葉 強， 劉雨詩， 劉紅梅， 劉娟汝， 唐雪梅， 郭 力?

（1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，教育部中藥材標準化重點實驗室，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川成都611137；2.江油市中醫(yī)醫(yī)院，四川江油621700）

附子Aconiti Lateralis Radix Praeparata為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品［1］，始載于 《神農本草經(jīng)》，具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛的功效。其味辛、甘、大熱，有毒［2］，臨床上常以其炮制品入藥，目的是為了減毒增效［3-4］。附子的炮制歷史悠久，炮制方法較多，涵蓋炮、炙、浸、蒸、煮、燒、炒等70余種工藝［5-7］。2015年版 《中國藥典》收載附子炮制品種包括鹽附子、黑順片、白附片、淡附片、炮附片［1］，均使用膽巴作為炮制輔料。膽巴本身具有一定毒性［8］，經(jīng)膽巴制后的附子易引入無機雜質，炮制后需經(jīng)過反復漂洗，有效成分極可能在漂洗退膽的過程中大量流失［9］。

附子經(jīng)過炮制后毒性降低，本課題組從化學成分變化的角度出發(fā)，以市場上廣泛流通的加膽、加硫炮制的膽附片 （白附片、熟附片）以及部分地區(qū)流通的無膽附片 （生附片、蒸附片、炒附片）［10-12］為研究對象，采用酸性染料比色法測定總生物堿含有量、高效液相色譜法測定不同類型生物堿類成分含有量，對其進行質量評價［13］，探討不同炮制工藝、炮制輔料對附子生物堿類成分的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試藥 Ethos Tos微波消解萃取儀 （意大利 Milestone公司）；Satorious BP221S系列電子分析天平 （德國Satorious公司）；PHS-3C型PH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；UV-2550紫外分光光度計、LC-10 A高效液相色譜儀 （日本島津公司）；UPT-Ⅱ-107-優(yōu)普系列超純水器 （成都超純科技有限公司）。

烏頭堿 （AC，批號 17022206）、次烏頭堿（HAC，批號17111310）、新烏頭堿 （MAC，批號16032504）、苯甲酰烏頭原堿 （BAC，批號16012815）、苯甲酰次烏頭原堿 （BHAC，批號15010806）、苯甲酰新烏頭原堿 （BMAC，批號17022806），購自成都曼思特生物科技公司，經(jīng)HPLC面積歸一化法計算含有量＞98%。乙腈 （美國Fisher公司）；四氫呋喃 （成都科隆化工試劑廠）為色譜純；乙酸銨、溴甲酚綠、二氯甲烷、乙酸乙酯、異丙醇、冰乙酸、甲酸、氨水為分析純；水為實驗室自制超純水。

1.2 藥材 共收集7個廠家 （A-G），22批附子樣品，見表1。

1.3 附子炮制品制備［1，14］

1.3.1 生附片 取泥附子，洗凈，去皮，切片，干燥。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

1.3.2 白附片 取泥附子，洗凈，浸入膽巴水溶液中數(shù)日，連同浸液煮至透心，撈出，剝去外皮，縱切成厚約0.3 cm的片，用水浸漂，取出，蒸透，曬干。

1.3.3 熟附片 取泥附子，洗凈，浸入膽巴水溶液中數(shù)日，連同浸液煮至透心，撈出，剝去外皮，切成厚約7 mm的片，用水浸漂，取出，蒸至透心，出現(xiàn)油面光澤，曬干或烘干。

1.3.4 炒附片 將中等細度的河砂投入炒藥機內，炒至滑利，投入生附片，砂炒至外表皮黃棕色，斷面黃色，取出，迅速篩去砂子，晾涼。

1.3.5 蒸附片 取生附片，用清水浸潤，加熱蒸至附子表面出現(xiàn)油面光澤，干燥。

2 方法與結果

2.1 總生物堿測定［15-16］

2.1.1 溴甲酚綠溶液制備 取乙酸銨約27 g，精密稱定，置于1 000 mL量瓶中，加超純水900 mL溶解，加冰乙酸調節(jié)pH至6.1±0.1，加超純水至刻度，搖勻，備用。再取溴甲酚綠約5 g，精密稱定，加0.05 mol／L氫氧化鈉溶液17.5 mL充分研磨使溶解，轉移至1 000 mL量瓶中，再加乙酸-乙酸銨緩沖液稀釋至刻度，過濾，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 取附子樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置微波消解罐中，加入0.5%甲酸溶液40 mL，密閉，放入微波消解儀中，提取12 min（90℃，800 W）。取續(xù)濾液10 mL，用氨水調pH 10～11，氯仿萃取5次，每次10 mL，第1次萃取后放置30 min，其余每次放置10 min，合并萃取液，35℃減壓濃縮蒸干，用氯仿溶解并定容至5 mL量瓶中，備用。

