類型有N-己酰-高絲氨酸內(nèi)酯（N-hexanoyl-homoserine lactone，C6-HSL）、N-氧代辛酰-高絲氨酸內(nèi)酯（N-octanoyl-homoserine lactone，OC8-HSL）[26]、N-丁酰-高絲氨酸內(nèi)酯（N-butyryl-homoserine lactone，C4-HSL）[27]等。

3 群體感應(yīng)抑制劑概述

QSIs可以通過阻斷或干預(yù)QS系統(tǒng)抑制細(xì)菌毒力因子產(chǎn)生（圖1）。QSIs的作用機(jī)制主要包括以下幾種方式：抑制信號分子合成；酶解或清除信號分子；與信號分子競爭性結(jié)合受體位點(diǎn)；通過干擾信號分子和基因啟動子結(jié)合影響基因表達(dá)等[28-31]。QSIs篩選需滿足以下幾個原則：第一，候選QSIs可有效降低QS相關(guān)基因表達(dá)；第二，候選QSIs與相應(yīng)QS調(diào)控因子具有專一對應(yīng)性并在使用后不具有副作用；第三，候選QSIs有很好的化學(xué)穩(wěn)定性，不會被宿主細(xì)胞代謝活動降解[32]。QSIs根據(jù)其來源可分為天然來源抑制劑和人工合成抑制劑。天然來源抑制劑主要來自微生物代謝物、植物提取物和動物等。人工合成抑制劑從偶然發(fā)現(xiàn)到高通量篩選主要是根據(jù)QSIs的特點(diǎn)，基于經(jīng)驗(yàn)、半經(jīng)驗(yàn)方法有目的地對前體化合物進(jìn)行改造和合成。目前QSIs篩選常用的報(bào)告菌株有根癌農(nóng)桿菌A136、紫色桿菌CV026或12472、P.aeruginosaqsc 119等（對AHLs信號分子產(chǎn)生響應(yīng)）[33-34]，V.harveyiBB120或JMH612（對AI2或AHL類信號分子產(chǎn)生響應(yīng)）[35]，含有綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌等[36]。

圖1 QSIs對細(xì)菌QS系統(tǒng)作用示意圖Fig.1 Schematic diagram of action of QSIs against bacterial QS system

4 天然來源的群體感應(yīng)抑制劑

天然來源的QSIs主要包括三大類：微生物源、植物源和動物源。

4.1 微生物源群體感應(yīng)抑制劑

細(xì)菌素是一類對細(xì)菌有抑制作用的多肽，其抑菌譜和抑菌機(jī)理一直被廣泛研究[37]，目前研究發(fā)現(xiàn)部分細(xì)菌素可作為某些水產(chǎn)品致病和腐敗菌的QSIs，通過影響QS信號分子活性或作為信號分子類似物競爭性與QS受體結(jié)合達(dá)到抑制細(xì)菌QS通路的目的。例如乳桿菌素AL705（由彎曲乳桿菌產(chǎn)生）可抑制AI-2信號分子的活性，并影響L.monocytogenes生物被膜的形成[38]；豆素（分子質(zhì)量為484 Da，由芽孢桿菌BR4產(chǎn)生）可作為PQS信號分子類似物，因其與PqsR上的4 個氨基酸殘基結(jié)合能力較強(qiáng)，所以可競爭性地與PqsR結(jié)合，因此可抑制P.aeruginosaQS系統(tǒng)調(diào)控的生物被膜的形成以及胞外蛋白產(chǎn)生[39]。

另一類微生物源群體感應(yīng)抑制劑為具有群體感應(yīng)淬滅（quorum quenching，QQ）作用的酶類。QQ酶最早在芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)，包括內(nèi)酯酶、?；D(zhuǎn)移酶、氧化還原酶和對氧磷酯酶等[40]。芽孢桿菌中比較有代表性的QQ酶為內(nèi)酯酶，例如在地衣芽孢桿菌T-1中發(fā)現(xiàn)的由ytnp編碼的AHLs內(nèi)酯酶[41]，這種酶可裂解AHLs分子的高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)，抑制其與靶轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑結(jié)合，通過減弱AHLs有效性來干擾QS系統(tǒng)[42]；另外，芽孢桿菌屬也能夠產(chǎn)生AHLs?；富蜓趸€原酶，可部分或完全降解AHLs信號分子[43]。乳酸菌中也發(fā)現(xiàn)多種QQ酶，本團(tuán)隊(duì)在乳桿菌ZHG2-1[44]和植物乳桿菌CY1-1[45]中發(fā)現(xiàn)可能存在AHLs內(nèi)酯酶或者酰化酶，前者通過抑制LasI/R和RhlI/R蛋白合成基因的表達(dá)抑制QS系統(tǒng)，后者通過降解AHLs信號分子抑制QS過程。分泌QQ酶的微生物、QQ酶種類及作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步挖掘和研究。

