廣西百色西番蓮莖基腐病病原菌分離與鑒定

楊翠鳳，滕 崢，余爵運(yùn)，林有林

（1.百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院，廣西百色 533000；2.百色市玉米研究所，廣西百色 533604）

西番蓮（Passiflora coeruleaL.）為西番蓮科（Passifloraceae）西番蓮屬（Passiflora）多年生常綠攀緣性藤本果樹，因其果汁可散發(fā)出多種水果的香味，又名百香果［1］。西番蓮產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益顯著，在廣西發(fā)展迅猛，是農(nóng)村農(nóng)民脫貧致富和鄉(xiāng)村振興重點(diǎn)推廣的經(jīng)濟(jì)作物。在中國(guó)南亞熱帶地區(qū)，西番蓮被列為重點(diǎn)開發(fā)的作物之一，西番蓮飲料還被列為中國(guó)國(guó)家級(jí)“星火”計(jì)劃項(xiàng)目、“七五”重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目以及福建、廣西等省份的“出口創(chuàng)匯”發(fā)展項(xiàng)目、“優(yōu)果工程”的新目標(biāo)［2，3］。研究表明，引起植物的莖基腐病主要病原菌為鐮孢屬（FusariumLink ex Fr.）、腐霉屬（Pythium）兩大類。莖基腐病的最初侵染源主要分布在病土以及植物病殘?bào)w內(nèi)越冬的卵孢子、田間土壤、帶菌的種子和植物病殘?bào)w。對(duì)病原侵染組織后的植株細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)鐮孢菌主要分布在植物的韌皮部，而腐霉菌主要分布在植物的導(dǎo)管［4］。莖基腐病對(duì)小麥、番茄、玉米等作物均有著極其嚴(yán)重的危害［5-9］。莖基腐病是西番蓮生產(chǎn)上主要病害之一，嚴(yán)重影響著西番蓮種植業(yè)的發(fā)展，尤其是在炎熱多雨高濕的季節(jié)，氣候條件對(duì)西番蓮莖基腐病病原菌的傳播及繁殖極其有利，引起西番蓮莖基腐病病害的急劇加重。林壽峰等［10］、李德福等［11，12］對(duì)病原物進(jìn)行分離培養(yǎng)、鏡檢及致病性測(cè)定表明，導(dǎo)致福建省西番蓮莖基腐病的病原菌為茄腐皮鐮刀菌（Fusarium solani），有性世代為紅球絲赤殼菌（Netria haematoccoca），引起廣東西番蓮莖基腐病的病原菌也鑒定為腐皮鐮孢菌［Fusarium solani（Mart）Sacc］［13］，這些研究結(jié)果與巴西［14，15］、哥倫比亞地區(qū)［16］檢測(cè)結(jié)果一致。而鄭加協(xié)等［17］、黃盈等［18］通過對(duì)病原物分離培養(yǎng)、形態(tài)特征觀察與致病性測(cè)定等試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)另一種引起西番蓮莖基腐病發(fā)病的致病菌——鐮孢屬美麗組（Section Elegans Wr.）的尖鐮孢菌（Fusarium oxysporumSchlecht）。陳星［19］研究結(jié)果表明引起廣西防城港西番蓮莖基腐病發(fā)病的致病菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium axysporum），研究結(jié)果與巴西少部分地區(qū)檢測(cè)結(jié)果［20，21］一致。詹儒林等［22］采用常規(guī)鑒定法對(duì)海南瓊海西番蓮莖基腐病病原菌進(jìn)行鑒定，根據(jù)形態(tài)特征和最適生長(zhǎng)溫度將病原菌鑒定為煙草疫霉菌?？梢姡鹞鞣徢o基腐病的致病菌可能有多種，本研究擬明確廣西百色市百香果莖基腐病的主要致病菌，以期為進(jìn)一步對(duì)西番蓮莖基腐病有效防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材 試材為百色市石山地區(qū)西番蓮莖基腐病發(fā)病初期莖段，采樣時(shí)間及地點(diǎn)分別為2018 年凌云縣邏樓鎮(zhèn)、2018 年平果市太平鎮(zhèn)、2020 年田陽區(qū)坡洪鎮(zhèn)。

1.1.2 試劑 主要試劑：75%乙醇溶液、0.1% HgCl2溶液、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、瓊脂粉、丙三醇、工業(yè)乙醇等。其中，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g、瓊脂粉20 g、葡萄糖20 g、無菌水1 000 mL。

