人絨毛膜促性腺激素對反復(fù)種植失敗不孕患者子宮內(nèi)膜容受性的影響

王 婧，段世超

(1.河南省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,河南 鄭州 450003;2.河南省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心,河南 鄭州 450003)

臨床上有一部分行輔助生殖助孕的不孕患者,其年齡<40歲、接受≥3個(gè)胚胎移植周期、累計(jì)移植≥4枚優(yōu)質(zhì)胚胎但未能成功妊娠,這類患者被診斷為反復(fù)種植失敗(repeated implantation failure,RIF)。子宮內(nèi)膜容受性與RIF患者的妊娠結(jié)局密切相關(guān)[1]。人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)能夠調(diào)節(jié)RIF患者的子宮內(nèi)膜容受性,促進(jìn)胚胎種植,改善妊娠結(jié)局,但其具體作用機(jī)制較復(fù)雜[2]。白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)通過影響胚胎種植窗期子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的蛻膜形態(tài)調(diào)節(jié)胚胎著床,LIF表達(dá)水平越高,子宮內(nèi)膜容受性越好,胚胎著床成功率越高,因此,LIF是子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志性因子,檢測子宮內(nèi)膜中LIF表達(dá)水平可以反映子宮內(nèi)膜容受性狀態(tài)[3]。基于此,本研究通過在體外構(gòu)建子宮內(nèi)膜和胚胎共培養(yǎng)模型,觀察HCG干預(yù)后子宮內(nèi)膜和胚胎共培養(yǎng)模型培養(yǎng)液中LIF表達(dá)的變化,探討HCG對RIF患者子宮內(nèi)膜容受性的影響,旨在為HCG改善RIF患者妊娠結(jié)局的臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

選擇2015年1月至2022年12月在河南省人民醫(yī)院行輔助生殖助孕的20例RIF患者為子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本的來源對象。病例納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡20～40歲;(2)不孕年限≥ 1 a;(3)體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)18～24 kg·m-2;(4)血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)<15 IU·L-1。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)子宮內(nèi)膜結(jié)核患者;(2)子宮內(nèi)膜異位癥患者;(3)存在宮腔積液;(4)存在直徑≥ 5 cm的子宮肌瘤。同時(shí)選擇40枚相同時(shí)間段行輔助生殖助孕并成功分娩、已無生育需求患者的實(shí)驗(yàn)室凍存胚胎為廢棄胚胎標(biāo)本的來源對象。本研究經(jīng)河南省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2022-182號),患者自愿簽署胚胎廢棄知情同意書。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,按照實(shí)驗(yàn)室胚胎廢棄相關(guān)規(guī)定處理標(biāo)本。

1.2 主要試劑與儀器

達(dá)爾伯克改良伊戈?duì)柵囵B(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、膠原酶、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、雌激素(estrogen,E2)、孕激素(progesterone,P)、HCG購自上海晶抗生物工程有限公司,LIF一抗及二抗、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒、增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光(enhanced electrochemical luminescence,ECL)試劑購自上海妙一生物技術(shù)有限公司;凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)

用一次性無菌子宮內(nèi)膜取樣器采集20例RIF患者月經(jīng)第14天的子宮內(nèi)膜組織。在無菌操作臺(tái)用解剖鑷剪碎子宮內(nèi)膜組織,用含體積分?jǐn)?shù)10% FBS、100 U·L-1青鏈霉素的DMEM洗滌3次,迅速移入含1 g·L-1膠原酶的離心管中,37 ℃消化2 h,加入DMEM終止消化,2 000 r·min-1離心5 min;棄上清,收集細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)細(xì)胞密度,按1×108L-1接種于60 mm3培養(yǎng)皿,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞聚合度超過95%時(shí),加入胰蛋白酶消化傳代,2 000 r·min-1離心5 min;靜置后收集沉淀物,加入細(xì)胞冷凍保護(hù)液混懸后分別置于1～20號凍存管中,置于液氮中保存?zhèn)溆肹4]。