除了細(xì)菌素和QQ酶，從微生物中也分離到了可作為QSIs的其他代謝物?？莶菅挎邨U菌R-18（從植物根系中分離）的代謝產(chǎn)物2,4-二叔丁基苯酚是AHLs信號分子類似物，可通過阻止AHLs與其受體結(jié)合來抑制QS通路[46]。鏈霉菌（從魷魚中分離）提取物也可抑制紫色桿菌MTCC2656紫色素產(chǎn)生[47]。微生物代謝物的組成受到微生物培養(yǎng)條件（碳源、氮源和礦物質(zhì)）的影響，因此也是在對微生物源QSIs獲取和研究中需要考慮的因素。另外，現(xiàn)有研究雖證實(shí)某些微生物代謝物可作為潛在QSIs，但是其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

4.2 植物源群體感應(yīng)抑制劑

植物來源的QSIs主要包括植物提取物、精油以及從其中分離的各種單體。植物提取物和精油一直以來被認(rèn)為具有抑菌功能。植物來源QSIs的抑制機(jī)制主要包括兩種：一是干擾信號分子與受體結(jié)合，因?yàn)椴糠种参锾崛∥锏幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)與某些AIs類似，可與AIs競爭性與受體結(jié)合影響QS過程；第二種是通過影響AIs的合成來起到干擾QS的作用。和其他來源的QSIs相比，植物來源QSIs應(yīng)用相對廣泛，可對多種QS系統(tǒng)起到抑制作用[48]。

小蘗堿（黃連素）是一種異喹啉生物堿，為廣譜抗菌藥物，其對病毒、真菌、和各類細(xì)菌（尤其是一些耐藥菌株）都有抑制作用，它還可抑制多種細(xì)菌的QS系統(tǒng)，顯示出相對廣譜的QS抑制能力。小蘗堿在質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL時可抑制紫色桿菌12472以及CV026產(chǎn)生紫色素以及P.aeruginosa生物被膜的形成，通過分子對接和同源建模發(fā)現(xiàn)其對P.aeruginosaQS系統(tǒng)的干擾是由于可與信號分子競爭性地同受體LasR和RhlR結(jié)合[30]。另有研究表明，在1/2最小抑菌質(zhì)量濃度（0.64 mg/mL）下，小蘗堿可以抑制耐藥性大腸桿菌生物被膜的形成，通過激光掃描共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)在該濃度下小蘗堿對生物被膜的抑制作用明顯，細(xì)胞形狀發(fā)生改變，產(chǎn)生溶脹和伸長現(xiàn)象，說明其對生物被膜產(chǎn)生比較大的破壞；實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在1/2最小抑菌質(zhì)量濃度（0.64 mg/m L）和1/4 最小抑菌質(zhì)量濃度（0.3 2 m g/m L）下，小蘗堿可顯著下調(diào)大腸桿菌AI-2 QS系統(tǒng)相關(guān)基因（luxS、pfS基因、與luxR基因功能相似的sdiA基因、參與細(xì)胞分化的hflX基因、鞭毛驅(qū)動合成基因fliA基因以及此基因控制的操縱子motA基因）的表達(dá)[49]；研究還發(fā)現(xiàn)苦參堿也具有與小蘗堿類似的QS抑制效果，但是在對QS抑制濃度和相關(guān)基因的干擾上存在一些差別，說明不同中藥單體對同種細(xì)菌的QS抑制能力不同；小蘗堿也可抑制表皮葡萄球菌生物被膜的形成，推測其與干擾表皮葡萄球菌QS系統(tǒng)有關(guān)，但是具體的機(jī)制還未得到證實(shí)[50-51]。

