曹鈺楠，譚年花，唐陳琴，陳 斌

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病研究所，湖南 長沙 410007）

慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）是在慢性肝病基礎(chǔ)上，由各種誘因引起肝功能急性失代償?shù)呐R床綜合征[1]。ACLF病情兇險，短期病死率高[2]。目前關(guān)于ACLF的發(fā)病機制主要集中在免疫炎癥失衡、氧化應(yīng)激、細胞凋亡等方面，其中不同致病因素引起的免疫炎癥反應(yīng)在ACLF的發(fā)生發(fā)展過程中極為關(guān)鍵，而全身炎癥反應(yīng)既是ACLF的特征也是其驅(qū)動因素。促炎性細胞因子水平的升高及在免疫應(yīng)答過程中各種免疫細胞的活化就是過度炎癥反應(yīng)的表現(xiàn)[3]，同時也影響著患者的預(yù)后。前期研究[4-5]已證實溫陽解毒化瘀方治療肝衰竭療效確切，能夠減輕炎癥反應(yīng)。溫陽解毒化瘀方以清溫并用法組方。赤芍-附片作為核心藥對彰顯了組方特點，在臨床配伍應(yīng)用中具有高度代表性。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路是一條與炎癥、腫瘤、免疫性疾病等發(fā)病機制密切相關(guān)的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[6]。故本研究以PI3K/AKT信號通路作為切入點，探究赤芍-附片對ACLF的作用機制，旨在為赤芍-附片藥對治療ACLF提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SPF級SD大鼠48只，體質(zhì)量130～150 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004，合格證號：ZS-202103230022。大鼠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，室溫（24±2）℃，濕度40%～60%，晝夜明暗交替12 h。實驗經(jīng)實驗動物倫理委員會批準（LLBH-202103160007）。

1.2 主要試劑與儀器 牛血清白蛋白（批號：A1933-5G）、D-半乳糖（批號：MB1853-1）、脂多糖（批號：MB5198-1）均購自美國Sigma 公司；白介素-1β（IL-1β）試劑盒（批號：KE00021-40000723）、白介素-6（IL-6）試劑盒（批號：KE00139-40000712）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（批號：KE00068-40000941）均購自美國Proteintech公司；p-PI3K抗體（批號：PA5-38905）購自Invitrogen Antibodies公司；PI3K抗體（批號：60225-1-Ig）、p-AKT抗體（批號：66444-1-Ig）、AKT抗體（批號：10176-2-AP）、山羊抗鼠二抗（批號：SA00001-1）、山羊抗兔二抗（批號：SA00001-2）均購自美國Proteintech公司；mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：CW2569）、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：CW2141）均購自北京康為世紀生物科技有限公司。H1650R型冷凍離心機購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；DYY-6C型電泳儀、DYCZ-24DN型電泳槽均購自北京六一儀器廠；BA210T型顯微鏡購自北京Motic公司；PIKOREAL96熒光定量RCP儀、SPL0960型熒光PCR板均購自美國Thermo公司。

1.3 實驗藥物 赤芍（批號：2012003C）、附片（批號21030068S）均購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)藥學(xué)部鄧桂明研究員鑒定中藥為正品。制備方法：稱取對應(yīng)劑量的赤芍、附片（赤芍組赤芍50 g；附片組附片15 g；赤芍-附片組赤芍50 g，附片15g），加入10倍量的水煮沸2 h，過濾藥液，藥渣加入8倍量水煮沸1 h，2次藥液混合后過濾，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮藥液至65 mL（藥液生藥質(zhì)量濃度為1 g/mL）。乳果糖口服液（湖南科倫制藥有限公司，批號：H20093523，66.7 g/100mL）。