1.3.2 子宮內(nèi)膜和胚胎體外共培養(yǎng)模型的構(gòu)建

參照YU等[5]的方法構(gòu)建40個(gè)子宮內(nèi)膜和胚胎體外共培養(yǎng)模型:從液氮中取出20個(gè)凍存管,立即置于37 ℃水浴箱中,完全解凍后,將每個(gè)凍存管的細(xì)胞懸液分成2份,分裝至40個(gè)含5 mL DMEM的離心管中,2 000 r·min-1離心5 min;收集40份細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)細(xì)胞密度,按每孔1×108L-1接種于10個(gè)4孔板中,每孔加入5 mL含有子宮內(nèi)膜細(xì)胞的細(xì)胞懸液;同時(shí),每孔加入2 mL子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)液(含1 mg·L-1E2和10 mg·L-1P的 DMEM)和1枚復(fù)蘇解凍成功的實(shí)驗(yàn)室廢棄胚胎,然后將其分為子宮內(nèi)膜-胚胎-HCG共培養(yǎng)組(試驗(yàn)組)和子宮內(nèi)膜-胚胎共培養(yǎng)組(對照組),每組20個(gè)共培養(yǎng)模型,均置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)第1天(D1),試驗(yàn)組加入1 mL HCG(1 mg·L-1),對照組加入1 mL子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)液(含 1 mg·L-1E2和10 mg·L-1P),連續(xù)培養(yǎng)7 d。

1.3.3 試驗(yàn)組和對照組培養(yǎng)液的收集

培養(yǎng)過程中,分別收集培養(yǎng)D1、第3天(D3)、第5天(D5)、第7天(D7)試驗(yàn)組和對照組培養(yǎng)液各1 mL,平均分成2份,每份0.5 mL,加入細(xì)胞冷凍保護(hù)液混懸后置于凍存管中,-20 ℃凍存。

另于培養(yǎng)D7收集試驗(yàn)組培養(yǎng)液5 mL,按每孔1×108L-1細(xì)胞密度接種于5孔板中,每孔1 mL,將5孔板分為陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1HCG組、2 mg·L-1HCG組、4 mg·L-1HCG組、5 mg·L-1HCG組,分別加入0、1、2、4、5 mg·L-1HCG 1 mL;同時(shí)收集對照組培養(yǎng)液5 mL,按每孔1×108L-1細(xì)胞密度接種于5孔板中,每孔1 mL,將5孔板分為陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1E2+10 mg·L-1P組、2 mg·L-1E2+20 mg·L-1P組、4 mg·L-1E2+40 mg·L-1P組、5 mg·L-1E2+50 mg·L-1P組,分別加入含0、1、2、4、5 mg·L-1E2和0、10、20、40、50 mg·L-1P的子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)液1 mL;以上各組均置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 d,分別收集試驗(yàn)組中各組及對照組中各組培養(yǎng)液各1 mL,平均分成2份,每份0.5 mL,加入細(xì)胞冷凍保護(hù)液混懸后置于凍存管中,-20 ℃凍存。

1.3.4 ELISA法檢測不同培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)組和對照組培養(yǎng)液中LIF水平

分別取D1、D3、D5、D7試驗(yàn)組和對照組凍存培養(yǎng)液各1份,解凍后,3 000 r·min-1離心15 min,取上清液,按照ELISA試劑盒說明書方法檢測LIF水平,顯色后,應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀檢測LIF在 450 nm波長處的吸光度值,根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算LIF水平。

