劉柘君，劉振權，孫文燕

（1. 北京中醫(yī)藥大學 中醫(yī)學院，北京 100029；2. 北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 100029）

益生菌是指一類對人體有益處的微生物有機體，通常在人體腸道黏膜中定植，發(fā)揮維持腸道生態(tài)平衡、增強機體免疫力等重要作用[1]。隨著研究不斷深入，益生菌用于消化系統(tǒng)腫瘤患者和手術患者預后的輔助用藥[2]。中醫(yī)學者則通常立足于臟象氣血理論，認為人體“正氣存內，邪不可干”，此處的“正氣”即機體抵御病邪的能力，即西醫(yī)中的免疫力一詞，治法多著眼于扶正祛邪、補中益氣[3]。本研究根據《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》中有關增強免疫力的檢測方法，研究復方益生菌粉增強小鼠免疫力的效果。

1 材料與方法

1.1 受試材料

鼠李糖乳桿菌R9639（活菌數2000億CFU/g）、干酪乳桿菌Zhang（活菌數2000億CFU/g）及植物乳桿菌P9（活菌數2000億CFU/g）（北京科拓恒通），按照質量比4:2:4比例混合。

1.2 實驗動物及給藥

SPF級ICR雌性小鼠200只，體重18～22 g（北京維通利華），適應性飼養(yǎng)7 d后，隨機分為A、B、C、D和E 5個大組，每大組再隨機分為陰性對照組、低、中、高劑量組各10只，具體分組及各組實驗項目見表1。

表1 動物分組

用純凈水配制濃度為0.21，0.42，1.25 mg/(kg·d)復方益生菌粉，對低、中、高3個劑量組小鼠進行灌胃，陰性對照組灌胃給予同等體積純凈水。每日給藥1次，連續(xù)灌胃30 d后各組對應實驗項目進行檢測。

1.3 主要試劑和儀器

RPMI1640培養(yǎng)基（批號：SH30809.01，Hyclone）；四季青胎牛血清（批號：11011-8611，浙江天杭）；CCK8試劑盒（批號：CA1210，北京百瑞極）；刀豆蛋白A （Con A，批號：C8110），Hank’s液，瓊脂糖（批號：A8530），臺盼藍染色液（批號：C0040-50），Giemsa染液（批號：G1015）（北京索萊寶），NP40（批號：N8030）；綿羊紅細胞（SRBC，批號：HQ80073），雞紅細胞（批號：HQ80071）（鴻泉生物）；文奇氏試劑（批號：H1025，上海源葉）；乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒（批號：A020-2，南京建成生物工程研究所）。

CO2培養(yǎng)箱（松下健康醫(yī)療器械）；96孔板（美國康寧costar）；倒置顯微鏡（日本OLYMPUS）；油鏡（日本OLYMPUS）；低速離心機（北京北利時代）；酶標儀（BIO-TEK）。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠體重差值及臟器/體重比 取小鼠胸腺和脾臟稱重，計算小鼠體重、胸腺/體重比值及脾臟/體重比值。

1.4.2 小鼠體液免疫功能影響

1.4.2.1 血清溶血素半數溶血值（HC50）測定 于第31天對B組小鼠腹腔注射0.2 ml 的2 %（V/V）SRBC，并于注射后第4 d摘眼球取血，置入離心管，離心1 h后收取上層血清。將血清稀釋300倍后取50 μl置于96孔板，依次加入25 μl 10 %（V/V）SRBC和50 μl已制備好的補體，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱30 min后終止反應并再次離心取0.05 ml上清，加文奇氏試劑0.15 ml作為樣品。同時設半數溶血孔，取12.5 μl 10 %（V/V）SRBC，加文奇氏試劑至0.2 ml，各組試劑充分混合，放置10 min后，于540 nm下測定各孔A值。溶血素具體數值以半數溶血值（HC50）表示，按式（1）計算。

