李文昊 任鵬鵬 韓潔茹 常佳怡 解 穎 陳 飛 李富震 姜德友

(1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱,150040; 2 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科,哈爾濱,150000)

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(Gouty Arthritis,GA)是尿酸鈉晶體沉積所引起的一種嚴(yán)重疼痛性關(guān)節(jié)炎[1],其急性發(fā)作被認(rèn)為是最痛苦的癥狀之一,與分娩或內(nèi)臟絞痛同等程度[2]。即使是晚期痛風(fēng)患者也常常表現(xiàn)為慢性關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、運(yùn)動(dòng)受限和痛風(fēng)復(fù)發(fā)。資生腎氣丸(Zisheng Shenqi Decoction,ZSD)是姜德友教授經(jīng)過(guò)多年研究,結(jié)合臨床實(shí)踐,創(chuàng)制的純中藥復(fù)方。具有補(bǔ)腎利濕、標(biāo)本兼顧之功,前期的臨床觀察、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及實(shí)驗(yàn)研究已初步證實(shí)ZSD治療GA疼痛及炎癥反應(yīng)具有顯著的改善作用[3-6],可能與P2X7R/NLRP3/NEK7信號(hào)通路及COX-2/PGE2信號(hào)通路有關(guān)[7-8]。

NOD樣受體蛋白3[Nucleotide Binding Domain(NOD)-like Receptor Protein 3,NLRP3]是GA炎癥反應(yīng)的主要參與者,近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其與嘌呤配體P2X門(mén)控離子通道型受體7(Purinergic Receptor P2X,Ligand-gated Ion Channel 7,P2X7R)、NIMA相關(guān)激酶7(NIMA-related Kinase 7,NEK7)的關(guān)系密切[9-10],三者在GA疼痛及炎癥反應(yīng)的發(fā)作中起到關(guān)鍵作用,但具體機(jī)制尚不清楚。因此,為了進(jìn)一步探索ZSD對(duì)GA疼痛的具體調(diào)控機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)采用小鼠冰醋酸扭體致痛模型復(fù)制疼痛反應(yīng),觀察小鼠扭體次數(shù),計(jì)算其扭體抑制率,并且應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù))檢測(cè)相關(guān)疼痛因子白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve Growth Factor,NGF)含量,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)P2X7R/NLRP3/NEK7信號(hào)通路中mRNA的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 體質(zhì)量18～22 g的健康雄性C57BL/6小鼠42只,6～8周齡,購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司,許可證號(hào)SCXK(遼)2015-0001。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室為高清潔級(jí),飼養(yǎng)溫度(22±1)℃,相對(duì)濕度45%～55%,通風(fēng)條件良好,室內(nèi)自然光照,符合《GB 14925-2010實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施》要求[11]。

1.1.2 藥物 ZSD處方由熟地黃、山藥、茯苓、牡丹皮、懷牛膝、土茯苓等組成[7],方中藥材從黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房一次性選購(gòu)。痛風(fēng)舒片(湖北綠金子藥業(yè)有限責(zé)任公司,批號(hào):140301),吲哚美辛(阿拉丁,批號(hào):CAS53-86-1),冰醋酸(阿拉丁,批號(hào):CAS64-19-7)。

1.1.3 試劑與儀器 IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)試劑(武漢優(yōu)爾生公司，貨號(hào)：SEA563Mu)；PGE2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)試劑盒(武漢優(yōu)爾生公司，貨號(hào)：MEA538Ge)；NGF酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)試劑盒(武漢優(yōu)爾生公司，貨號(hào):SEA105Mu);酶標(biāo)儀(BIOTEK公司,美國(guó),型號(hào):ELX-800);電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特公司,型號(hào):DH36001B);實(shí)時(shí)PCR儀(BIONEER公司,韓國(guó),型號(hào):Exicycler 96)等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 42只雄性C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為7組,即空白組、模型組、痛風(fēng)舒對(duì)照組、吲哚美辛對(duì)照組,ZSD低劑量組、ZSD中劑量組、ZSD高劑量組,每組6只。模型制備:除空白組外,其余各組小鼠分別腹腔注射0.6%冰醋酸生理鹽水溶液0.2 mL/只[12],空白組注射等量生理鹽水。分別觀察并記錄注射冰醋酸后10 min、15 min、20 min內(nèi)小鼠的扭體次數(shù),小鼠出現(xiàn)腹部?jī)?nèi)凹、身體扭曲、軀干與后腿伸展、臀部高起、蠕行反應(yīng)為扭體反應(yīng)[13],出現(xiàn)任意一項(xiàng)計(jì)為1次。