1.3.5 Western blot法檢測不同培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)組和對照組培養(yǎng)液中的LIF蛋白相對表達(dá)量

分別取D1、D3、D5、D7試驗(yàn)組和對照組凍存培養(yǎng)液各1份,解凍后,用預(yù)冷的PBS重懸,加入裂解液于冰上裂解30 min,12 000 r·min-1離心 15 min;取上清液,采用BCA法測定蛋白濃度,每孔上樣30 μg蛋白,100 ℃煮沸5 min,進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白;采用轉(zhuǎn)膜儀在250 mA條件下濕法轉(zhuǎn)膜100 min,脫脂奶粉封閉 2 h;加入LIF一抗(滴度為11 000),4 ℃孵育過夜,洗膜3次,每次5 min;加入LIF二抗(滴度為 15 000),室溫孵育2 h,洗膜3次,每次5 min;采用ECL試劑顯色,凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像,應(yīng)用Image J軟件分析目的蛋白灰度值,以目的蛋白灰度值與β-actin內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3.6 ELISA法檢測不同濃度HCG或E2、P干預(yù)后的試驗(yàn)組和對照組培養(yǎng)液中LIF水平

分別取試驗(yàn)組中陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1HCG組、2 mg·L-1HCG組、4 mg·L-1HCG組、5 mg·L-1HCG組以及對照組中陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1E2+10 mg·L-1P組、2 mg·L-1E2+20 mg·L-1P組、4 mg·L-1E2+40 mg·L-1P組、5 mg·L-1E2+50 mg·L-1P組的凍存培養(yǎng)液各1份,解凍后,采用ELISA法檢測培養(yǎng)液中的LIF,操作步驟同“1.3.4”項(xiàng)。

1.3.7 Western blot法檢測不同濃度HCG或E2、P干預(yù)后的試驗(yàn)組和對照組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量

分別取試驗(yàn)組中陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1HCG組、2 mg·L-1HCG組、4 mg·L-1HCG組、5 mg·L-1HCG組以及對照組中陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1E2+10 mg·L-1P組、2 mg·L-1E2+20 mg·L-1P組、4 mg·L-1E2+40 mg·L-1P組、5 mg·L-1E2+50 mg·L-1P組的凍存培養(yǎng)液各1份,解凍后,采用Western blot法檢測培養(yǎng)液中的LIF蛋白相對表達(dá)量,操作步驟同“1.3.5”項(xiàng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)組和對照組培養(yǎng)液中LIF水平比較

D1、D3、D5、D7時(shí),試驗(yàn)組培養(yǎng)液中LIF水平均高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。試驗(yàn)組和對照組D3、D5、D7時(shí)培養(yǎng)液中LIF水平均高于D1時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);試驗(yàn)組和對照組D5、D7時(shí)培養(yǎng)液中LIF水平均高于D3時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);試驗(yàn)組和對照組D7時(shí)培養(yǎng)液中LIF水平均高于D5時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 不同培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)組和對照組培養(yǎng)液中LIF水平比較Tab.1 Comparison of the level of LIF protein in culture medium between the experimental group and thecontrol group at different culture time

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)組和對照組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量比較

D1、D3、D5、D7時(shí),試驗(yàn)組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量均高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。試驗(yàn)組和對照組D3、D5、D7時(shí)培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量均高于D1時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);試驗(yàn)組和對照組D5、D7時(shí)培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量均高于D3時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);試驗(yàn)組和對照組D7時(shí)培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量均高于D5時(shí),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見圖1和表2。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)組和對照組培養(yǎng)液中LIF蛋白的表達(dá)Fig.1 Expression of LIF protein in culture medium in the experimental group and the control group at different culture time

表2 不同培養(yǎng)時(shí)間試驗(yàn)組和對照組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量比較Tab.2 Comparison of the relative expression of LIF protein in culture medium between the experimental group and the control group at different culture time

