基于HS-SPME-GC-MS分析墨蘭不同花器官香氣成分

丁麗瓊　羅清　覃茜　唐毓瑋　呂麗蘭　池昭錦

關(guān)鍵詞：墨蘭；花器官；香氣；HS-SPME-GC-MS

中圖分類號：S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

墨蘭（ Cymbidium sinense ） 為蘭科（Orchidaceae）蘭屬（Cymbidium Sw.）的地生植物，因其葉形優(yōu)美、品種豐富、花期恰逢春節(jié)而深受消費者歡迎[1]。墨蘭為國蘭代表性種類之一，其花香馥郁、沁人心脾[2]，為優(yōu)質(zhì)香料物質(zhì)，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值和觀賞價值[3]。香氣是構(gòu)成和影響花卉觀賞價值的重要因素，但由于花香的成分、結(jié)構(gòu)及其生物合成過程比較復(fù)雜，研究水平滯后于花形、花色等其他觀賞性狀的研究[4]。近年來由于分析技術(shù)的進(jìn)步，對蘭科植物香氣研究逐漸增多。BAEK 等[5]采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HS-SPME-GC-MS）對大花蕙蘭新雜交種陽光之鐘盛花期花器官揮發(fā)物進(jìn)行了測定，鑒定出23 種成分，其中柱中鑒定出12種化合物，唇瓣中鑒定出16 種化合物，萼片中鑒定出11 種化合物，花瓣中鑒定出9 種化合物。王元成等[6]采用HS-SPME 結(jié)合GC-MS 技術(shù)，對5種石斛花朵的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，共鑒定出110個揮發(fā)性成分，主要成分為烷類、烯類、醇類、酮類等，且不同石斛花朵的芳香成分不盡相同。晉宇軒等[7]采用SPMG 結(jié)合GC-MS 技術(shù)對貴州春蘭的花苞和花朵進(jìn)行檢測，結(jié)果檢測出揮發(fā)性成分分別為43 種和47 種，花苞中烴類含量最高，花朵中萜烯類的含量最高，橙花叔醇為主要花香成分。楊慧君等[8]采用SPME-GC-MS 聯(lián)用技術(shù)分析小桃紅花香成分，共鑒定出揮發(fā)性成分35 種，酯類物質(zhì)含量最多，主要花香成分為茉莉酸甲酯、茉莉酮酸甲酯和金合歡醇。許紅娟等[9]采用頂空固相萃取法結(jié)合氣相色譜和質(zhì)譜對蕙蘭守良梅花朵各部位（蕊柱、唇瓣、棒瓣、主瓣和副瓣）進(jìn)行香氣成分檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蕙蘭守良梅花朵蕊柱的主要香氣成分有7 類23 種，花朵5 個部位的醇類芳香物質(zhì)相對含量較高。魏丹等[10] 采用HS-SPME-GC-MS 聯(lián)用分析3 種蘭花鮮花的香氣成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蕙蘭鮮花的主要花香成分為桉油精、（E）-4-己基葵烯-6-炔等，墨蘭鮮花的主要花香成分為甲基-異丁子香酚、6-氧代庚酸甲酯等，春蘭鮮花的主要花香成分為α-芹子烯、十二烷等。目前未見墨蘭不同花器官的揮發(fā)性物質(zhì)成分的相關(guān)研究報道。鑒于此，本研究以墨蘭為材料，基于HS-SPME-GC-MS 技術(shù)探索墨蘭不同花器官的花香成分的差異，以期為培育香型蘭花新品種奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的材料為廣西亞熱帶作物研究所蘭花種質(zhì)資源圃培育多年生的墨蘭植株。在1 月份晴天10：00—11：00 選取開放第4 天盛花期的墨蘭花朵（圖1），取萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱4個部分各1 g（重復(fù)3 次），用于香氣成分測定，使用頂空固相微萃取方法萃取樣品中的香氣成分。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 將新鮮花朵的不同器官樣品加一級水混勻至50 mL 離心管中，分別取5 mL待測樣品、1.00 g 氯化鈉和10 μL 內(nèi)標(biāo)（4-甲基-2-戊醇，1.0018 g/L）置于20 mL 樣品瓶中，迅速用帶有聚四氟乙烯隔墊的蓋子擰緊，移至加熱和攪拌裝置中，在40 ℃下加熱攪拌30 min，攪拌速度為500 r/min。