1.4 ACLF動物造模[7-8]適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，首先將48只大鼠隨機分為空白組（6只）、ACLF造模組（42只）。ACLF造模組大鼠構(gòu)建ACLF模型。首先用牛血清白蛋白免疫致敏法構(gòu)建免疫性肝纖維化大鼠模型，除空白組外的其余大鼠予牛血清白蛋白乳化液皮下多點注射致敏，0.5 mL/次（含牛血清白蛋白4 mg），分別在第1、15、25、35天注射，共4次；第36天起，予以尾靜脈注射牛血清白蛋白攻擊建立免疫性纖維化大鼠模型，初始劑量為2 mg/次，依次遞加0.5 mg/次，達4 mg/次后維持此劑量，每周注射2次，持續(xù)6周；最后在第6周末，通過腹腔注射D-半乳糖（600 mg/kg）+脂多糖（100 μg/kg）急性攻擊，構(gòu)建ACLF大鼠模型。急性攻擊8 h后以10%水合氯醛（0.4 mL/100g）進行麻醉并采集腹主動脈血、肝組織等樣本以備檢測。

1.5 分組與給藥 至給藥干預(yù)前共存活33只大鼠。將33只造模大鼠隨機分為模型組（6只）、陽性組（乳果糖組，6只）、赤芍組（7只）、附片組（7只）、赤芍-附片組（7只）。在造模期間尾靜脈注射的第6周開始進行藥物灌胃干預(yù)，按人與大鼠等效劑量換算系數(shù)折算，赤芍組、附片組、赤芍-附片組大鼠每日中藥等效劑量分別為4.50、1.35、5.85 g/kg，陽性組予乳果糖灌胃，大鼠每日等效劑量為1.8 g/kg。灌胃給藥，2次/d，給藥持續(xù)7 d至急性攻擊前。

1.6 觀察指標

1.6.1 肝功能、凝血酶原時間（PT） 采集腹主動脈血約5 mL，4 ℃，3 000 r/min（離心半徑為10 cm），離心15 min分離血漿，取上清后生化法檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、總膽汁酸（TBA）；采用全自動血凝儀測定PT。

1.6.2 肝組織炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）檢測肝組織炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平。取各組大鼠肝組織研磨制備肝組織勻漿，重復(fù)凍融破壞細胞膜后離心取上清；設(shè)空白孔、標準品孔（50 μL）、樣本孔，樣本空中加入40 μL樣品稀釋液，逐步稀釋至5倍，除空白孔外每孔加入酶試劑100μL，封板，37 ℃恒溫孵育120 min，PBST洗滌后棄液，拍干；向孔中依次加入A、B顯色液，37 ℃避光顯色15～30 min；加入終止液50 μL終止反應(yīng)；終止后15 min內(nèi)測定OD值；制作標準曲線，計算樣本濃度。

1.6.3 大鼠肝組織病理變化 取各組大鼠肝組織，脫水透明后石蠟包埋，再進行切片、貼片，將切片60 ℃恒溫烘干。將烘干的切片用二甲苯、乙醇快速脫水。水洗后經(jīng)蘇木素染色，沖洗、返藍后伊紅染色，洗滌后不同濃度乙醇脫水40 s，二甲苯透明切片，封片，蓋上蓋玻片固封。顯微鏡下觀察并取片。

1.6.4 肝組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT（Ser473）蛋白相對表達量 采用蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測肝組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT（Ser473）蛋白相對表達量。取肝組織樣本，洗滌后加入RIPA裂解液，反復(fù)研磨組織；冰上裂解，4 ℃，12 000 r/min（離心半徑為10 cm），4 ℃，離心15 min，取上清。制膠，準備蛋白上清，根據(jù)蛋白定量結(jié)果加入樣本開始電泳；轉(zhuǎn)膜后用PBST沖洗，5%脫脂奶粉封閉90 min；抗體稀釋液稀釋一抗[PI3K（1∶5 000），P-PI3K（1∶1 000），AKT（1∶1 000），P-AKT（1∶2 000）]，孵育一抗，PBST洗滌；用抗體稀釋液稀釋HRP標記的二抗，HRP山羊抗鼠IgG（1∶5 000），HRP山羊抗兔IgG（1∶6 000），37 ℃孵育90 min；加入ECL化學(xué)發(fā)光液，用塑封膜將膜包裹雜交膜，曝光、顯影沖洗。