2.3 不同濃度HCG或E2、P干預(yù)后試驗(yàn)組和對照組培養(yǎng)液中LIF水平比較

對照組陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1E2+10 mg·L-1P組、2 mg·L-1E2+20 mg·L-1P組、4 mg·L-1E2+40 mg·L-1P組、5 mg·L-1E2+50 mg·L-1P組培養(yǎng)液中LIF水平分別為(23.78±1.97)、(23.69±1.99)、(23.72±1.99)、(23.71±2.01)、(23.72±1.92)mg·L-1。對照組陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1E2+10 mg·L-1P組、2 mg·L-1E2+20 mg·L-1P組、4 mg·L-1E2+40 mg·L-1P組、5 mg·L-1E2+50 mg·L-1P組各組之間培養(yǎng)液中LIF水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。試驗(yàn)組陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1HCG組、2 mg·L-1HCG組、4 mg·L-1HCG組、5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF水平分別為(30.29±3.55)、(31.69±0.69)、(32.86±0.85)、(34.93±0.82)、(37.65±0.73)mg·L-1。試驗(yàn)組 1 mg·L-1HCG組、2 mg·L-1HCG組、4 mg·L-1HCG組、5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF水平高于陰性未干預(yù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);2 mg·L-1HCG組、4 mg·L-1HCG組、5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF水平高于1 mg·L-1HCG組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);4 mg·L-1HCG組、5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF水平高于2 mg·L-1HCG組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF水平高于 4 mg·L-1HCG組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。試驗(yàn)組陰性未干預(yù)組培養(yǎng)液中LIF水平高于對照組陰性未干預(yù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 1 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF水平高于1 mg·L-1E2+10 mg·L-1P組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF水平高于2 mg·L-1E2+20 mg·L-1P組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF水平高于4 mg·L-1E2+40 mg·L-1P組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF水平高于5 mg·L-1E2+50 mg·L-1P組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 不同濃度HCG或E2、P干預(yù)后試驗(yàn)組和對照組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量比較

對照組陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1E2+10 mg·L-1P組、2 mg·L-1E2+20 mg·L-1P組、4 mg·L-1E2+40 mg·L-1P組、5 mg·L-1E2+50 mg·L-1P組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量分別為0.33±0.01、0.33±0.01、0.34±0.01、0.34±0.01、0.34±0.01。對照組陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1E2+10 mg·L-1P組、2 mg·L-1E2+20 mg·L-1P組、4 mg·L-1E2+40 mg·L-1P組、5 mg·L-1E2+50 mg·L-1P組各組之間培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。試驗(yàn)組陰性未干預(yù)組、1 mg·L-1HCG組、2 mg·L-1HCG組、4 mg·L-1HCG組、5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量分別為0.87±0.02、1.01±0.02、1.39±0.03、1.67±0.04、2.03±0.03。試驗(yàn)組1 mg·L-1HCG組、2 mg·L-1HCG組、4 mg·L-1HCG組、5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量高于陰性未干預(yù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);2 mg·L-1HCG組、4 mg·L-1HCG組、5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量高于1 mg·L-1HCG組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);4 mg·L-1HCG組、5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量高于2 mg·L-1HCG組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量高于4 mg·L-1HCG組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。試驗(yàn)組陰性未干預(yù)組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量高于對照組陰性未干預(yù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。1 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量高于1 mg·L-1E2+10 mg·L-1P組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量高于2 mg·L-1E2+20 mg·L-1P組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量高于4 mg·L-1E2+40 mg·L-1P組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5 mg·L-1HCG組培養(yǎng)液中LIF蛋白相對表達(dá)量高于5 mg·L-1E2+50 mg·L-1P組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見圖2。

A1:試驗(yàn)組陰性未干預(yù)組;A2:試驗(yàn)組1 mg·L-1 HCG組;A3:試驗(yàn)組2 mg·L-1 HCG組;A4:試驗(yàn)組4 mg·L-1 HCG組;A5:試驗(yàn)組5 mg·L-1 HCG組;B1:對照組陰性未干預(yù)組; B2:對照組1 mg·L-1 E2+10 mg·L-1 P組;B3:對照組2 mg·L-1 E2+20 mg·L-1 P組;B4:對照組4 mg·L-1 E2+40 mg·L-1 P組;B5:對照組5 mg·L-1 E2+50 mg·L-1 P組。