末次記錄各組小鼠扭體次數(shù)后,以心臟采血法采集小鼠外周血。先將小鼠以7%水合氯醛腹腔注射麻醉,打開(kāi)胸腔,暴露心臟,用一次性采血針針頭刺入右心室,吸取3.5 mL血液,并移入以小鼠組別編號(hào)的離心管內(nèi),靜置1 h,625×g離心10 min,取上清液,移入對(duì)應(yīng)編號(hào)的EP管,-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 給藥方法 已知成年人標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量為70 kg,ZSD方中藥物總重量為225 g,即成年人1 d口服用量。根據(jù)徐叔云等主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》可知[14],小鼠每日灌胃劑量約是成年人每日服用量的9.1倍。由此可知,痛風(fēng)舒對(duì)照組給予痛風(fēng)舒片混懸液0.26 g/kg;吲哚美辛對(duì)照組給予吲哚美辛溶液9.75 mg/kg;按照低∶中∶高=1∶2∶4比例計(jì)算[15];ZSD低劑量組、ZSD中劑量組、ZSD高劑量組分別給藥1.5 g/mL、3 g/mL、6 g/mL,依據(jù)小鼠每日的體質(zhì)量變化給藥。空白組及模型組用等體積蒸餾水灌胃。各組均于造模前6 d開(kāi)始給相應(yīng)的藥物或給蒸餾水灌胃,2次/d,連續(xù)7 d,末次給藥1 h后造模。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1)對(duì)小鼠一般狀態(tài)的觀察:觀察各組小鼠攝食、飲水、體質(zhì)量、排泄、活動(dòng)及精神狀態(tài)等一般情況。2)統(tǒng)計(jì)小鼠扭體次數(shù)并計(jì)算小鼠扭體抑制率:扭體抑制率(%)=(模型組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù))/模型組扭體次數(shù)×100%[16]。3)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)小鼠血清中IL-1β、PGE2、NGF、P物質(zhì)、5-羥色胺的表達(dá):酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑按標(biāo)簽說(shuō)明2～8 ℃儲(chǔ)存,使用前恢復(fù)到室溫,并充分搖勻,以避免試劑產(chǎn)生泡沫,造成浪費(fèi),按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。4)RT-PCR檢測(cè)小鼠血清中P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA的表達(dá):a.提取總RNA。b.RNA濃度檢測(cè):使用紫外分光光度計(jì)NANO 2000測(cè)定各樣本中RNA的濃度。c.反轉(zhuǎn)錄,引物的合成與設(shè)計(jì),引物由金斯瑞生物科技有限公司根據(jù)Primer Premier 5軟件合成,引物序列見(jiàn)表1。

表1 擴(kuò)增各靶基因的引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)使用IBM SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料若滿(mǎn)足正態(tài)性和方差齊性,則應(yīng)用單因素ANOVA;不滿(mǎn)足正態(tài)性和方差齊性時(shí)給予非參數(shù)檢驗(yàn)中Kruskal-WallisH檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;多組比較,數(shù)據(jù)滿(mǎn)足正態(tài)性和方差齊性時(shí),采用單因素方差分析,不滿(mǎn)足正態(tài)性和方差齊性時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)中Kruskal-WallisH檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZSD對(duì)小鼠灌胃后的一般情況的影響 除空白組、模型組一般情況良好外,吲哚美辛對(duì)照組中部分小鼠逐漸出現(xiàn)飲食、飲水減少,腹瀉,精神萎靡,毛發(fā)暗淡無(wú)光,活動(dòng)減少等表現(xiàn)。痛風(fēng)舒對(duì)照組中部分小鼠亦逐漸出現(xiàn)精神萎頓,活動(dòng)減少表現(xiàn)。ZSD各劑量組小鼠飲食及二便皆正常,活動(dòng)靈活,精神飽滿(mǎn),尤其以ZSD高劑量組中小鼠的一般情況最佳。

2.2 ZSD對(duì)冰醋酸致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)以及扭體抑制率的影響 與模型組比較,在10 min及15 min時(shí),吲哚美辛對(duì)照組、痛風(fēng)舒對(duì)照組及ZSD高劑量組中扭體次數(shù)顯著降低(P<0.05),扭體抑制率均明顯升高(均P<0.05);在20 min時(shí),ZSD低劑量組及ZSD中劑量組的扭體次數(shù)亦降低(P<0.05),扭體抑制率亦升高(P<0.05)。與吲哚美辛對(duì)照組比較,在10 min及15 min時(shí),ZSD低劑量組扭體次數(shù)較高(P<0.05),扭體抑制率降低(P<0.05),而ZSD中劑量組及ZSD高劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);在20 min時(shí),ZSD各劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1A 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)的扭體次數(shù) 圖1B 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)的扭體抑制率注:空白組中小鼠各時(shí)間點(diǎn)的扭體反應(yīng)次數(shù)為0,扭體抑制率為100%,不參與比較;與模型組比較,*P<0.05;與吲哚美辛對(duì)照組比較,△P<0.05