1.6.5 肝組織PI3KmRNA、AKT mRNA相對表達量 采用Realtime PCR法（RT-PCR）檢測肝組織PI K mRNA、AKT mRNA相對表達量。取肝組織樣本研磨，裂解，加入三氯甲烷后振蕩、靜置，4 ℃，12 000 r/min（離心半徑為10 cm），離心15 min，收集上清液，加入等體積異丙醇后混勻、靜置，再次離心后去除上清，加入無水乙醇洗滌，離心后棄掉廢液，室溫放置晾干，溶解沉淀，分光光度計測定RNA含量、純度，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，然后進行定量PCR擴增（預(yù)變性：95 ℃，10 min；變性95 ℃，15 s；退火55 ℃，20 s；延伸60 ℃，30 s。循環(huán)40次），按照2-ΔΔCt方法計算PI3K mRNA、AKT mRNA的相對表達量。引物序列見表1，擴增曲線及溶解曲線見圖1～2。

表1 引物序列

圖1 PI3K mRNA 擴增及溶解曲線圖

圖2 AKT mRNA 擴增及溶解曲線圖

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進行分析，計量資料用“均數(shù)±標準差”（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較用最小顯著性差異法（LSD）檢驗，若不服從正態(tài)分布或方差不齊，則采用Kruskal-Wallis H檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肝臟組織形態(tài)變化情況 空白組大鼠肝臟表面光滑，肝細胞無變性壞死，排列有序，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，中央靜脈清晰。模型組大鼠肝臟表面粗糙，可見顆粒狀結(jié)節(jié)，肝組織破壞，肝細胞形態(tài)變化，呈融合性壞死、點狀或灶狀壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，纖維組織增生，多發(fā)性假小葉形成，伴大量炎癥細胞浸潤，表明ACLF造模成功[1]。陽性組、赤芍組、附片組、赤芍-附片組肝細胞壞死程度較模型組改善，纖維組織減少，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞減輕，匯管區(qū)少量炎癥細胞浸潤，以赤芍-附片組改善最為明顯。（見圖3）

圖3 各組大鼠肝臟病理圖 （HE，×400）

2.2 各組大鼠肝功能、PT比較 模型組大鼠血清ALT、AST、TBIL、TBA、PT水平高于空白組（P＜0.05）；陽性組、赤芍組、附片組、赤芍-附片組大鼠血清ALT、AST、TBIL、TBA、PT水平均低于模型組（P＜0.05），且赤芍-附片組大鼠血清ALT、AST、TBIL、TBA、PT水平均低于陽性組、赤芍組、附片組（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠血清TBIL、ALT、AST、TBA、PT 比較 （±s）

表2 各組大鼠血清TBIL、ALT、AST、TBA、PT 比較 （±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與赤芍-附片組比較，cP＜0.05。

組別 n TBIL/（μmol/L） ALT/（IU/L） AST/（IU/L） TBA/（μmol/L） PT/s空白組 6 1.10±0.10 36.92±2.41 104.72±4.56 11.52±2.48 11.56±0.36模型組 6 4.56±0.41a 84.16±3.23a 246.02±12.61a 93.62±11.56a 15.66±0.27a陽性組 6 3.58±0.11bc 54.86±1.91bc 170.38±13.67bc 50.20±2.11bc 14.16±0.35bc赤芍組 7 2.74±0.32bc 49.02±4.90bc 157.10±6.00bc 41.42±5.65bc 13.68±0.76bc附片組 7 2.82±0.42bc 42.52±3.96bc 156.68±9.08bc 43.94±7.10bc 13.22±0.23bc赤芍-附片組 7 1.42±0.14b 31.94±2.18b 108.08±6.99b 22.68±3.61b 11.84±0.33b F 20.715 32.574 29.733 20.118 13.107 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 各組大鼠肝組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 模型組大鼠肝組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平高于空白組（P＜0.05）；陽性組、赤芍組、附片組、赤芍-附片組大鼠肝組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平均低于模型組（P＜0.05），且赤芍-附片組大鼠肝組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于陽性組、赤芍組、附片組（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠肝組織IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較（±s，μg/mL）

