黃鄭銘 朱 丹 陳 慧

非小細胞肺癌（NSCLC）是肺癌中最常見類型之一，預(yù)后較差，5 年生存率不足20%，尤其是晚期患者5 年生存率僅2%左右[1-2]。尋找精準(zhǔn)可靠、能夠?qū)崟r預(yù)測預(yù)后的指標(biāo)成為臨床亟待解決的問題。腫瘤免疫逃逸是腫瘤惡性進展的重要過程，其機制十分復(fù)雜，機體在清除腫瘤細胞時，也會對腫瘤細胞抗原性進行重塑，從而改變免疫效應(yīng)細胞的監(jiān)視作用[3]。CD8+T 細胞是機體關(guān)鍵的腫瘤細胞毒T 細胞，其細胞表面能夠表達NK 相關(guān)受體，包括NK 活化性受體（NK activating receptor，NKG2D）及抑制性受體（NK inhibitory receptor，NKG2A），通過與相應(yīng)配體結(jié)合發(fā)揮作用[4]。癌細胞表面表達NKG2D 配體（NKG2D ligand，NKG2DL）能夠與T 細胞相應(yīng)受體結(jié)合從而被清除，或表達NKG2AL 而發(fā)生免疫逃逸[5]。研究發(fā)現(xiàn)，中藥輔助治療晚期NSCLC 能夠促進CD8+T 細胞表面NKG2D 表達，且與CD8+T 細胞毒性正相關(guān)[6]。Borst 等[7]指出，CD8+T 細胞表面NKG2A 是一種晚期免疫檢查點，標(biāo)志著癌細胞活躍分裂的特異性。因此，推測CD8+T 細胞表面NKG2D 與NKG2A 表達在晚期NSCLC 細胞免疫逃逸效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討CD8+T 細胞表面NKG2D 與NKG2A表達與晚期NSCLC 患者臨床預(yù)后的關(guān)系，以期為晚期患者的治療提供指導(dǎo)。現(xiàn)報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2017 年10 月至2019 年9 月浙江省金華市中心醫(yī)院呼吸與危重癥學(xué)科收治的94例晚期NSCLC 患者，設(shè)為病例組，另按照2∶1 的比例選擇與病例組性別、年齡信息匹配的47 名健康體檢者為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過（審批號：2022820101）。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）符合美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）制定的NSCLC 臨床診治指南中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，且臨床分期TNM 分期為Ⅲ～Ⅳ期；（2）首診患者，且經(jīng)活檢證實為晚期NSCLC；（3）年齡18～80 歲；（4）東部腫瘤協(xié)作組（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）評分0～3 分；（5）預(yù)計生存期3 個月以上；（6）至少有1 個可測量或可評估病灶；（7）接受外周血CD8+T 細胞表面NK 相關(guān)受體檢測；（8）簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）既往接受放化療、靶向治療者；（2）伴其他部位原發(fā)性腫瘤；（3）無法明確病理類型者；（4）合并HIV、肝炎病毒感染且處于活動期者；（5）合并嚴(yán)重內(nèi)科疾病者；（6）近3 個月服用免疫抑制劑或激素類藥物者；（7）合并自身免疫性疾病者；（8）處于妊娠期或哺乳期；（9）有精神病史、器官移植病史者。

2 方 法

2.1 外周血中CD8+T 細胞表面NK 相關(guān)受體檢測病例組患者確診后治療前，對照組在體檢時，用含EDTA 抗凝劑的真空管采集空腹靜脈血4 mL，搖勻備用。將20 μL 熒光標(biāo)記單克隆抗體（CD3-PE-Cy7/CD8-Percp/NKG2D-APC、CD3-PE-Cy7/CD8-Percp/NKG2A-PE，抗體均購自美國BD 公司，CD3-PE-Cy7批號3410991；CD8-Percp 批號347314；NKG2DAPC 批號562064；NKG2A-PE 批號568953）加入EP管中，另設(shè)同型對照；各EP 管加入待測抗凝全血100 μL 混勻，避光孵育20 min，加入1000 μL 紅細胞裂解液繼續(xù)孵育10 min，離心取沉淀，PBS 重懸2次，最終用1%多聚甲醛重懸為200 μL，于BD FACSAria Ⅲ型流式細胞儀器上檢測，用FlowJo7.6軟件分析，以CD3 設(shè)門分選CD8+T 細胞亞群，最終分析CD3+CD8+T 細胞表面NKG2D+CD8+及NKG2A+CD8+細胞比率。

2.2 病歷資料收集 調(diào)取病例組患者入院后病歷資料，包括性別、年齡、有無吸煙史，病理類型、組織學(xué)分級、ECOG 評分[9]、TNM 分期及T 分期、N 分期、治療方案（一線化療或靶向治療）。