2.1.3 對照品溶液制備 精密稱取烏頭堿對照品7.08 mg，于50 mL量瓶中，加氯仿溶解并定容，制得質量濃度為0.141 6 mg／mL的對照品溶液。

2.1.4 標準曲線繪制

2.1.4.1 波長選擇 取烏頭堿對照品溶液及供試品溶液適量，置于分液漏斗中，加入氯仿補足15 mL，再加入10 mL溴甲酚綠溶液，劇烈振搖3 min，靜置30 min，取氯仿層，用紫外分光光度計在300～500 nm波長范圍內，進行全波長掃描，均在403 nm處有最大吸收，故選取403 nm為測定波長。

2.1.4.2 標準曲線繪制 精密量取對照品溶液0.3、0.5、1.0、3.0、5.0 mL，分別置于分液漏斗中，加入氯仿補足15 mL，再加入溴甲酚綠溶液10 mL，劇烈振搖3 min，靜置30 min，分層，同法制備溶劑空白溶液，取氯仿層溶液于403 nm處測定吸光度。以對照品溶液質量濃度為橫坐標 （X），吸光度為縱坐標 （Y），繪制標準曲線，得回歸方程 Y＝26.079X－0.027 1， R2＝0.999 7， 表明烏頭堿在2.832～47.2 μg／mL范圍內線性關系良好

2.1.5 總生物堿含有量測定 精密量取 “2.1.2”項下供試品溶液2 mL置分液漏斗中，加氯仿補足15 mL，再加入溴甲酚綠溶液10 mL，劇烈振搖3 min，靜置30 min，取下層液，于403 nm處測定，見表2。

表2 各樣品總生物堿含有量測定結果 （%）Tab.2 Results of content determination of total alkaloids of various samples（%）

2.2 酯型生物堿含有量測定

2.2.1 供試品溶液制備 取附子樣品粉末 （過3號篩）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，精密加入異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，稱定質量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz，水溫25℃以下）30 min，放冷，再稱定質量，用異丙醇-乙酸乙酯 （1∶1）混合溶液補足減失的質量，搖勻，過濾。精密量取續(xù)濾液25 mL，40℃以下減壓回收溶劑至干，殘渣精密加入異丙醇-二氯甲烷 （1∶1）混合溶液3 mL溶解，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液制備 取烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿對照品適量，精密稱定，加異丙醇-二氯甲烷 （1∶1）混合溶液制成混合對照品溶液，即得，質量濃度分別為 45.4、43.2、46.4、47.4、 41.6、 40.6 μg／mL。

2.2.3 色譜條件 DikmaDianonsil C18柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動相乙腈-四氫呋喃 （25∶15）（A）-0.1 mol／L醋酸銨溶液 （B）， 梯度洗脫， 程序見 表 3； 檢 測 波 長 235 nm； 體 積 流 量1.0 mL／min； 柱溫 30 ℃； 進樣量 10 μL。

表3 梯度洗脫程序Tab.3 Gradient elution programs

2.2.4 樣品含有量測定 取混合對照品溶液、供試品溶液，注入液相色譜儀，在 “2.2.3”項色譜條件下測定。采用外標一點法計算酯型生物堿含有量，見表4。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表4 各樣品酯型生物堿含有量測定結果 （mg／mL）Tab.4 Results of content determination of ester alkaloidof various samples （mg／mL）

2015年版 《中國藥典》［1］規(guī)定黑順片、白附片雙酯型生物堿含有量以烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿之和計不得過0.020%，單酯型生物堿含有量以苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿之和計不得少于0.010%?！端拇ㄊ≈兴庯嬈谥埔?guī)范》［14］規(guī)定生附片雙酯型生物堿含有量以烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿之和計為0.10%～0.25%，熟附片、蒸附片、炒附片不得超過0.020%；熟附片單酯型生物堿以苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿之和計不得少于0.010%，蒸附片、炒附片為0.010～0.130%。