姜黃素是從姜黃中提取的一種生物活性物質(zhì)，其核心結(jié)構(gòu)帶有2 個芳香環(huán)和7 個C碳鏈二芳基庚烷，可抑制在C6-HSL信號分子存在下的紫色桿菌CV026和在C8-HSL存在下的根癌農(nóng)桿菌色素的產(chǎn)生[52]，也可以抑制V.harveyi在QS系統(tǒng)調(diào)控作用下的生物發(fā)光行為，對弧菌屬生物被膜形成的抑制作用明顯，在質(zhì)量濃度為100 μg/mL時對V.harveyi、V.parahaemolyticus、創(chuàng)傷弧菌生物被膜形成的抑制率分別為69%、56%和79%；姜黃素處理上述弧菌成熟生物被膜，會使生物被膜的厚度變薄并呈現(xiàn)出不完整狀態(tài)；并且分泌胞外多糖、阮藻酸鹽以及群集和泳動等QS調(diào)控的毒力行為產(chǎn)生也明顯降低[53]。除了對弧菌屬Q(mào)S的抑制作用，姜黃素還可以通過與LuxI型的AHLs合成酶結(jié)合干擾溫和氣單胞菌QS系統(tǒng)[52]，通過影響AHLs合成酶ahlI基因以及AHL結(jié)合受體合成酶ahyR基因的表達(dá)干擾嗜水氣單胞菌的QS系統(tǒng)等[54]。

研究發(fā)現(xiàn)，與其他化學(xué)和物理方法協(xié)同作用可增強(qiáng)植物源QSIs的QS抑制能力，例如在光催化條件下，姜黃素可使得P.aeruginosa的lasI/R和rhlI/R基因發(fā)生明顯下調(diào)[55]，對其生物被膜的抑制效果相比姜黃素單獨(dú)作用顯著增強(qiáng)，因此也可作為植物源QSIs應(yīng)用發(fā)展的一個方向。

4.3 動物源群體感應(yīng)抑制劑

動物細(xì)胞和組織中也有部分QSIs存在。當(dāng)真核宿主被一些具有QS系統(tǒng)的病原菌侵染后，會對不同AIs產(chǎn)生響應(yīng)，產(chǎn)生可分解AIs的代謝物。Maurice等[56]發(fā)現(xiàn)P.aeruginosa感染肺上皮細(xì)胞的線粒體后，其會分泌去乙?；?（sirtuin 1，SIRT1）和磷酸腺苷依賴性激酶（AMP-dependent kinase，AMPK）來減弱P.aeruginosa信號分子3-oxo-C12-HSL對線粒體的影響，因此這兩種酶具有潛在QSIs功能。另有研究表明，碎牛肉提取物可抑制AI-2信號分子的活性，抑制大腸桿菌O157:H7的生長以及其yadK和hhA基因的表達(dá)[57]。驢初乳中分離的多聚己糖可顯著抑制紫色桿菌12472紫色素產(chǎn)生，也可以抑制S.aureus溶血素、蛋白酶和脂肪酶等毒力因子的產(chǎn)生和生物被膜的形成，并且同時具有降解C4-HSL和C12-HSL兩種信號分子的功能[58]。一種南非的蜂膠也可作為潛在QSIs，其中所含的黃酮類物質(zhì)喬松素、高良姜素和白楊素，比香草醛對紫色桿菌12472產(chǎn)紫色素的抑制率高，且3 種物質(zhì)綜合的效果大于單一作用效果，可同時抑制G＋L.monocytogenes、G-大腸桿菌和真菌中的白色念珠球菌的生物被膜形成，表現(xiàn)出廣譜的抑菌活性和抗QS特性，豐年蝦急性毒性實(shí)驗(yàn)證實(shí)其無毒，在水產(chǎn)品工業(yè)上具有潛在的應(yīng)用價值[57]；另外一種從蜜蜂毒液中分離的蜂毒肽也具有抑制S.aureus、大腸桿菌和P.aeruginosa的生物被膜形成的功能，但是其活性成分以及作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步評估[59]。