3 討論

輔助生殖技術(shù)的迅速發(fā)展為眾多不孕患者解決了生育難題,但部分不孕患者經(jīng)歷多次胚胎移植仍然未能獲得臨床妊娠,這類患者被稱為RIF[6]。子宮內(nèi)膜容受性是影響胚胎種植和妊娠結(jié)局的關(guān)鍵因素,RIF患者想要獲得良好的妊娠結(jié)局,必須改善其子宮腔內(nèi)環(huán)境,提高子宮內(nèi)膜容受性[7]。因此,如何提高RIF患者的子宮內(nèi)膜容受性是輔助生殖領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

HCG是胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞分泌的一種二聚體糖蛋白激素,是影響胚胎種植的關(guān)鍵信號分子[8]。有研究表明,HCG能夠調(diào)節(jié)RIF患者的子宮內(nèi)膜容受性,可能通過以下途徑發(fā)揮作用:HCG通過自分泌方式促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的分化,啟動(dòng)及控制胚胎種植前分泌絨毛的侵襲性,增加自然殺傷細(xì)胞的數(shù)量,加速滋養(yǎng)細(xì)胞對子宮內(nèi)膜的浸潤,促進(jìn)子宮內(nèi)膜血管內(nèi)皮生長因子、Ki67等因子的表達(dá),改善子宮腔內(nèi)環(huán)境[9];同時(shí),HCG通過旁分泌方式作用于子宮內(nèi)膜Treg細(xì)胞表面受體,促進(jìn)子宮內(nèi)膜Treg細(xì)胞歸巢,延遲子宮內(nèi)膜蛻膜化進(jìn)程,減少子宮內(nèi)膜蠕動(dòng),加速子宮內(nèi)膜增殖,提高子宮內(nèi)膜容受性,改善妊娠結(jié)局[10]。LIF是子宮內(nèi)膜與胚胎間傳遞信息的關(guān)鍵因子,在胚胎種植過程中,LIF能夠調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜局部免疫微環(huán)境,抑制嚴(yán)重炎癥反應(yīng),促進(jìn)子宮內(nèi)膜血管生成,豐富子宮內(nèi)膜血流供應(yīng),增加胚胎與子宮內(nèi)膜表面的黏附能力,提高胚胎侵襲力和種植力,促進(jìn)胚胎種植[11]。LIF同時(shí)也是子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志性因子,檢測子宮內(nèi)膜中LIF的分泌和表達(dá)能夠監(jiān)測子宮內(nèi)膜容受性的變化,反映子宮內(nèi)膜容受性的狀態(tài)[12]。本研究以此為背景,采用體外培養(yǎng)的方法,通過在體外構(gòu)建子宮內(nèi)膜和胚胎共培養(yǎng)模型,觀察HCG干預(yù)后子宮內(nèi)膜和胚胎共培養(yǎng)模型培養(yǎng)液中LIF表達(dá)的變化,探討HCG對RIF患者子宮內(nèi)膜容受性的影響。