1.1.3 儀器 主要儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)、立式壓力蒸汽滅菌鍋、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、搖床、光學(xué)顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離、培養(yǎng)及純化 采用組織塊分離法進(jìn)行病原真菌的分離。于無菌超凈工作臺(tái)內(nèi)，用提前準(zhǔn)備的滅菌剪刀將西番蓮病害部位剪切為0.5 cm 大小的組織塊，剪切的組織塊需用75%乙醇溶液進(jìn)行30 s滅菌，用無菌水漂洗3 次，再用0.1%升汞進(jìn)行2 min 的消毒，無菌水漂洗3 次，將組織塊直接接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基接種3～5 塊組織塊，移至無菌培養(yǎng)室內(nèi)，置于28 ℃隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定時(shí)觀察菌落生長(zhǎng)情況并進(jìn)行詳細(xì)記錄。采用三點(diǎn)接種法對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行純化培養(yǎng)。分別采用試管斜面貯藏法和甘油貯藏法對(duì)菌株進(jìn)行短期和長(zhǎng)期保存。

1.2.2 菌株鑒定

1）形態(tài)學(xué)觀察：觀察目標(biāo)菌株菌落顏色、邊緣生長(zhǎng)情況、菌絲形狀等，挑取菌絲于載玻片上制成臨時(shí)裝片，使用光學(xué)顯微鏡觀察孢子形態(tài)、大小，初步確定所分離病菌所屬種類。

2）致病性測(cè)定：采用科赫法則進(jìn)行病原物致病性測(cè)定，于超凈工作臺(tái)上接種百香果莖基腐病病原菌菌懸液，接種的液體培養(yǎng)基菌懸液移至搖床培養(yǎng)8 h（溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min），然后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，制備成1.0×108個(gè)孢子/mL 懸浮液。用解剖針分別將百香果離體莖段和幼苗基部表皮刺傷5～8針，然后將制備的孢子懸浮液均勻涂抹患處，接種后定期觀察發(fā)病情況，并從病斑組織上再次分離病原物。

3）菌株rDNA-ITS 序列測(cè)定：采用小批量DNA提取試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）提取菌株基因組總DNA。利用通用引物ITS1：5′-TAT AGCATT CCCCGTTTA-3′，ITS4：5′-TCCTAA TAA ACCAATTGC-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL：2×TaqMasterMix 25 μL、上游引物和下游引物各2 μL，DNA 模板4 μL、ddH2O 17 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1.5 min，共35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將PCR 產(chǎn)物回收純化后連接至pMD18-T 連接載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆送至南寧國(guó)拓生物科技有限公司測(cè)序。

采用DNAStar對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析，然后在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，利用Mega 5.05軟件進(jìn)行相應(yīng)序列的同源性分析，并采用Neighbor-Joining（NJ）鄰接法自展1 000次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)特征

采用組織塊分離法進(jìn)行西番蓮莖基腐病病原真菌的分離，經(jīng)分離純化后得到6 株菌株，其中從平果市太平鎮(zhèn)紫香1 號(hào)西番蓮莖基腐病植株中分離到2株真菌，編號(hào)為ZB1、ZC1，從凌云縣邏樓鎮(zhèn)紫香1 號(hào)西番蓮莖基腐病植株中分離到2 株真菌，編號(hào)為Y1-1、Y4-2，從田陽區(qū)坡洪鎮(zhèn)臺(tái)農(nóng)1 號(hào)西番蓮莖基腐病植株中分離到2 株真菌，編號(hào)為BS-3、BS-4。6株菌株菌落呈均勻或綿絮狀，多為白色或灰白色，氣生菌絲茂盛至十分茂盛，稠密或蓬松，邊緣明顯。其中ZB1 和BS-3 的菌落特征與霉菌菌落特征最為相似，ZC1、Y1-1、Y4-2、BS-4 與鐮刀菌菌落特征相似，具體如圖1 和表1 所示。

表1 菌株形態(tài)特征

圖1 菌株菌落形態(tài)

