苗長(zhǎng)瑜 劉東璞 楊曉帆 張輝

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生態(tài)-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 佳木斯 154000)

肝纖維化最突出的病理特點(diǎn)之一是肝組織細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過(guò)度增多和沉積,也就是出現(xiàn)了ECM的代謝障礙,即合成增加,降解減少。當(dāng)ECM沉積在竇周隙,必然伴有竇內(nèi)皮細(xì)胞的改變,使得肝細(xì)胞與血液之間的通透性出現(xiàn)障礙,影響血流與肝細(xì)胞之間的物質(zhì)交換。大鼠肝組織病理性增生ECM的主要來(lái)源細(xì)胞是門管區(qū)成纖維細(xì)胞〔1〕。在生理情況下,組織內(nèi)門管區(qū)成纖維細(xì)胞是一個(gè)較為穩(wěn)定、靜止型的細(xì)胞,肝纖維化發(fā)生時(shí),門管區(qū)成纖維細(xì)胞受到轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1等細(xì)胞因子的刺激,變成活化的門管區(qū)成纖維細(xì)胞,產(chǎn)生過(guò)多的膠原纖維沉積造成肝血竇毛細(xì)血管化,影響肝細(xì)胞的新陳代謝。門管區(qū)成纖維細(xì)胞主要的產(chǎn)物是細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原纖維,除此之外,還可表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶類(MMPs)及其抑制物。MMPs是鼠類細(xì)胞外基質(zhì)降解酶類,可降解Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型膠原纖維〔2〕。金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP-1)是MMPs主要生理抑制物,能調(diào)節(jié)MMPs活性。TIMP-1是大多數(shù)MMPs的抑制物。門管區(qū)成纖維細(xì)胞表達(dá)的最重要的細(xì)胞因子之一是TGF-β1,TGF-β1是TIMP-1的上游激活物,可以引起TIMP-1的表達(dá)量增加,是最重要的促進(jìn)肝纖維化的細(xì)胞因子之一。四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化可以在早期被逆轉(zhuǎn),龍膽苦苷是一種被證明治療器官纖維化有效的藥物,秋水仙堿具有明顯的抑制肝纖維化作用,本實(shí)驗(yàn)計(jì)劃以秋水仙堿作為陽(yáng)性對(duì)照藥物,研究龍膽苦苷對(duì)大鼠肝纖維化的治療效果,并檢測(cè)肝組織中TGF-β1和TIMP-1表達(dá)水平的影響,進(jìn)一步闡明龍膽苦苷對(duì)肝纖維化的保護(hù)作用及其作用機(jī)制,為臨床藥物治療肝纖維化提供相關(guān)的理論數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 80只清潔級(jí)雄性SD大鼠,體質(zhì)量120～150 g。購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司。在佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)并進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.2材料 龍膽苦苷購(gòu)自南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司。CCl4、橄欖油試劑購(gòu)自南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司。高級(jí)切片石蠟購(gòu)自上海華玲康復(fù)器械廠。秋水仙堿片購(gòu)自江蘇萬(wàn)邦生化醫(yī)藥集團(tuán)有限責(zé)任公司。蘇木素-伊紅(HE)試劑盒、Masson三色染色液、抗TIMP-1抗體試劑、抗TGF-β1抗體試劑、鏈霉親和素-生物素-辣根過(guò)氧化物酶(SABC-HRP)試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。

1.3肝纖維化動(dòng)物模型建立及其計(jì)分標(biāo)準(zhǔn) 大鼠正常喂養(yǎng)2 w后隨機(jī)分成4組,正常組5只,模型組、秋水仙堿組、龍膽苦苷組各25只。各組普通飼料喂養(yǎng)。模型組、秋水仙堿組和龍膽苦苷組每周腹腔注射兩次40%CCl4橄欖油溶液(1 ml/kg),正常組和模型組大鼠每周灌胃10 ml/kg的生理鹽水3次,龍膽苦苷組每周灌胃龍膽苦苷(100 mg/kg)3次〔3〕,秋水仙堿組每周灌胃秋水仙堿(0.12 mg/kg)3次,龍膽苦苷與秋水仙堿均溶于生理鹽水中,按10 ml/kg灌胃。實(shí)驗(yàn)中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠體質(zhì)量變化。在第3、5、7周各處死1只大鼠,取肝組織,進(jìn)行HE染色觀察肝纖維化程度。第8周處死全部大鼠,取肝組織進(jìn)行HE染色、Masson染色和免疫組化染色。