2.3 隨 訪 采用電話或調(diào)取門診病歷的方法進行為期3 年的隨訪，確診第1 年隨訪頻率3 個月1 次，之后半年隨訪1 次，以患者死亡或隨訪時間（3 年）截止為終點事件。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0 處理數(shù)據(jù)，正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，多樣本比較采用單因素方差分析，兩樣本比較行LSD-t 檢驗；計數(shù)資料用例數(shù)表示并行χ2檢驗；采用Kaplan-Meier 法分析NKG2D、NKG2A 表達與總生存期的關(guān)系，以COX 風(fēng)險比例模型進行預(yù)后生存單因素和多因素分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 對照組與病例組一般資料比較 病例組與對照組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。

表1 對照組與病例組一般資料比較

3.2 對照組與病例組外周血NKG2D+CD8+和NKG2A+CD8+表達比較 病例組外周血NKG2D+CD8+比率低于對照組，NKG2A+CD8+比率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 對照組與病例組外周血NKG2D+CD8+和NKG2A+CD8+表達比較（%，±s）

表2 對照組與病例組外周血NKG2D+CD8+和NKG2A+CD8+表達比較（%，±s）

注：對照組為健康體檢者；病例組為晚期非小細胞肺癌患者；NKG2D+CD8+ 為CD8+T 細胞表面NK 活化性受體；NKG2A+CD8+ 為CD8+細胞表面抑制性受體

組別對照組病例組t 值P 值例數(shù)47 94 NKG2D+CD8+95.30±2.02 83.19±3.15 21.813＜0.001 NKG2A+CD8+2.86±0.35 6.42±1.17 20.376＜0.001

3.3 晚期NSCLC 患者外周血NKG2D+CD8+和NKG2A+CD8+表達與臨床病理特征的關(guān)系分析 與ECOG 0 ～1 分、TNM Ⅲ期者比較，晚期NSCLC ECOG 2～3 分、TNM Ⅳ期患者NKG2D+CD8+比率較低，NKG2A+CD8+比率較高（P＜0.05）。見表3。

表3 晚期NSCLC 患者外周血NKG2D+CD8+和NKG2A+CD8+表達與臨床病理特征的關(guān)系（%，±s）

表3 晚期NSCLC 患者外周血NKG2D+CD8+和NKG2A+CD8+表達與臨床病理特征的關(guān)系（%，±s）

注：NSCLC 為非小細胞肺癌；NKG2D+CD8+為CD8+T 細胞表面NK 活化性受體；NKG2A+CD8+為CD8+T 細胞表面抑制性受體；ECOG 為東部腫瘤協(xié)作組

項目性別例數(shù)NKG2D+CD8+t（F）/P 值0.665/0.508 NKG2A+CD8+t（F）/P 值1.489/0.140男女56 38 84.20±3.29 84.65±3.11 6.56±1.18 6.21±1.02年齡（歲）＜60≥60吸煙史41 53 83.77±3.22 82.74±2.98 1.604/0.112 1.943/0.055 6.25±1.12 6.55±1.04 1.341/0.183 1.736/0.086無有58 36 83.68±3.24 82.40±3.11 6.27±0.97 6.66±1.19病理類型腺癌鱗癌其他組織學(xué)分級高分化中分化低分化ECOG 評分（分）0～1 2～3 T 分期T1～T3 T4 N 分期N0 N1～N3 TNM 分期73 15 6 13 44 37 90 4 59 35 15 79 83.31±3.24 83.20±3.15 81.72±3.11 84.10±3.15 83.29±3.10 82.75±3.02 83.36±3.20 79.27±3.06 83.66±3.24 82.40±3.07 84.14±3.19 83.01±3.02 0.676/0.511 0.976/0.381 2.505/0.014 1.858/0.066 1.317/0.191 5.529/＜0.001 6.37±0.95 6.57±1.10 6.60±1.18 6.39±0.95 6.43±1.12 6.77±1.21 6.38±0.85 7.29±1.38 6.28±1.04 6.65±1.18 6.10±1.07 6.28±1.13 0.365/0.695 0.406/0.667 2.041/0.044 1.585/0.116 1.203/0.232 2.594/0.011ⅢⅣ29 65 85.77±3.26 82.04±2.91 5.99±0.89 6.61±1.14治療方案化療靶向治療1.885/0.063 1.094/0.277 61 33 82.72±2.97 84.05±3.24 6.51±1.12 6.25±1.06

3.4 晚期NSCLC 患者外周血NKG2D+CD8+和NKG2A+CD8+表達與預(yù)后的關(guān)系 截止隨訪結(jié)束，共有4 例失訪，41 例死亡，49 例存活，死亡率為43.62%（41/94）。以平均值83.19%作為界值分為NKG2D 高表達組（46 例）和NKG2D 低表達組（48例），平均值6.42%作為界值分為NKG2A 高表達組（49 例）和NKG2A 低表達組（45 例）。Kaplan-Meier生存分析顯示，NKG2D 高表達與低表達患者累積生存率分別為71.0%、40.4%，平均生存時間分別為（23.97±1.65）、（31.17±1.31）個月，且NKG2D 高表達患者總生存時間較低表達患者延長（Logrank χ2=9.763，P=0.002）；NKG2A 低表達與高表達患者累積生存率分別為66.2%、45.1%，平均生存時間分別為（30.41±1.25）、（24.80±1.73）個月，且NKG2A 低表達患者總生存時間較高表達患者延長（Logrank χ2=5.353，P=0.021），見圖1。