有代表性的不同天然來源QSIs及其對QS系統(tǒng)的主要影響見表2。

表2 常見天然來源QSIsTable 2 Common natural QSIs

5 人工合成群體感應(yīng)抑制劑

5.1 群體感應(yīng)淬滅酶的設(shè)計(jì)合成

因?yàn)樘烊籕Q酶具有分離困難、產(chǎn)量低等不利因素，使其工業(yè)應(yīng)用受到限制，目前研究可考慮通過生物工程的方法根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的QQ酶基因合成QQ酶（圖2）。本團(tuán)隊(duì)通過對P.fluorescens的基因序列分析，利用pET28a載體在大腸桿菌DE3中成功表達(dá)了具有AHLs淬滅活性的QQ酶PF2571和PF1240，PF2571能夠抑制維氏氣單胞菌BY-8中包括生物被膜、蛋白酶、脂肪酶、藻朊酸鹽等QS調(diào)控的毒力因子的形成，并有效控制鯛魚的腐敗[62]；PF1240與AHLs?；D(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)相似，能夠分解不同長度碳鏈的多種AHLs，可抑制H.alvei菌生物被膜、蛋白酶和脂肪酶的產(chǎn)生及其泳動能力[63]。另有報(bào)道成功對從健康蝦中分離的Ruegeria mobilisYJ3菌株的胞外群體感應(yīng)淬滅酶RmmL序列在體外進(jìn)行了克隆表達(dá)，其可以降解長鏈的C12-HSL信號分子，能夠抑制P.aeruginosa產(chǎn)生綠膿菌素，同時RmmL被認(rèn)為可以作為水產(chǎn)的治療藥劑[64]。

圖2 異源表達(dá)QQ酶流程示意圖Fig.2 Schematic diagram of heterogenous expression of quorum quenching enzyme

5.2 新型QSIs的設(shè)計(jì)和有機(jī)合成

除了采用生物工程的方法，在已有經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，QSIs可通過骨架躍遷的方法（即從已知活性的化合物出發(fā)，通過改變其核心結(jié)構(gòu)，得到新的具有相似活性的化合物）設(shè)計(jì)合成，其QS抑制效果可以利用分子對接實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)（圖3）。一種策略是根據(jù)不同類型AIs結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)相關(guān)類似物，這種類似物可與AIs競爭性與其對應(yīng)受體結(jié)合，進(jìn)而影響毒力基因表達(dá)。例如可以通過改變AHLs的內(nèi)酯環(huán)以及對其酰胺基和脂肪鏈進(jìn)行一定化學(xué)修飾合成新QSIs[31]，其中內(nèi)酯環(huán)可用噻唑、二氫噻唑、苯并咪唑、吡啶和咪唑啉等雜環(huán)代替，一般來說氨基酸基團(tuán)和側(cè)鏈可相對保持不變，而側(cè)鏈基團(tuán)的長度可進(jìn)行一定調(diào)整。研究發(fā)現(xiàn)采用此種策略合成的大部分AHLs類似物都具有抑制AHLs型QS系統(tǒng)的功能，分子對接模擬結(jié)果顯示這些類似物與紫色桿菌CviR受體的結(jié)合能力大于天然AHLs信號分子。這種合成策略需要根據(jù)目標(biāo)AIs特點(diǎn)選擇合適的先導(dǎo)化合物作為核心結(jié)構(gòu)，同時對其他基團(tuán)進(jìn)行有針對性地修飾[65]。另一種策略是利用已知結(jié)構(gòu)的QSIs來設(shè)計(jì)和合成具有類似結(jié)構(gòu)的新型QSIs。有研究合成了與對P.aeruginosa毒力因子有抑制作用的5-硝基咪唑類甲硝唑這種類型的QSIs結(jié)構(gòu)類似的一系列塞克硝唑化合物，并證實(shí)了這類化合物可同時下調(diào)群體感應(yīng)信號分子合成酶基因lasI、rhlI、pqsA和信號分子受體lasR、rhlR和pqsR基因的表達(dá)，從而抑制P.aeruginosa毒力因子產(chǎn)生[66]。

圖3 1,5-二氫吡咯-2-酮（A）[9]、5-乙酰基-4-甲基-2-(3-吡啶)噻唑（B）[67]、吡哆醛乳腙（C）[68]與LasR蛋白模型分子對接結(jié)果示意圖Fig.3 Schematic diagram of the molecular docking of 1,5-dihydropyrrol-2-ones (A)[9],5-acetyl-4-methyl-2-(3-pyridyl) thiazole (B)[67]and pyridoxal lactohydrazone (C)[68] with the LasR protein model