1.4.2.2 抗體生成細胞檢測 將1 ml 壓積SRBC加至5 ml空白小鼠血清中，于4 ℃冰箱放置30 min，離心取上清，-70 ℃保存作為補體待用。并于第31天對B組小鼠腹腔注射0.2 ml 的2 %（V/V）SRBC，注射后第4天處死各組小鼠并取出脾臟于Hank’s液中保存，磨碎脾臟篩網過濾并離心制成細胞懸液，細胞濃度調整為5×106個/ml，待用。將表層培養(yǎng)基加熱溶解后置于45 ℃水浴保溫，與等體積 2倍濃度的Hank’s液混勻后，以每管0.5 ml的容量分裝于試管中，再加入50 μl的10 %（V/V）SRBC和20 μl脾細胞懸液，迅速混合，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻璃片上，待瓊脂糖凝固，將玻片水平扣放在片架上放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1.5 h，再加入已制備好補體，置于玻片凹槽內，培養(yǎng)1.5 h后，計數溶血空斑數。

1.4.3 小鼠細胞免疫功能影響

1.4.3.1 遲發(fā)型變態(tài)反應（DTH）測定 于第31天對A組每只小鼠腹腔注射0.2 ml 的2 %（V/V）SRBC，經4 d免疫后，精確測量小鼠的左后足趾厚度，并在測量部位皮下注射20 μl 20 %（V/V）SRBC再次致敏，經24 h再次免疫后，觀察并再次測量小鼠的左后足趾厚度，計算首次致敏后和再次致敏后小鼠左后足趾厚度的差值，即通過足趾腫脹度表征DTH的程度。

1.4.3.2 ConA誘導的淋巴細胞轉化試驗 于第31天對C組小鼠處死后浸于75 %乙醇中滅菌10 min，并在無菌條件下取出脾臟，制備無菌脾細胞懸液并用RPMI1640不完全培養(yǎng)基調整細胞濃度為3×106個/ml，按照CCK8法測定淋巴細胞增殖情況，將脾細胞分兩孔加入培養(yǎng)板，每孔200 μl，一孔加入15 μl ConA液，另一孔對照，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結束前4 h每孔吸取上清0.7 ml，加入100 μl不含牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基和10 μl CCK8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，結束時加入1 ml酸性異丙醇，混勻后于450 nm下測定A值，計算加入ConA和未加入ConA各孔的A差值，按式（2）計算。

1.4.4 小鼠單核-巨噬細胞功能影響

1.4.4.1 碳廓清實驗 取稀釋后濃度為10 ml/kg印度墨汁，于第31天尾靜脈注射E組小鼠，注射后開始計時，于注射后第2 min和第10 min分別眼眶取血20 μl，并分別與2 ml 0.1 % Na2CO3溶液混合均勻。于600 nm波長處檢測吸光度值（A），稱量小鼠肝重及脾重，并按式（3）（4）計算吞噬指數α。式中：K代表廓清指數；α代表吞噬指數。

1.4.4.2 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬實驗 于第31天將D組小鼠腹腔注射20 % SRBC 1 ml，并于0.5 h后處死小鼠并使其呈仰臥位，注射生理鹽水洗液2 ml至小鼠腹腔，按揉腹部1 min后吸出生理鹽水洗液1 ml，分別均勻的滴于2片載玻片上，移至37 ℃孵箱中孵育30 min。然后用生理鹽水漂洗載玻片后干燥。在甲醇溶液中固定1 min后，用4 %的Giemsa進行染色3 min，用蒸餾水漂洗晾干。通過40×顯微鏡觀察巨噬細胞的形態(tài)并計數，按式（5）（6）進行計算。

1.4.5 NK細胞活性

1.4.5.1 乳酸脫氫法（LDH）測定NK細胞活性 于第30天將靶細胞YAC-1傳代培養(yǎng)并調整細胞濃度為4×105個/ml，并于第31天對C組小鼠處死后置于75 %乙醇中滅菌后無菌取脾鑷子磨碎后篩網過濾、離心棄上清液，向細胞漿中加入0.5 ml滅菌水20 s，再加入Hank’s液清洗3次并離心，用1 ml含小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，測定活細胞數量為95 %以上后，用RPMI1640 完全培養(yǎng)基制成脾的單細胞懸液作為效應細胞，并調整細胞濃度為2×107個/ml，靶細胞和效應細胞比例約為50:1。取靶細胞和效應細胞溶液各50 μl，加入U型96孔板中，其中靶細胞自然釋放孔中分別加入靶細胞和培養(yǎng)液各100 μl，靶細胞最大釋放孔分別加靶細胞和1 % NP40各100 μl，均設3個平行孔，37 ℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，離心5 min，吸取上清100 μl鋪于新的96孔板中，加入LDH基質液100 μl，室溫反應10 min后，加入鹽酸溶液（1 mol/L）30 μl終止反應，采用酶標儀490 nm處測定A值。按式（7）進行計算。