根據(jù)纖維化計(jì)分系統(tǒng)〔4〕對(duì)各組肝纖維化程度進(jìn)行比較：計(jì)分公式為L(zhǎng)+P+2(N+W),L指肝小葉內(nèi)的肝血竇周圍和中央靜脈周圍,P指門管區(qū),N代表纖維間隔數(shù)目,W指纖維間隔寬度。標(biāo)本內(nèi)僅一條細(xì)纖維間隔,W計(jì)為0.5分。本實(shí)驗(yàn)中大鼠的肝組織取材長(zhǎng)度都是至少1 cm。光鏡下肝組織無(wú)病理變化,計(jì)0分;中央靜脈周圍、肝血竇周圍出現(xiàn)纖維間隔,分布局限,數(shù)量較少,計(jì)1分;彌漫性分布,數(shù)量較多,計(jì)2分。門管區(qū)擴(kuò)大,無(wú)纖維間隔出現(xiàn),計(jì)1分;門管區(qū)擴(kuò)大,同時(shí)有纖維間隔出現(xiàn),計(jì)2分;門管區(qū)周圍出現(xiàn)肝硬化,計(jì)3分。每1 cm長(zhǎng)度的肝組織纖維間隔數(shù)目少于等于6個(gè),計(jì)1分;多于6個(gè),計(jì)2分;出現(xiàn)肝硬化,計(jì)3分。纖維間隔寬度細(xì)計(jì)1分;纖維間隔寬,分布疏松,計(jì)2分;纖維間隔寬,分布致密,計(jì)3分;纖維間隔分布面積≥2/3標(biāo)本面積計(jì)4分。

在免疫組化結(jié)果分析中,根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度分為4級(jí),無(wú)陽(yáng)性著色(陰性)計(jì)0分,淡黃色(弱陽(yáng)性)計(jì)1分,棕黃色(陽(yáng)性)計(jì)2分,棕褐色(強(qiáng)陽(yáng)性)計(jì)3分;根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)為4級(jí),≤25%計(jì)1分,26%～50%計(jì)2分,51%～75%計(jì)3分,>75%計(jì)4分,將兩項(xiàng)評(píng)分相乘得出最終積分結(jié)果〔5〕。

1.4HE染色 常規(guī)HE染色。光鏡下觀察各組大鼠肝組織的顯微形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.5Masson染色 光鏡下分析各組大鼠肝組織纖維間隔的數(shù)目與寬度及纖維間隔分布情況。

1.6免疫組織化學(xué)染色 烤片;脫蠟和水化;抗原修復(fù);細(xì)胞膜通透;滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;正常血清封閉;滴加第一抗體抗TGF-β1抗體試劑〔用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋為1∶100〕、抗TIMP-1抗體試劑(用PBS稀釋為1∶100)20 μl,37 ℃孵育2 h;滴加生物素化第二抗體孵育;二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。重點(diǎn)觀察各組TGF-β1和TIMP-1的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞種類及位置,比較各組肝組織TGF-β1和TIMP-1表達(dá)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS29.0軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組肝纖維化程度比較 正常組肝組織無(wú)纖維化,與正常組相比,模型組肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞,大量纖維間隔形成,肝纖維化程度計(jì)分顯著增加(P<0.05)。與模型組比較,秋水仙堿組與龍膽苦苷組肝纖維化程度較模型組顯著改善(P<0.05);秋水仙堿組與龍膽苦苷組肝纖維化程度計(jì)分比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組肝纖維化程度計(jì)分及免疫組化中TGF-β1和TIMP-1表達(dá)比較

2.2各組肝組織形態(tài)變化 光鏡下,正常組肝細(xì)胞索圍繞中心靜脈呈放射狀排列,未見病變。模型組大量增生膠原纖維向肝小葉內(nèi)穿插,形成較寬大的纖維間隔,從中心靜脈通過(guò)肝血竇到門管區(qū)或從門管區(qū)到門管區(qū)或從中心靜脈到中心靜脈,即形成橋接纖維化,出現(xiàn)彌漫的纖維組織增生,廣泛的纖維間隔分割肝小葉。纖維間隔中可見大量成纖維細(xì)胞。肝細(xì)胞腫脹,肝細(xì)胞索增厚,肝實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不規(guī)則,且出現(xiàn)小葉內(nèi)少數(shù)幾個(gè)肝細(xì)胞壞死,即出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死,可見中心靜脈旁有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組相比,龍膽苦苷組和秋水仙堿組纖維組織明顯減少,且纖維間隔變窄,纖維間隔中成纖維細(xì)胞明顯減少。肝細(xì)胞變性、炎癥得到明顯改善。見圖1。

圖1 各組肝組織形態(tài)(×100)