除了依據(jù)經(jīng)驗(yàn)對QSIs進(jìn)行設(shè)計(jì)合成，基于計(jì)算方法的大規(guī)模篩選也被應(yīng)用在QSIs的設(shè)計(jì)和開發(fā)中。Grossman等[69]從諾丁漢化合物數(shù)據(jù)庫（包含85 000 種不同的化合物）篩選出結(jié)構(gòu)內(nèi)核與PQS和2-庚基-4-喹啉酮（2-heptylquinolin-4(1H)-one，HHQ）的內(nèi)部配體具有一定相似性的喹唑啉酮骨架化合物，可以作為PasR的拮抗物進(jìn)而干擾QS過程。在虛擬篩選過程中，首先需要選擇適合的數(shù)據(jù)庫，目前常用的化合物公共數(shù)據(jù)庫有Pubchem（小分子信息）、Drugbank（常見藥物信息）、中藥資源的數(shù)據(jù)庫TCM（中藥信息）等，同時也可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)建立有針對性的化合物數(shù)據(jù)庫以應(yīng)用于QSIs的虛擬篩選。

5.3 納米顆粒QSIs的設(shè)計(jì)和合成

納米顆粒是一類尺寸1～100 nm、形狀多樣、具有特殊化學(xué)和物理特性的物質(zhì)，已經(jīng)應(yīng)用在包括診療、催化、藥物遞送、傳感等諸多領(lǐng)域，同時其也可作為抗菌劑，對很多耐藥菌有很好的抑制作用?，F(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)一部分納米顆粒可作為QSIs，對QS的抑制效果取決于納米顆粒的類型、合成方法以及作用濃度大小等[70]。

銀納米顆粒（silver nanoparticles，AgNPs）是目前研究較多的一類納米顆粒，對多種QS系統(tǒng)都有抑制作用。AgNPs對QS系統(tǒng)的抑制機(jī)制主要由于AgNPs具有破壞細(xì)胞膜（尤其是肽聚糖層）、破壞細(xì)菌的呼吸鏈（呼吸鏈酶ATPase）、干擾DNA的復(fù)制、產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）等作用，而這些作用會對細(xì)菌QS系統(tǒng)產(chǎn)生干擾。以AgNPs對P.aeruginosaPAO1的QS系統(tǒng)影響為例，首先AgNPs引發(fā)的DNA損傷和ROS產(chǎn)生會激活編碼σ因子的rpoS基因的上調(diào)表達(dá)，而RpoS（σ因子）能激活細(xì)胞對DNA損傷和ROS的保護(hù)作用，并可同時激活RsmA表達(dá)，在RpoS和RsmA的聯(lián)合作用下，rhl和las家族的基因表達(dá)受到抑制并隨后影響到下游QS相關(guān)基因表達(dá)[71]。

AgNPs的合成方法很多，采用植物提取物或微生物代謝物對AgNPs進(jìn)行綠色合成因?yàn)榉椒ê唵?、安全以及對環(huán)境污染小近年來受到很多關(guān)注[72]（圖4）。植物或微生物提取物在AgNPs的合成過程中既可以作為還原劑，也具有穩(wěn)定AgNPs的作用。有研究利用大花紫薇葉的水提取物合成的AgNPs可成功抑制P.aeruginosa生物被膜形成[73]；采用印度藏茴香種子的水提取物合成的AgNPs在質(zhì)量濃度為1、2、3 μg/mL和4 μg/mL時能使紫色桿菌12472產(chǎn)紫色素能力分別下降34.2%、47.0%、65.6%和74.7%，在質(zhì)量濃度為1～15 μg/mL時可在不同程度抑制P.aeruginosa綠膿菌素、鼠李糖脂和彈性蛋白酶以及黏質(zhì)沙雷氏靈桿菌素的產(chǎn)生[74]；采用真菌（煙草內(nèi)生菌）提取物合成的AgNPs可以顯著抑制兩種P.aeruginosa的泳動能力、綠膿菌素和胞外多糖的產(chǎn)生以及生物被膜的形成[72]。

圖4 利用植物提取物合成AgNPs的流程圖Fig.4 Schematic diagram of plant extract-mediated silver nanoparticles synthesis