2.3 ZSD對(duì)小鼠血清IL-1β、PGE2、NGF表達(dá)的影響 與空白組比較,模型組中IL-1β、PGE2、NGF的表達(dá)均明顯升高(均P<0.05)。與模型組比較,吲哚美辛對(duì)照組、痛風(fēng)舒對(duì)照組、ZSD中劑量組及ZSD高劑量組中IL-1β及PGE2的表達(dá)均下降(均P<0.05);吲哚美辛對(duì)照組、痛風(fēng)舒對(duì)照組及ZSD高劑量組中NGF的表達(dá)亦下降明顯(P<0.05)。與吲哚美辛對(duì)照組比較,ZSD低劑量組及ZSD中劑量組中IL-1β、PGE2表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),痛風(fēng)舒對(duì)照組及ZSD高劑量組則沒(méi)有差異;ZSD低劑量組中NGF的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其他用藥組則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血清IL-1β、PGE2、NGF的表達(dá)情況

2.4 ZSD對(duì)P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA表達(dá)的影響 與空白組比較,模型組中P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA的表達(dá)量均明顯升高(P<0.05)。與模型組比較,吲哚美辛對(duì)照組、痛風(fēng)舒對(duì)照組及ZSD高劑量組中P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA的表達(dá)均降低(均P<0.05)。與吲哚美辛對(duì)照組比較,痛風(fēng)舒對(duì)照組中P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA表達(dá)降低,ZSD低劑量組及ZSD中劑量組3者的表達(dá)均升高(均P<0.05),但ZSD高劑量組3者的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各給藥觀察組中,痛風(fēng)舒片、ZSD高劑量及吲哚美辛均可明顯降低小鼠血清中P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA的表達(dá),其中ZSD高劑量與吲哚美辛療效相近,而ZSD低劑量、中劑量療效不明顯。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠P2X7RmRNA、NLRP3mRNA及NEK7mRNA的表達(dá)情況注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05;與吲哚美辛對(duì)照組比較,▲P<0.05

3 討論

3.1 ZSD對(duì)小鼠扭體次數(shù)及扭體抑制率的影響 根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可得,各組治療藥物均能降低小鼠扭體次數(shù),增加扭體抑制率,達(dá)到鎮(zhèn)痛效果。進(jìn)一步分析扭體抑制率可知,在15 min時(shí),ZSD低劑量、中劑量的扭體抑制率比10 min時(shí)略有降低,而在20 min時(shí)明顯升高。并且在20 min時(shí),與模型組比較,ZSD各劑量組的扭體次數(shù)均顯著降低,扭體抑制率顯著增高。但在20 min時(shí),ZSD各劑量均具有明顯的鎮(zhèn)痛作用,其療效與痛風(fēng)舒片及吲哚美辛相近。

3.2 ZSD對(duì)多種疼痛因子的調(diào)控作用 隨著炎癥細(xì)胞中NLRP3炎癥小體激活,作為疼痛和炎癥反應(yīng)核心的IL-1β被釋放如細(xì)胞外及血液中,誘導(dǎo)并產(chǎn)生更多的炎癥介質(zhì)及趨化因子[17]。臨床研究發(fā)現(xiàn),GA患者的疼痛與IL-1β、IL-6、IL-8的水平正相關(guān)[18]。在與GA相似的骨關(guān)節(jié)炎的研究中,亦發(fā)現(xiàn)外周血白細(xì)胞中IL-1β基因的高表達(dá)與疼痛增加相關(guān)[19],并且IL-1β與關(guān)節(jié)炎緩解后疼痛的持續(xù)或復(fù)發(fā)有關(guān)[20]。IL-1β亦可通過(guò)向下丘腦發(fā)出炎癥疼痛信號(hào)參與傳入疼痛反應(yīng),促進(jìn)痛覺(jué)過(guò)敏[21],并誘導(dǎo)下丘腦產(chǎn)生PGE2。最新研究表明PGE2亦與GA的疼痛機(jī)制相關(guān)[22],其可通過(guò)致敏和興奮作用與組胺、緩激肽協(xié)同作用,增強(qiáng)組織對(duì)疼痛遞質(zhì)和因子的敏感性,從而引起疼痛并加重疼痛[23-24]。除PGE2外,NGF亦與關(guān)節(jié)疼痛及關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和滑液中的炎癥有關(guān)[25-26]。有學(xué)者在人類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)IL-1β對(duì)正常和骨關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞的NGFmRNA和蛋白的表達(dá)具有調(diào)控作用[27]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組組小鼠血清中IL-1β、PGE2及NGF表達(dá)明顯高于空白組,提示IL-1β、PGE2及NGF與小鼠疼痛反應(yīng)密切相關(guān)。與模型組比較,吲哚美辛對(duì)照組、痛風(fēng)舒對(duì)照組及ZSD高劑量組的藥物均能夠明顯下調(diào)IL-1β、PGE2及NGF的表達(dá)。由此可知,ZSD可通過(guò)下調(diào)IL-1β、PGE2及NGF的表達(dá)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。在ZSD各劑量組中,以ZSD高劑量下調(diào)IL-1β及PGE2的效果最佳。