圖1 NKG2D、NKG2A 不同表達水平患者兩組間累積生存率的Kaplan-Meier 曲線分析

3.5 晚期NSCLC 患者預(yù)后COX 回歸分析 COX多因素分析顯示，N1～N3 分期、TNM Ⅳ期、NKG2D低表達、NKG2A 高表達均為影響晚期NSCLC 患者總生存期的獨立危險因素（P＜0.05）。見表4。

表4 單因素與多因素COX 分析總生存期的影響因素

4 討 論

肺癌早期缺乏特異性癥狀，使其確診時多數(shù)已至晚期，尋找可靠生物標(biāo)志物評估患者病情及預(yù)后有重要臨床意義。T 細胞在抗腫瘤免疫中扮演重要角色。CD3+反映總體T 細胞亞群免疫狀態(tài)，CD3+CD4+T細胞是輔助其他免疫細胞發(fā)揮免疫效應(yīng)的亞群，其表達水平降低提示機體免疫功能下降[10]。CD8+T 細胞通過直接或間接調(diào)節(jié)抑制因子發(fā)揮與CD4+T 細胞相反的免疫學(xué)效應(yīng)[11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤性CD8+T 細胞表面常表達一類獨特的免疫效應(yīng)子群體NKG2D、NKG2A，同時NKG2A 也表達于所有NK 細胞[12]。van Montfoort 等[13]在小鼠腫瘤模型中證實，接種抗腫瘤疫苗后NKG2A 的阻斷效應(yīng)是通過CD8+T細胞進行，而非NK 細胞。Mojic 等[14]在腫瘤免疫治療中發(fā)現(xiàn)，NKG2D 能夠延遲腫瘤生長，并增加浸潤性CD8+T 細胞浸潤。由此可知，CD8+T 細胞表面NK 相關(guān)受體在抗腫瘤免疫效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

本研究顯示，病例組外周血NKG2D+CD8+比率低于對照組，NKG2A+CD8+比率高于對照組，說明晚期NSCLC 患者外周血中CD8+T 細胞表面NKG2D 低表達、NKG2A 高表達。NKG2D、NKG2A 及其配體均屬于先天性免疫系統(tǒng)的主要成員，能夠觸發(fā)NK、γδ 和CD8+T 細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[15]。NKG2DL 及NKG2AL在健康細胞表面少有表達，但在病毒感染及腫瘤細胞表面表達顯著增加，其與免疫細胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合后啟動免疫殺傷或抑制效應(yīng)[16]。Osaki 等[17]發(fā)現(xiàn)，胃癌細胞患者外周血CD8+NKG2D+表達降低，與本研究結(jié)果一致，說明NKG2D 低表達參與腫瘤細胞免疫逃逸。Ducoin 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，NKG2A 在人結(jié)直腸癌患者中富集，且能夠通過阻斷NKG2A 克服抗腫瘤免疫反應(yīng)，與本研究結(jié)果相符，說明CD8+NKG2A+高表達參與癌細胞免疫逃逸。

本研究發(fā)現(xiàn)，晚期NSCLC 患者ECOG 2～3 分、TNM Ⅳ期者NKG2D+CD8+比率較低，NKG2A+CD8+比率較高，提示NKG2D、NKG2A 表達與患者身體機能及臨床分期有關(guān)。ECOG 反映患者身體抗腫瘤治療的承受能力，在一定程度上也反映了機體的免疫功能[19]。隨著病情的進展，腫瘤細胞免疫逃逸增強，Ⅳ期NSCLC 患者CD8+T 細胞表面NKG2D 表達抑制及NKG2A 表達激活更為明顯，病情更為惡化[20]。本研究經(jīng)Kaplan-Meier 生存分析，NKG2D 高表達患者總生存時間較低表達患者延長，NKG2A 低表達患者較高表達患者延長，進一步COX 分析證實，NKG2D 低表達、NKG2A 高表達均是晚期NSCLC 患者總生存期的獨立危險因素。NKG2D+CD8+低表達時其與癌細胞表面配體結(jié)合產(chǎn)生的活化信號減弱，對NK 細胞毒活性的激活能力不足，而NKG2A+CD8+高表達進一步抑制了NK 細胞毒活性，二者共同促進了癌細胞逃避免疫監(jiān)視，不利于免疫系統(tǒng)識別并清除癌細胞，預(yù)后生存期相應(yīng)縮短[21-22]。

綜上所述，晚期NSCLC 患者外周血中CD8+T 細胞表面NKG2D 低表達、NKG2A 高表達，二者表達情況與患者身體機能、臨床分期及預(yù)后有關(guān)，可作為評估晚期NSCLC 患者預(yù)后的可靠參考指標(biāo)。但CD8+T細胞表面NKG2D 免疫激活與NKG2A 免疫抑制功能在NSCLC 患者中具體如何發(fā)揮作用，仍需要進一步深入探討。