1.2.2 頂空固相微萃?。℉S-SPME） 使用SPME萃取頭（50/30 μm DVB/Carboxen/PDMS， Supelco，Bellefonte， PA.， USA）與CTC CombiPAL 自動進(jìn)樣器（CTC Analytics， Zwingen， Switzerland）相連進(jìn)行自動化的頂空固相微萃取。經(jīng)過前處理的萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱分別取1 g 放入萃取瓶中，萼片、花瓣及唇瓣分別置于1 L 的萃取瓶中，蕊柱分別置于60 mL 萃取瓶中，50 ℃平衡10 min后，將已活化SPME 萃取頭插入萃取瓶的頂空部分，萃取30 min。之后取出SPME 萃取頭，立即插入GC 進(jìn)樣口在250 ℃條件下解析8 min。

1.2.3 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）條件 采用Agilent 6890 氣相色譜儀與Agilent 5975 質(zhì)譜儀相連，色譜柱采用HP-Innowax 毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm ×0.25 μm，J&W Scientific，F(xiàn)olsom，CA）分離鑒定芳香揮發(fā)物。

氣相色譜條件：載氣（He）流速為1 mL/min；采用不分流模式自動進(jìn)樣，升溫程序為50 ℃保持1 min，然后以3 ℃/min 升溫至220 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，電離方式為EI，電離能為70 ev，質(zhì)譜掃描范圍為m/z 29-350。

1.2.4 香氣物質(zhì)定性與定量分析方法 （1）定性分析。利用自動化質(zhì)譜圖解卷積和鑒定軟件（AMDIS）計算保留指數(shù)（retention index， RI）和質(zhì)譜圖信息。其中，有標(biāo)準(zhǔn)品的目標(biāo)組分，與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間和質(zhì)譜譜圖比較定性；沒有標(biāo)準(zhǔn)品的目標(biāo)組分，通過保留指數(shù)與NIST11 標(biāo)準(zhǔn)譜庫的RI 和質(zhì)譜譜圖比對進(jìn)行定性分析?；衔锏谋Ａ糁笖?shù)是通過分析相同色譜條件下C6-C24正烷烴保留指數(shù)計算得到。具體公式如下：

式中，I 為保留指數(shù)，t，t，t分別代表組分及碳數(shù)為n，n+1 正構(gòu)烷烴的保留時間。

（2）定量分析。配置1 L 含7 g/L 酒石酸和200 g/L 模擬水溶液，并用NaOH 調(diào)pH 至3.4。將溶解在乙醇（色譜級）的所有標(biāo)準(zhǔn)品溶液混合，并將混合液用模擬水溶液稀釋成連續(xù)的15 個濃度水平。在與樣品相同的條件下，提取并分析每個濃度水平的香氣標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過建立香氣物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線（橫坐標(biāo)：香氣化合物標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)4-甲基-2-戊醇的峰面積比，縱坐標(biāo)：該香氣化合物標(biāo)樣的濃度），對相關(guān)香氣化合物進(jìn)行定量分析。除此之外，其他沒有標(biāo)準(zhǔn)曲線的化合物通過相似結(jié)構(gòu)的化合物或者碳原子數(shù)相似的化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析[11]。相對含量為組分峰面積占總峰面積的百分比[12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各組分質(zhì)譜經(jīng)計算機(jī)譜庫檢索及資料分析并結(jié)合人工譜圖解析，確認(rèn)各個化學(xué)成分。使用Origin 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 墨蘭不同花器官揮發(fā)化合物組成

經(jīng)過GC-MC 分析，從墨蘭盛花期的花朵中檢測出7 類共54 種揮發(fā)性成分，主要由21 種醛類、12 種醇類、10 種酮類、5 種苯類、2 種呋喃類、2種酸類和2 種萜類化合物組成，其中醛類含量最高（圖2）。在不同器官中各種主要成分的含量不同，在萼片中醇類較其他3 個器官少，而酸類則較其他器官多1 種，花瓣及唇瓣中醛類較其他器官少1種，萼片及唇瓣中酮類較其他器官少。