1.5 數據分析

應用SPSS19.0軟件對以上符合正態(tài)分布的計量數據資料進行單因素方差分析和組間LSD檢驗，若數據資料不符合正態(tài)分布，則采用非參數檢驗統(tǒng)計學處理。結果以平均值±標準差（±s）表示，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 小鼠體重差值及臟器/體重比

小鼠體重差值及臟器/體重比 結果見表2。由表2可見，實驗期間各組小鼠生長發(fā)育良好，體重隨給藥時間延長而增加，各劑量組與陰性對照組比較顯示差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。由圖1可見，各劑量組小鼠胸腺/體重比值及脾臟/體重比值與陰性對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果表明，不同劑量的復方益生菌粉對小鼠體重和淋巴器官影響較小。

表2 復方益生菌粉對小鼠體重的影響 （±s，n=10）

表2 復方益生菌粉對小鼠體重的影響 （±s，n=10）

組別 始重/g 終重/g高劑量組 23.32±1.05 29.85±1.40中劑量組 24.11±0.58 30.49±1.65低劑量組 23.71±0.67 30.69±2.36陰性對照組 23.40±1.00 31.06±1.45

圖1 復方益生菌對小鼠臟器/體重比值的影響

2.2 復方益生菌小鼠體液免疫功能影響

2.2.1 血清溶血素半數溶血值 結果見表3。由表3可見，低、中、高劑量組小鼠溶血素半數溶血值均高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結果表明，復方益生菌能有效促進SRBC細胞發(fā)生溶血反應，提高產生溶血素的能力。

2.2.2 抗體生成細胞數 結果見表3。由表3可見，低、中、高劑量組小鼠的抗體生成細胞數均高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結果表明，復方益生菌能有效增加小鼠抗體生成細胞的數量。

表3 復方益生菌粉對小鼠體液免疫的影響（±s，n=10）

表3 復方益生菌粉對小鼠體液免疫的影響（±s，n=10）

注：**P＜0.01 vs 陰性對照組

組別 HC50 溶血空斑數（個/全脾細胞）高劑量組 80.37±1.50** 313.90±53.28**中劑量組 76.73±0.70** 207.44±18.32**低劑量組 75.74±0.41** 151.78±14.29**陰性對照組 69.36±1.27 101.00±15.78

2.3 小鼠細胞免疫功能影響

2.3.1 遲發(fā)型變態(tài)反應 結果見表4。由表4可見，與陰性對照組相比低、中劑量組差異無統(tǒng)計學意義，而高劑量組小鼠的足趾腫脹程度差值顯著性增大（P＜0.01），因此可進一步猜測隨著劑量再次增加，其淋巴細胞誘導的細胞免疫功能可能會一定程度的再次增強。

表4 復方益生菌粉對小鼠細胞免疫的影響（±s，n=10）

表4 復方益生菌粉對小鼠細胞免疫的影響（±s，n=10）

注：**P＜0.01 vs 陰性對照組

足趾腫脹程度差值/mm高劑量組 0.222±0.010** 0.215±0.097**中劑量組 0.185±0.017** 0.170±0.0945低劑量組 0.097±0.010** 0.117±0.071陰性對照組 0.069±0.018 0.105±0.086組別 淋巴細胞增殖能力

2.3.2 淋巴細胞增殖能力 結果見表4。由表4可見，隨著復方益生菌粉劑量的增加，低、中、高劑量組均能顯著增加ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化能力，促進淋巴細胞的增殖，低、中、高劑量組均高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結果表明，復方益生菌能有效增強小鼠的淋巴細胞免疫功能。

2.4 復方益生菌小鼠單核-巨噬細胞功能影響

2.4.1 小鼠碳廓清功能 結果見表5。由表5可見，低、中、高劑量組小鼠吞噬指數均高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結果表明，復方益生菌能針對小鼠的碳廓清功能有顯著增強作用，提高小鼠單核-巨噬細胞吞噬能力。