3.3 ZSD對(duì)P2X7R、NLRP3、NEK7的調(diào)控作用 通過(guò)國(guó)內(nèi)外研究可知,在免疫系統(tǒng)激活的條件下,細(xì)胞釋放ATP,ATP通過(guò)P2X7R促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)外離子環(huán)境改變[28],進(jìn)而調(diào)控NEK7、NLRP3的表達(dá),促進(jìn)IL-1β等炎癥介質(zhì)及疼痛介質(zhì)的分泌,從而引起炎癥反應(yīng)及疼痛[10]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),模型組中P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA的表達(dá)均明顯高于空白組,可知在醋酸致小鼠扭體模型中,P2X7R、NLRP3、NEK7均在轉(zhuǎn)錄水平參與疼痛反應(yīng)。而吲哚美辛、痛風(fēng)舒片及ZSD各劑量在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)P2X7R、NLRP3、NEK7具有調(diào)控作用。研究亦發(fā)現(xiàn),與ZSD低劑量、中劑量比較,ZSD高劑量對(duì)P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA的調(diào)控作用更強(qiáng)。結(jié)合扭體次數(shù)及扭體抑制率結(jié)果可推測(cè),ZSD高劑量的鎮(zhèn)痛效果更佳,療效與吲哚美辛及痛風(fēng)舒片相近,這提示ZSD高劑量對(duì)小鼠疼痛反應(yīng)的抑制作用更強(qiáng)有關(guān)。

值得一提的是,通過(guò)觀察小鼠的一般情況發(fā)現(xiàn),吲哚美辛對(duì)照組中小鼠出現(xiàn)諸多消化系統(tǒng)異常的癥狀,如大便偏稀,毛色暗淡,精神萎頓等表現(xiàn),可見(jiàn)雖然吲哚美辛鎮(zhèn)痛效果顯著,但其不良反應(yīng)明顯。痛風(fēng)舒對(duì)照組中小鼠亦出現(xiàn)明顯的精神倦怠表現(xiàn),這可能與痛風(fēng)舒片的功效側(cè)重清熱利濕,忽略補(bǔ)益脾腎有關(guān)。而ZSD各劑量組小鼠的飲食、排泄均無(wú)異常,且精神飽滿(mǎn),尤其以ZSD高劑量組的一般情況最佳,可見(jiàn)ZSD扶正祛邪,標(biāo)本同治之功強(qiáng)于痛風(fēng)舒片及吲哚美辛。

綜上所述,在醋酸致小鼠扭體模型中,ZSD降低小鼠扭體次數(shù),提高扭體抑制率從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛效果的機(jī)制可能與其在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控P2X7R/NLRP3/NEK7信號(hào)通路,抑制P2X7RmRNA、NLRP3mRNA、NEK7mRNA的表達(dá),進(jìn)一步下調(diào)IL-1β、PGE2及NGF的表達(dá)有關(guān)。且ZSD對(duì)扭體小鼠的鎮(zhèn)痛效果呈劑量依賴(lài)性增加,與ZSD低劑量、中劑量比較,ZSD高劑量的鎮(zhèn)痛效果更佳,且無(wú)不良反應(yīng)。因此,在ZSD高劑量鎮(zhèn)痛效果與吲哚美辛及痛風(fēng)舒片相近的條件下,選擇ZSD治療GA更加符合臨床實(shí)踐。這一發(fā)現(xiàn)可為ZSD調(diào)控GA疼痛機(jī)制的深入研究提供理論依據(jù)。

利益沖突聲明:無(wú)。