AGHAJANZADEH等[13]研究發(fā)現(xiàn),HCG能夠調(diào)控RIF患者種植窗期子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞相關(guān)信號通路的開放,激活大量子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)信號因子的釋放,上調(diào)LIF蛋白的表達(dá),提高子宮內(nèi)膜容受性,促進(jìn)胚胎種植。胚胎種植發(fā)生于女性正常月經(jīng)周期排卵后6～7 d,故本研究選取RIF患者月經(jīng)第14天的子宮內(nèi)膜細(xì)胞作為飼養(yǎng)層,并以子宮內(nèi)膜和胚胎體外共培養(yǎng)模型建立后培養(yǎng)D1至D7天為檢測LIF表達(dá)的時(shí)間點(diǎn),與胚胎種植窗期的時(shí)間點(diǎn)相吻合。本研究結(jié)果顯示,在培養(yǎng)D1、D3、D5、D7時(shí),試驗(yàn)組培養(yǎng)液中的LIF水平和蛋白相對表達(dá)量均高于對照組;說明,HCG能夠激活子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞相關(guān)信號通路,促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞短暫、瞬間性分泌大量LIF;而對照組因?yàn)槿鄙貶CG,無法有效調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路,子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞無法迅速傳遞關(guān)鍵信息,導(dǎo)致LIF的分泌和表達(dá)低于試驗(yàn)組。以上結(jié)果提示,HCG對RIF患者LIF的分泌和表達(dá)具有促進(jìn)與誘導(dǎo)作用,HCG通過促進(jìn)LIF的高分泌表達(dá),提高子宮內(nèi)膜容受性,與AGHAJANZADEH等[13]的研究結(jié)果相符。子宮內(nèi)膜中LIF的分泌和表達(dá)水平能夠反映子宮內(nèi)膜容受性的狀態(tài),LIF表達(dá)水平越高,子宮內(nèi)膜容受性越好。本研究發(fā)現(xiàn),隨著培養(yǎng)時(shí)間增加,試驗(yàn)組和對照組LIF水平和蛋白相對表達(dá)量均逐漸增加,在培養(yǎng)D7時(shí)最高,說明種植窗期LIF的分泌和表達(dá)呈現(xiàn)逐步升高趨勢,子宮內(nèi)膜容受性在種植窗期D7時(shí)達(dá)到最佳狀態(tài),這與BALAKIER等[14]研究發(fā)現(xiàn)的女性正常月經(jīng)周期中排卵后6～7 d子宮內(nèi)膜容受性最好、最利于胚胎著床的結(jié)論是一致的。

REZAEE等[15]研究顯示,RIF患者胚胎移植前行宮腔灌注HCG治療,使用不同水平HCG可以獲得不同的妊娠結(jié)局。ALSBJERG等[16]研究發(fā)現(xiàn),RIF患者胚胎移植前行宮腔灌注HCG治療可以提高胚胎種植率,宮腔灌注液中的HCG水平與RIF患者的胚胎種植率及子宮內(nèi)膜容受性具有一定正向相關(guān)性,相對于低水平HCG,高水平HCG對子宮內(nèi)膜容受性的改善作用更加明顯。本研究選取LIF水平和蛋白相對表達(dá)量最高、子宮內(nèi)膜容受性最好的D7培養(yǎng)液,觀察HCG水平對LIF表達(dá)及子宮內(nèi)膜容受性的影響,結(jié)果顯示,隨著HCG濃度的增加,試驗(yàn)組培養(yǎng)液中的LIF水平和蛋白相對表達(dá)量逐漸升高;而隨著E2和P水平的增加,對照組培養(yǎng)液中的LIF水平和蛋白相對表達(dá)量無明顯變化;說明,HCG水平與子宮內(nèi)膜LIF的分泌和表達(dá)密切相關(guān),在子宮內(nèi)膜容受性達(dá)到最佳狀態(tài)時(shí),一定程度上增加HCG水平,能夠進(jìn)一步啟動(dòng)LIF的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),LIF的分泌和表達(dá)在原有基礎(chǔ)上可以繼續(xù)增加;而繼續(xù)增加E2和P水平并不能增加LIF的分泌和表達(dá)。此結(jié)果與ALSBJERG等[16]的研究結(jié)果相符。以上結(jié)果提示,HCG水平對LIF的分泌和表達(dá)呈現(xiàn)促進(jìn)作用,可以嘗試增加RIF患者的HCG水平以進(jìn)一步提高其子宮內(nèi)膜容受性。

4 結(jié)論

在體外共培養(yǎng)條件下,HCG能夠促進(jìn)RIF患者子宮內(nèi)膜LIF的分泌和表達(dá),提高RIF患者的子宮內(nèi)膜容受性。臨床工作中,RIF患者可以嘗試應(yīng)用HCG提高胚胎種植率,改善妊娠結(jié)局。但本研究尚有一定局限性:本研究僅發(fā)現(xiàn)LIF的分泌和表達(dá)具有一定的HCG濃度依賴性,對于HCG提高RIF患者子宮內(nèi)膜容受性的最佳濃度以及改善RIF患者妊娠結(jié)局的更多作用機(jī)制尚需在后期工作中進(jìn)一步研究。