表3 各組大鼠肝組織IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較（±s，μg/mL）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與赤芍-附片組比較，cP＜0.05。

組別 n IL-1β IL-6 TNF-α空白組 6 420.84±27.14 1.56±0.12 37.41±3.69模型組 6 1 404.91±67.07a 4.10±0.35a 124.89±4.31a陽性組 6 920.08±57.39bc 3.15±0.14bc 89.85±5.82bc赤芍組 7 966.25±72.61bc 3.04±0.25bc 56.30±5.34bc附片組 7 730.49±56.27bc 2.85±0.15bc 64.21±3.11bc赤芍-附片組7 741.23±46.51b 1.88±0.22b 45.42±4.03b F 33.590 17.704 52.743 P 0.000 0.000 0.000

2.4 各組大鼠肝組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT（Ser473）蛋白相對表達量比較 模型組大鼠肝組織p-PI3K、p-AKT蛋白相對表達量低于空白組（P＜0.05）；陽性組、赤芍組、附片組、赤芍-附片組大鼠肝組織p-PI3K、p-AKT蛋白相對表達量均高于模型組（P＜0.05），且赤芍-附片組大鼠肝組織p-PI3K、p-AKT蛋白相對表達量高于陽性組、赤芍組、附片組（P＜0.05）。（見圖4、表4）

表4 各組大鼠肝臟組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT（Ser473）蛋白相對表達量比較 （±s）

表4 各組大鼠肝臟組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT（Ser473）蛋白相對表達量比較 （±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與赤芍-附片組比較，cP＜0.05。

組別 n PI3K p-PI3K AKT p-AKT空白組 6 0.64±0.05 0.59±0.07 0.65±0.09 0.54±0.08模型組 6 0.65±0.05 0.15±0.02a 0.66±0.08 0.19±0.01a陽性組 6 0.66±0.04 0.38±0.05b c 0.66±0.07 0.45±0.04b c赤芍組 7 0.66±0.05 0.41±0.05b c 0.66±0.07 0.33±0.03b c附片組 7 0.66±0.06 0.37±0.04b c 0.69±0.07 0.48±0.04b c赤芍-附片組 7 0.62±0.05 0.61±0.04b 0.65±0.07 0.62±0.04b F 0.106 13.120 0.031 12.944 P 0.990 0.000 0.999 0.000

圖4 各組大鼠肝組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT 蛋白表達Western blotting 圖

2.5 各組大鼠肝組織PI3K mRNA、AKT mRNA相對表達量比較 模型組大鼠肝組織PI3K mRNA、AKT mRNA相對表達量低于空白組（P＜0.05）；陽性組、赤芍組、附片組、赤芍-附片組大鼠肝組織PI3K mRNA、AKT mRNA相對表達量高于模型組（P＜0.05），且赤芍-附片組大鼠肝組織PI3K mRNA、AKT mRNA相對表達量高于陽性組、赤芍組、附片組（P＜0.05）。（見表5）

表5 各組大鼠肝臟組織PI3K mRNA、AKT mRNA相對表達量 （±s）

表5 各組大鼠肝臟組織PI3K mRNA、AKT mRNA相對表達量 （±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與赤芍-附片組比較，cP＜0.05。

組別 n PI3K mRNA AKT mRNA空白組 6 1.030 6±0.078 8 0.938 6±0.076 5模型組 6 0.193 4±0.022 2a 0.110 1±0.014 6a陽性組 6 0.456 7±0.033 0b c 0.396 6±0.037 9b c赤芍組 7 0.349 3±0.030 3b c 0.261 4±0.024 5b c附片組 7 0.628 1±0.057 9b c 0.593 2±0.049 5b c赤芍-附片組 7 0.854 0±0.057 1b 0.800 2±0.067 2b F 38.995 40.519 P 0.000 0.000