在不同花器官中，墨蘭花的萼片、花瓣、唇瓣、蕊柱檢測出的香氣成分分別有49、51、48 和51 種。蕊柱及花瓣香氣的組成成分最多，其次是萼片，唇瓣較少。不同花器官揮發(fā)成分見表1。由圖3 可知，4 種組織均含有的化合物有48 種，包括19 種醛類（苯甲醛、2，4，-二甲基苯甲醛、丙醛、異戊醛、戊醛、巴豆醛、己醛、E-2-戊烯醛、庚醛、青葉醛、環(huán)戊基甲醛、（Z）-4-庚烯醛、E-2-庚烯醛、壬醛、（E，E）-2，4-己二烯醛 、E-2-辛烯醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛、鳶尾醛、2，4-辛二烯醛）；10 種醇類（甲醇、1-戊烯-3-醇、E-2-戊烯-1-醇、1-己醇、Z-3-己烯醇、蘑菇醇、2-丙基-1-戊醇、2-乙基己醇、E-2-辛烯醇、苯甲醇）；9 種酮類（甲基異丁酮、1-戊烯-3-酮、2-庚酮、環(huán)己酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、3，5-辛二烯-2-酮、2，2，6-三甲基環(huán)己酮、（E，E）-3，5-辛二烯-2-酮、異佛爾酮）；5 種苯類（甲苯、對乙基甲苯、1-乙基-2，4-二乙基苯、M-異丙基甲苯、1-溴萘）；2 種萜類（茶螺烷、2，4-二叔丁基苯酚）；2 種呋喃類（2-乙基呋喃、2-戊基呋喃）；1 種酸類為己酸。花瓣、萼片及蕊柱共有成分3 種（2，3-戊二酮、桉葉油醇、丙炔醇）。只在萼片中檢測到有2 種（2-甲基-4-戊醛和戊酸），丙烯醛只在蕊柱檢測出。

萼片中檢測出的香氣成分?jǐn)?shù)量中等但物質(zhì)含量最高，達(dá)99 106.15 μg/L，占總揮發(fā)性有機(jī)成分的35.88%?；ò昙叭镏鶛z測出的香氣成分?jǐn)?shù)量比萼片多2 種，物質(zhì)含量分別為56 571.48、78 868.68μg/L， 分別占總揮發(fā)性有機(jī)成分的20.48%和28.56%。唇瓣中檢測出的香氣成分?jǐn)?shù)量最少，物質(zhì)含量也最少，為41 645.32 μg/L，占總揮發(fā)性有機(jī)成分的15.08%。因此，墨蘭不同花器官香氣成分及其含量存在差異，萼片揮發(fā)性物質(zhì)含量最高與感官上的初步判斷一致。

在準(zhǔn)確定量的化合物中，醛類化合物含量最高，為239 760.71 μg/L；其次是醇類化合物為34 864.05 μg/L，苯類化合物為940.50 μg/L，酸類化合物為456.53 μg/L，酮類化合物為122.91 μg/L，萜類化合物為47.01 μg/L ， 最少的呋喃類為0.15 μg/L。檢測到醛類化合物中含量最高的是環(huán)戊基甲醛；醇類化合物中含量最高的是1-戊烯-3-醇；苯類化合物中含量最高的是2，4，-二甲基苯甲醛；酸類化合物中含量最高的是己酸；酮類化合物中含量較高的是甲基庚烯酮；萜類化合物中含量最高的是2，4-二叔丁基苯酚；呋喃類化合物中含量較高的是2-戊基呋喃。

2.2 墨蘭不同花器間香氣成分揮發(fā)量的差異

各化合物揮發(fā)量在不同器官中存在著明顯差異，且每個器官化合物含量不同（表2）。萼片中有11 種化合物含量均較其他3 個器官含量高，其中環(huán)戊基甲醛在萼片中含量最高，為41 248.26 μg/L，其次是花瓣為17 659.45 μg/L，唇瓣及蕊柱含量遠(yuǎn)低于萼片，分別比萼片少35 053.29、33 941.80 μg/L，具有薄荷的樟腦味。1-戊烯-3-醇在花瓣中含量最高（4170.67 μg/L），具有水果香味。唇瓣中丙醛、1- 戊烯-3- 酮、E-2- 戊烯醛、E-2- 戊烯-1- 醇、（E，E）-3，5-辛二烯-2-酮等5 種化合物含量均較其他3 個器官含量高，具有水果清香味。蕊柱中有18種化合物含量均較其他3 個器官含量高，其中E-2-庚烯醛在蕊柱中含量高達(dá)1 174.91 μg/L，其次是唇瓣552.74 μg/L，在萼片及花瓣中的含量為191.59、160.43 μg/L，具有青草香和油脂香。