2.3各組肝組織TGF-β1、TIMP-1表達(dá) 光鏡下,正常組中無(wú)陽(yáng)性著色,模型組中TGF-β1和TIMP-1廣泛表達(dá)在門管區(qū)、肝血竇周圍及纖維間隔中,門管區(qū)成纖維細(xì)胞是主要的表達(dá)細(xì)胞,表達(dá)強(qiáng)度為棕褐色(強(qiáng)陽(yáng)性),陽(yáng)性細(xì)胞百分比為51%～75%,其中肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯小泡型脂肪變,中央靜脈及肝血竇出現(xiàn)不同程度的擴(kuò)張。秋水仙堿組與龍膽苦苷組TGF-β1和TIMP-1大部分分布于門管區(qū)及纖維間隔中,陽(yáng)性表達(dá)范圍與模型組相比明顯減弱,陽(yáng)性細(xì)胞百分比為25%～50%。見圖2。經(jīng)免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示：TGF-β1和TIMP-1在正常組肝組織中無(wú)表達(dá),在模型組中表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性,在秋水仙堿組、龍膽苦苷組中的表達(dá)量較模型組顯著下降(P<0.05);秋水仙堿組與龍膽苦苷組表達(dá)情況相比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見表1。

圖2 各組肝組織TGF-β1、TIMP-1表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色,×200)

3 討 論

光鏡下可見門管區(qū)及其周圍膠原纖維增生,并且沿肝血竇散在分布,互相連接,門管區(qū)及其周圍有大量成纖維細(xì)胞浸潤(rùn),門管區(qū)附近的肝細(xì)胞最先獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的供應(yīng),細(xì)胞代謝極為活躍,門管區(qū)成纖維細(xì)胞增生活躍的原因,早期主要源于門管區(qū)浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞旁分泌的TGF-β1,中晚期則主要源于其自分泌的TGF-β1,所以可以說(shuō)TGF-β1是造成肝纖維化嚴(yán)重的重要原因之一〔6〕。在肝纖維化中,增生的膠原纖維是過(guò)度沉積ECM的最主要成分,尤其是Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型膠原纖維,即Masson染色中所見的纖維間隔〔7〕。纖維間隔的出現(xiàn)是肝纖維化診斷的金標(biāo)準(zhǔn)〔8〕。

一般慢性肝臟病變會(huì)隨著肝纖維化程度的加重,纖維間隔的數(shù)目和寬度會(huì)相應(yīng)地增加,并且纖維間隔波及范圍會(huì)從門管區(qū)逐漸深入到小葉內(nèi)竇周區(qū)乃至中央靜脈區(qū)〔9〕。本實(shí)驗(yàn)中,大鼠肝纖維化形成區(qū)域主要集中在門管區(qū)及其周圍區(qū)域,造成大量門管區(qū)成纖維細(xì)胞的活化,活化后的門管區(qū)成纖維細(xì)胞合成ECM的能力顯著提高〔10〕。TGF-β1和TIMP-1的主要來(lái)源細(xì)胞之一就是活化的門管區(qū)成纖維細(xì)胞〔11〕。通過(guò)藥物影響活化的門管區(qū)成纖維細(xì)胞,干預(yù)其表達(dá)TGF-β1和TIMP-1的作用,實(shí)現(xiàn)對(duì)肝纖維化的預(yù)防乃至治療作用是本實(shí)驗(yàn)的中心主題。

秋水仙堿可以抑制ECM合成與分泌,能抑制肝臟纖維化,又能促進(jìn)纖維化基質(zhì)降解,可以解聚細(xì)胞骨架,抑制細(xì)胞的分裂增殖,在本實(shí)驗(yàn)中可以抑制活化的門管區(qū)成纖維細(xì)胞的增殖分裂,達(dá)到減少TGF-β1和TIMP-1的表達(dá)的作用〔12〕。王國(guó)英等〔13〕研究提示龍膽苦苷有明顯抗CCl4損肝及保肝作用。龍膽苦苷對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠具有一定保護(hù)肝臟功能等〔14〕。

門管區(qū)成纖維細(xì)胞可表達(dá)多種MMPs和TIMPs,具有明顯的隨時(shí)間變化的程序性表達(dá),即早期主要表達(dá)產(chǎn)物是MMPs,但沒有TIMPs。隨病變時(shí)間發(fā)展,主要表達(dá)產(chǎn)物變?yōu)門IMPs〔15〕。在肝纖維化形成后,TIMP-1及其上游激活物TGF-β1〔16〕是門管區(qū)成纖維細(xì)胞的主要表達(dá)產(chǎn)物,且在門管區(qū)成纖維細(xì)胞之間彼此作用,形成惡性循環(huán)〔17〕,TGF-β1會(huì)刺激門管區(qū)成纖維細(xì)胞合成大量的ECM〔18〕,且會(huì)抑制ECM降解酶〔19〕,是最重要的促纖維化因子之一〔20～22〕。本實(shí)驗(yàn)提示龍膽苦苷與秋水仙堿均具有抑制成纖維細(xì)胞增殖,減少膠原纖維沉積的作用效果,且可能是通過(guò)減少TGF-β1和TIMP-1的表達(dá)水平的作用機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。

感謝黑龍江省北藥與功能食品特色學(xué)科項(xiàng)目、微生態(tài)免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的大力支持。