3 討 論

炎癥和氧化應(yīng)激是導(dǎo)致肝纖維化、肝細胞壞死、凋亡的重要因素[9-10]。為了維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，肝臟固有免疫細胞（巨噬細胞/Kupffer細胞、自然殺傷細胞等）可吞噬、殺傷病原體，釋放大量細胞因子，如IL-6、IL-10等，促進炎癥因子風(fēng)暴形成，加重肝衰竭。肝臟代償性免疫抑制及免疫功能紊亂導(dǎo)致患者全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），使膿毒癥的風(fēng)險也隨之上升。過度的免疫炎癥反應(yīng)會對組織造成嚴重病理損傷，引起肝臟組織嚴重壞死并導(dǎo)致肝外器官衰竭，同時也增加了感染的易感性[11]。因此，控制炎癥反應(yīng)在肝衰竭的治療過程中尤為關(guān)鍵。目前中醫(yī)藥在治療肝衰竭方面逐漸顯露出其優(yōu)勢[12-13]。

慢加急性肝衰竭屬于中醫(yī)“急黃”“瘟黃”“肝瘟”范疇，其致病因素包括外感時邪疫毒、嗜酒過度、藥物毒物、飲食所傷等?！吨T病源候論·黃疸諸候·急黃候》記載：“谷氣郁蒸，因為熱毒所加，故卒然發(fā)黃……命在頃刻，故云急黃也?！彪S著臨床經(jīng)驗的積累，歷代醫(yī)家逐漸加深了對急黃（瘟黃）的認識，中醫(yī)大致將其基本病機總結(jié)為濕、熱、瘀、毒、虛。課題組前期通過觀察肝衰竭患者不同黃疸證型的臨床特點，總結(jié)出了“陽黃-陰陽黃-陰黃”中醫(yī)辨證論治體系，同時發(fā)現(xiàn)肝衰竭患者多是虛實夾雜，且疾病的發(fā)生發(fā)展過程中均存在濕熱、瘀毒、脾虛。濕熱瘀毒為標，脾虛為本。三者相互交織，發(fā)為肝瘟。赤芍-附片是治療肝衰竭“清溫并用”法的核心藥對，臨床療效確切。赤芍味苦，性微寒，歸肝經(jīng)，具有清熱涼血、祛瘀止痛的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，赤芍可以降低炎癥因子水平，減輕炎癥反應(yīng)，具有保肝作用[14-15]。附子，味辛，性大熱，上能助心陽，下可溫脾腎，主要有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，附子具有抗炎、鎮(zhèn)痛、強心、抗腫瘤等藥理作用，能降低促炎因子的產(chǎn)生與釋放[16]。但二者是否存在協(xié)同增效效應(yīng)尚不清楚。

本研究結(jié)果表明，ACLF模型大鼠肝功能、凝血功能明顯下降，肝臟組織形態(tài)破壞，促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高，證實ACLF中存在明顯的炎癥反應(yīng)。研究顯示TNF-α、IL-1β、IL-6是D-Gal/LPS誘導(dǎo)大鼠肝衰竭模型肝損傷的主要介質(zhì)[17]，與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明，在乳果糖、赤芍、附片、赤芍-附片藥對干預(yù)后，ACLF大鼠TBIL、ALT、AST、TBA和PT水平均較模型組改善，說明乳果糖、赤芍、附片、赤芍-附片藥均可改善肝功能、凝血功能，減輕肝臟組織壞死及炎癥細胞浸潤等病變，亦可降低ACLF大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平，抑制炎癥反應(yīng)。赤芍-附片組肝功能、凝血、炎癥指標的整體改善比赤芍組、附片組更為顯著，說明兩者配伍的效果優(yōu)于單用，可能與附片能提高赤芍的主要效應(yīng)成分芍藥苷的生物利用度有關(guān)[18]。