2.3 不同花器官揮發(fā)物主成分分析

為了進(jìn)一步反應(yīng)墨蘭不同花器官香氣物質(zhì)構(gòu)成的差異，對4 個不同花器官的54 個揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行主成分分析。對于不同花器官與揮發(fā)性成分之間（圖4），第一主成分（PC1）的貢獻(xiàn)率為61.8%，第二主成分（PC2）的貢獻(xiàn)率為25.8%，前2 個主成分占總方差的87.6%，能夠很好的保留樣本原來的信息。4 種花器官中唇瓣和花瓣位于同一象限，表明差異性小。蕊柱單獨在PC1、PC2 負(fù)方向上，說明與其他器官差異性大。萼片單獨在PC1正方向、PC2 負(fù)方向上，也與其他器官差異性大。戊醛（4）、己醛（6）、E-2-戊烯醛（7）、E-2-己烯醛（10）、環(huán)戊基甲醛（11）、E-2-庚烯醛（13）、1-戊烯-3-醇（23）、E-2-戊烯-1-醇（25）在PC1和 PC2 上的貢獻(xiàn)較高，說明這些成分是花器官香氣釋放的主要揮發(fā)性成分。1-戊烯-3-醇（23）在 PC1 的正方向上貢獻(xiàn)最大，與花瓣呈正相關(guān)關(guān)系，且在花瓣中含量最高。己醛（6）在PC2的負(fù)方向上貢獻(xiàn)最大，與蕊柱呈正相關(guān)關(guān)系，且在蕊柱中含量最高。

3 討論

花香是植物的重要特征[36]，揮發(fā)性化合物的數(shù)量和類型是影響花香品質(zhì)的重要指標(biāo)，也決定了蘭花的商業(yè)價值。我國傳統(tǒng)的觀賞蘭花包括春蘭、蕙蘭、建蘭、墨蘭、寒蘭和蓮瓣蘭等系列，不同系列不同品種的蘭花香氣成分種類存在異同。不同品種蕙蘭[37]香氣成分主要為萜烯類、醇類、醛類、酯類、酮類、烷烴類和芳香烴，另有少量的酚類、酸類和醚類物質(zhì)，建蘭品種小桃紅主要香氣成分為酯類[8]，貴州春蘭揮發(fā)性成分和花香成分的主要物質(zhì)是萜烯類[7]，不同花色寒蘭香氣成分主要有醇類、醛類、酸類、萜烯類、酮類、烷類和酯類[38]。本研究中墨蘭盛花期的花朵中檢測出7 類共54 種揮發(fā)性成分，主要由醛類、苯類、醇類、呋喃類、酸類、萜類和酮類等化合物組成，其中醛類含量最高。

花朵不同花器官所含的揮發(fā)物及含量差異明顯，不同品種花朵揮發(fā)性成分釋放的主要花器官也不同。徐慧等[39]研究表明牡丹不同部位之間的揮發(fā)性化合物種類和相對含量存在較大差異，周晨晨等[40]研究表明白蘭地海棠不同花器官的花香成分存在明顯差異，揮發(fā)性成分釋放的主要花器官是雌蕊。宋朝偉等[41]研究表明2 個芍藥品種花香成分在不同花器官之間香氣物質(zhì)的釋放量均呈現(xiàn)出明顯差異，釋放量最高的為瓣化雄蕊，與感官上香氣的初步判斷相吻合。本研究中，墨蘭萼片共檢測出49 種揮發(fā)物，物質(zhì)含量最高，其中含量最高的揮發(fā)物為環(huán)戊基甲醛，具有薄荷的樟腦味；蕊柱檢測出的揮發(fā)物物質(zhì)含量次之，其含量最高的揮發(fā)物為己醛，呈青草香氣；花瓣檢測出揮發(fā)物的物質(zhì)含量第三，其含量最高的揮發(fā)物為1-戊烯-3-醇，具有水果香味；唇瓣檢測出揮發(fā)物的物質(zhì)含量最低，其含量最高的揮發(fā)物為環(huán)戊基甲醛；萼片揮發(fā)性物質(zhì)含量最高與感官上的初步判斷一致，萼片是揮發(fā)性成分釋放的主要花器官。通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，4 種花器官中唇瓣和花瓣差異性小，蕊柱與其他器官差異性大，萼片也與其他器官差異性大。戊醛、己醛、E-2-戊烯醛、E-2-己烯醛、環(huán)戊基甲醛、E-2-庚烯醛、1-戊烯-3-醇、E-2-戊烯-1-醇是4 個花器官香氣釋放的主要揮發(fā)性成分，主要呈青草、水果香味。

本研究表明，不同花器官中揮發(fā)性香氣成分種類組成相似，由醛類、苯類、醇類、呋喃類、酸類、萜類和酮類等化合物組成。但不同花器官揮發(fā)物物質(zhì)含量不同，48 種共有物質(zhì)在不同花器官中物質(zhì)含量存在顯著差異。萼片物質(zhì)含量最高，因此盛花期墨蘭花朵萼片是揮發(fā)性成分釋放的主要花器官。不同花器官的花香成分物質(zhì)含量存在明顯差異，這為研究香型蘭花新品種選育及香氣形成機(jī)制提供參考依據(jù)。