納米顆粒作為QSIs的效果受到顆粒大小的影響。研究發(fā)現(xiàn)雖然球形納米銀顆粒（粒徑＜20 nm）和銀納米棒（直徑在100～200 nm之間，長度為5～10 μm）都可下調(diào)編碼LasA蛋白酶、LasB彈性蛋白酶、鐵載體等QS相關(guān)毒力基因表達(dá)，但是相對于納米棒，納米顆?？梢栽谳^低的濃度下起到QS抑制作用，這可能是由于其比表面積大，更容易穿透細(xì)胞膜引起氧化和DNA損傷[71]。不同類型的納米顆粒對QS的抑制機(jī)制也不盡相同。對于AHL型QS系統(tǒng)來說，ZnO納米顆粒、TiO2納米顆粒、AgNPs都具有抑制紫色桿菌QS的能力，但是TiO2納米顆粒與AgNPs主要影響信號分子的合成，而ZnO納米顆粒則通過破壞對信號分子的識別和響應(yīng)來干擾QS系統(tǒng)[75]。

在實(shí)際應(yīng)用過程中納米顆粒膠體具有不穩(wěn)定和容易聚集的缺點(diǎn)，會對其QS抑制能力造成影響。為了解決這個問題，常將納米顆粒負(fù)載到一個可起到支撐作用的基質(zhì)上，基質(zhì)一般選擇帶有羥基、羰基、羧基和環(huán)氧基等官能團(tuán)的物質(zhì)（殼聚糖就是一種經(jīng)常采用的納米顆粒負(fù)載基質(zhì)），所形成的納米復(fù)合材料和復(fù)合納米顆?？稍鰪?qiáng)QSIs對QS的抑制功能[76]。納米顆粒本身也可以作為載體負(fù)載某些水溶性和生物利用度不好的生物活性物質(zhì)來提高其QS抑制能力，以增強(qiáng)其在水產(chǎn)品保鮮和包裝中的應(yīng)用潛力。Ilk等[77]研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖-山柰酚復(fù)合納米顆?？梢燥@著提高山柰酚QS抑制作用并且其抑制作用可在較長的一段時間（30 d）得到保持；Subhaswaraj等[78]合成了殼聚糖-肉桂醛納米顆粒，并發(fā)現(xiàn)其在1 mg/mL質(zhì)量濃度下可通過干擾P.aeruginosa的LasI/R和RhlI/R系統(tǒng)來抑制生物被膜的形成以及群集和泳動能力；Ibrahim等[79]合成了膳食殼聚糖槲皮素納米顆粒，其可以顯著下調(diào)氣單胞菌QS相關(guān)ahyI和ahyR基因的表達(dá)，以達(dá)到抑制羅非魚體內(nèi)的氣單胞菌QS系統(tǒng)的目的，并且這種納米顆?？勺鳛檠a(bǔ)充劑添加到羅非魚飼料當(dāng)中，擴(kuò)大了QSIs的應(yīng)用范圍。

6 結(jié)語

QSIs在針對水產(chǎn)品常見致病和腐敗菌的控制方面具有一定優(yōu)勢，但仍有很多可作為QSIs不同來源的天然抑菌劑有待開發(fā)。另外，雖然一些抗菌物質(zhì)（包括一些植物和微生物的提取物）被證實(shí)具有QS抑制作用，可以作為潛在QSIs，但其對QS抑制的主要功能成分以及結(jié)構(gòu)還有待挖掘，QS抑制機(jī)制也需要深入研究。組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為研究QSIs的抑制機(jī)制提供了輔助支持，未來研究可結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等組學(xué)技術(shù)，多維度解析QSIs的抑制機(jī)制。此外，除了現(xiàn)有QSIs篩選報(bào)告系統(tǒng)，可以考慮開發(fā)靈敏度和準(zhǔn)確性更高的QS報(bào)告和檢測系統(tǒng)，同時輔助基于計(jì)算的篩選技術(shù)，提高QSIs篩選效率。由于QS系統(tǒng)的復(fù)雜性，QSIs的抑制作用有一定的特異性（針對特定菌屬或者某一類QS系統(tǒng)），未來可以考慮基于天然產(chǎn)物篩選或通過人工設(shè)計(jì)開發(fā)具有更廣泛抑制功能的QSIs，同時QSIs安全性也需要采用合理的方法進(jìn)行評估，以實(shí)現(xiàn)其在水產(chǎn)品鮮度和微生物安全控制方面的應(yīng)用。