表5 復方益生菌粉對小鼠單核-巨噬細胞功能的影響（±s，n=10）

表5 復方益生菌粉對小鼠單核-巨噬細胞功能的影響（±s，n=10）

注：**P＜0.01 vs 陰性對照組

組別 吞噬率% 吞噬雞紅細胞指數 吞噬指數α高劑量組 4.16±0.40** 0.0416±0.004** 7.034±0.268**中劑量組 2.88±0.40** 0.029±0.004** 6.200±0.117**低劑量組 1.43±0.10** 0.014±0.001** 5.043±0.182**陰性對照組 0.81±0.16 0.008±0.001 4.303±0.262

2.4.2 腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞指數 結果見表5。由表5可見，低、中、高劑量組小鼠巨噬細胞的吞噬能力均高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結果表明，復方益生菌能增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬活性，提高小鼠單核-巨噬細胞的功能。

2.5 復方益生菌NK細胞活性

NK細胞活性結果見表6。由表6可見，低、中、高劑量組小鼠的NK細胞活性均高于陰性對照組，差異有顯著性（P＜0.01），復方益生菌能夠增強小鼠的NK細胞活性，增強NK細胞功能。

表6 復方益生菌粉對小鼠NK細胞活性的影響（±s，n=10）

表6 復方益生菌粉對小鼠NK細胞活性的影響（±s，n=10）

注：**P＜0.01 vs 陰性對照組

組別 細胞活性/%高劑量組 109.68±8.56**中劑量組 68.77±4.25**低劑量組 53.88±4.50**陰性對照組 34.94±4.28

3 結論與討論

機體免疫功能的強弱與抗疾病能力的強弱及疾病的預后具有密不可分的聯系[4-5]。單核-巨噬細胞和NK細胞主要參與非特異性免疫，T淋巴細胞主要參與細胞免疫，B淋巴細胞主要參與體液免疫，因此，以上細胞均在機體免疫反應過程中發(fā)揮重要作用[6]，其變化與否及變化程度是評價益生菌對機體免疫調節(jié)作用的重要指標。本文根據《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》有關檢測方法和判定標準，圍繞單核-巨噬細胞功能、NK細胞活性、體液免疫和細胞免疫等方面，評價并驗證復方益生菌粉對小鼠免疫功能的具體影響。

本文所用的復方益生菌粉由鼠李糖乳桿菌R9639、干酪乳桿菌Zhang和植物乳桿菌P9等3種益生菌菌株組成，菌株均為目前國內外重點開發(fā)的Lactobacillus屬細菌，均能耐受酸性胃液、堿性腸液，進入腸道并成功黏附于腸黏膜，通過影響多種細胞因子的釋放發(fā)揮抗炎等特性[7-9]。有研究表明，多種益生菌的復合搭配能更好地發(fā)揮益生菌本身的功能，促進CD8＋T淋巴細胞和B淋巴細胞增殖轉化，使前者發(fā)揮細胞毒作用釋放穿孔素等細胞因子攻擊病原微生物，使后者轉化為漿細胞分泌sIgA使病原微生物失去黏附功能，發(fā)揮維護腸道平衡、增加腸道免疫功能的作用，從而加強機體先天性免疫反應和適應性免疫反應[10-12]。

本研究結果表明，各劑量復方益生菌對小鼠胸腺指數和脾臟指數無差異，初步明確了其安全性。體液免疫實驗結果表明，低、中、高劑量的復方益生菌能使小鼠血清溶血素半數溶血值及抗體生成數顯著增加；細胞免疫實驗結果表明，高劑量復方益生菌能顯著增強小鼠遲發(fā)型免疫反應和淋巴細胞增殖能力；單核-巨噬細胞免疫實驗結果表明，低、中、高劑量復方益生菌能顯著增強小鼠碳廓清功能和巨噬細胞吞噬活性；最后通過NK細胞實驗表明，低、中、高劑量復方益生菌能顯著增強小鼠NK細胞功能和活性。

綜上所述，由3株益生菌組成的復合益生菌無明顯毒性作用，對小鼠健康狀態(tài)無顯著負面影響，并能從體液免疫、細胞免疫、單核-腹腔巨噬細胞吞噬能力和NK細胞活性等4個方面起到增強免疫功能的作用，通過《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》中對增強免疫力實驗結果判定標準的界定，認為該產品具有增強免疫力的作用，并為后續(xù)的開發(fā)和臨床應用提供了新的理論依據。