2.2 接種后發(fā)病部位特征

“2.1”菌株的離體接種致病力鑒定中以BS-4 菌株的致病力最強(qiáng)，接種BS-4 菌株后45 d 觀察的臺(tái)農(nóng)1 號(hào)西番蓮植株形態(tài)如圖2 所示。具體表現(xiàn)：發(fā)病部位為距離地面約10 cm 的植株根部，初期癥狀表現(xiàn)為水漬狀暗褐色病斑，一段時(shí)間后病斑部位凹陷呈海綿狀腐爛，隨著腐爛癥狀加深，植株皮層腐爛脫落，顯露出莖段內(nèi)木質(zhì)部，病害部位表皮覆蓋有粉紅色病原物，伴隨著根部的腐爛，葉片逐漸枯萎，果實(shí)逐漸萎縮干癟，直至整株死亡。

圖2 西番蓮莖基腐病發(fā)病癥狀

2.3 菌株ITS 序列測(cè)定

通過測(cè)定rDNA-ITS 序列對(duì)菌株進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果（圖3、表2）表明，從田陽區(qū)坡洪鎮(zhèn)臺(tái)農(nóng)1 號(hào)西番蓮莖基腐病分離到的BS-4 菌株與尖孢鐮刀菌的親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)98%；從凌云縣邏樓鎮(zhèn)紫香1 號(hào)西番蓮莖基腐病分離到的Y1-1 菌株與串珠鐮刀菌（Fusarium proliferatum）的親緣關(guān)系最近，同源性為100%；從平果市太平鎮(zhèn)紫香1 號(hào)西番蓮莖基腐病分離到的ZB1 菌株與焦腐病菌（Lasiodiplodia theobromae）的親緣關(guān)系最近，同源性為100%；從田陽區(qū)坡洪鎮(zhèn)臺(tái)農(nóng)1 號(hào)西番蓮莖基腐病分離到的BS-3 菌株與煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）的親緣關(guān)系最近，同源性為99%；而ZC1 與Y4-2 菌株尚未鑒定到種，有待進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

表2 菌株分子鑒定結(jié)果

圖3 基于菌株rDNA-ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

鐮孢菌屬真菌是常見的病原真菌，常引起植株莖腐、根腐、枯萎等，其作為莖基腐病的病原在很多作物的研究中已得到證實(shí)，如腐皮鐮刀菌為甘薯莖基腐病的主要致病菌［23］，此次研究從廣西百色市西番蓮莖基腐病病株中分離得到6 株病原真菌，有4 株被鑒定為鐮刀菌屬，說明鐮刀菌是西番蓮莖基腐病的主要致病菌。腐皮鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、煙草疫霉菌已被鑒定為西番蓮莖基腐病的病原菌，引起福建省西番蓮莖基腐病的致病菌有腐皮鐮刀菌和尖孢鐮刀菌［11，12］，導(dǎo)致廣東省西番蓮莖基腐病的致病菌為腐皮鐮刀菌［13］，引起廣西防城港市西番蓮莖基腐病的致病菌為尖孢鐮刀菌［19］，本研究在廣西百色市同樣分離得到尖孢鐮刀菌，與廣西防城港市分離得到的結(jié)果一致，推測(cè)引起廣西西番蓮莖基腐病的優(yōu)勢(shì)致病菌為尖孢鐮刀菌。

通過對(duì)西番蓮莖基腐病癥狀觀察發(fā)現(xiàn)，西番蓮發(fā)病部位出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象，結(jié)合邱金忠［24］研究報(bào)道中指出霉腐菌也為西番蓮莖基腐病混合致病菌，本研究采集的西番蓮莖基腐病病害樣本中分離得到煙草疫霉菌、焦腐病菌，證實(shí)霉腐菌為引起西番蓮莖基腐病病害的混合致病菌之一。此外，本研究從西番蓮莖基腐病發(fā)病部位還分離獲得了除常見病原菌之外的焦腐病菌、串珠鐮刀菌，以上研究結(jié)果對(duì)西番蓮莖基腐病的有效防治與生產(chǎn)實(shí)踐具有重要的理論指導(dǎo)意義。

4 小結(jié)

本次研究從廣西百色市西番蓮莖基腐病發(fā)病部位分離得到6 種不同類型的病原菌，其中4 株分別鑒定為尖孢鐮刀菌、煙草疫霉菌、焦腐病菌和串珠鐮刀菌，2 株為鐮刀菌，尚未鑒定到種，表明西番蓮莖基腐病是由單一或多種致病菌混合侵染引起的真菌病害，結(jié)合研究成果，推測(cè)尖孢鐮刀菌是廣西西番蓮莖基腐病的優(yōu)勢(shì)致病菌。