PI3K是一種細胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，具有磷脂酰肌醇激酶和絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）激酶活性。PI3K是由一個催化亞基和一個調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成的異二聚體。其中調(diào)節(jié)亞基以p85異構(gòu)體為主，主要包括SH2和SH3結(jié)構(gòu)域，能與靶蛋白相結(jié)合，被受體酪氨酸激酶（TK）激活。AKT是一種絲/蘇氨酸激酶。因為與蛋白激酶A和蛋白激酶C具有高度的同源性，AKT又被稱為蛋白激酶B，亦稱為PKB或Rac，是PI3K通路中重要的中介因子[19]。AKT在多種細胞中廣泛表達。PI3K/AKT信號通路是一個依靠磷酸化傳導(dǎo)信號的通路，能夠多級調(diào)控、級聯(lián)放大，具有交通樞紐的地位。該信號通路被激活后，可繼續(xù)通過激活下游的多種靶點蛋白，參與細胞的增殖、凋亡、活化、分化、惡變等一系列細胞活動及調(diào)控蛋白合成、能量代謝、血管生成等重要的生理過程[20]，從而在各類疾病中起著重要調(diào)控作用。PI3K/AKT信號通路作為調(diào)節(jié)炎癥因子分泌的關(guān)鍵通路，在肝衰竭病理機制中具有重要意義，能傳導(dǎo)匯聚多種細胞外和細胞內(nèi)信號，通過對下游效應(yīng)因子的激活，調(diào)節(jié)促炎和抗炎細胞因子的產(chǎn)生。本研究結(jié)果也證實了這一點。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠肝組織p-PI3K、p-AKT蛋白表達及PI3K mRNA、AKTmRNA表達均下降，說明PI3K/AKT信號通路參與了ACLF發(fā)生發(fā)展過程。陽性組、赤芍組、附片組、赤芍-附片組大鼠肝組織p-PI3K、p-AKT蛋白表達及PI3K mRNA、AKTmRNA表達均上升，說明乳果糖、赤芍、附片、赤芍-附片藥對均能激活PI3K/AKT信號通路，降低促炎因子水平。WANG H等[21]發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)PI3K/Akt/STAT3信號通路能降低炎癥因子的表達進而改善肝損傷，與本研究結(jié)果一致。SUN X J等[22]證實調(diào)節(jié)PI3K/Akt-Nrf2通路能改善全身炎癥反應(yīng)。WANG Y P等[23]研究表明，利用骨髓細胞2激活PI3K/AKT/FoxO3a信號通路可下調(diào)IL-5、TNF-α和IL-5β炎癥因子的表達。DONG L L等[24]研究表明PI3K/Akt/mTOR信號通路能抑制促炎性細胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的產(chǎn)生。另有研究[25]表明，在激活PI3K/AKT/FOXO1信號通路后，脂毒性誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)得到明顯緩解。HEMAVATHY H等[26]發(fā)現(xiàn)干預(yù)PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路能抑制IL-1β、TNF-α的釋放，從而抑制炎癥反應(yīng)。此外，本研究結(jié)果表明，赤芍組、附片組PI3K mRNA、AKT mRNA表達水平與PI3K、AKT蛋白表達水平不完全一致，可能是受翻譯速率、mRNA半衰期、蛋白折疊等多因素影響所致[27]。與模型組、赤芍組、附片組比較，赤芍-附片藥對組的p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平及PI3K mRNA、AKT mRNA表達水平上升最顯著，進一步說明了PI3K/AKT信號通路是參與肝衰竭持續(xù)性炎癥反應(yīng)的重要通路。

綜上所述，赤芍-附片藥對可以改善ACLF大鼠的免疫炎癥反應(yīng)，其對ACLF大鼠肝臟的保護作用可能與激活PI3K/AKT信號通路，下調(diào)炎癥因子的表達，從而減少炎癥因子的產(chǎn)生有關(guān)。然而，赤芍-附片藥對是否可以通過其他信號通路對ACLF產(chǎn)生影響有待進一步探究。