3 討論與結論

3.1 生附片生物堿含有量分析 從總生物堿含有量變化上，江油產生附片總生物堿的含有量為0.580%～0.790%，其中生附片 （去皮）的含有量最高，達到0.790%，云南產生附片的含有量最低，為0.490%。從酯型生物堿含有量變化，江油產生附片的單酯型生物堿含有量為0.020 1%～0.042 4%，云南產生附片為0.014 9%，單酯型生物堿的含有量以江油產較高，云南產較低；江油產生附片雙酯型生物堿含有量為0.080 3%～0.170 5%，云南產生附片含有量最高為0.195 7%，雙酯型生物堿含有量以云南產較高，江油產較低。見圖2。

圖2 不同產地生附片生物堿類成分對比Fig.2 Comparison of alkaloids in raw monkhood from different areas

江油為附子的道地產區(qū)，其生附片總生物堿含有量高，而雙酯型生物堿含有量低，云南生附片總生物堿含有量低，但雙酯型生物堿含有量高，從毒與有效成分來看，江油生附片的質量優(yōu)于云南產的生附子。

此外，生附片去皮后總生物堿含有量增高，表明附片皮部中總生物堿含有量較低，因此去皮炮制，富集有效部位，提高附子炮制品的總生物堿含有量，為附子的炮制提供了新思路。

3.2 白附片產地與炮制工藝分析

3.2.1 產地影響 從總生物堿含有量變化上，江油產白附片總生物堿含有量為0.07%～0.23 0%，云南產白附片含有量為0.244%～0.440%，陜西產白附片含有量為0.128%，即總生物堿含有量云南產＞江油產＞陜西產，其中云南產無膽白附片（D2）含有量最高，達到0.440%。從酯型生物堿含有量變化上，江油產單酯型生物堿白附片含有量為0.010 1% ～0.015 8%，云南產含有量為0.032 6%～0.121 5%，陜西產含有量為0.023 0%，即單酯型生物堿含有量為云南產＞陜西產＞江油產，其中最高者為云南產無膽白附片；江油產白附片雙酯型生物堿含有量為0.000 8%～0.003 4%，云南產含有量為0.007 1%～0.019 9%，陜西產含有量為0.015 3%，即雙酯型生物堿含有量為云南產＞江油產＞陜西產，含有量最高者亦為云南無膽白附片。見圖3。

圖3 白附片生物堿類成分對比Fig.3 Comparison of alkaloid components in white monkshood

3.2.2 炮制工藝影響 無膽白附片［17］的炮制工藝為泥附子凈制、煮制、切片、蒸制、干燥，不經(jīng)膽巴炮制、流水漂洗；無膽白附片的總生物堿、單酯型生物堿含有量均高于傳統(tǒng)膽巴炮制白附片，同時毒性成分雙酯型生物堿含有量也顯著高于傳統(tǒng)白附片，存性效果較好，而去毒能力不足；傳統(tǒng)膽巴炮制白附片工藝相對復雜，但在保證藥效的基礎上，去毒能力較強。因此，無膽炮制白附片工藝雖具有一定可取之處，但不能完全取代傳統(tǒng)膽巴炮制，白附片的無膽巴炮制工藝有待進一步研究優(yōu)化。

3.3 蒸制工藝影響 白附片總生物堿含有量為0.070%～0.440%，熟附片總生物堿含有量為0.110%～0.130%；白附片單酯型生物堿含有量為0.010 1%～0.121 5%，熟附片單酯型生物堿含有量為0.011 0%～0.012 4%；白附片雙酯型生物堿含有量為0.001 2%～0.022 1%，熟附片雙酯型生物堿含有量0.001 0%～0.006 3%；白附片的總生物堿、酯型生物堿含有量均高于熟附片。見圖4。

圖4 白附片與熟附片生物堿類成分對比Fig.4 Comparison of alkaloid content between white and cooked monkshood

白附片與熟附片的炮制工藝相似，但蒸制時間存在差異，熟附片蒸制較長，需蒸至附片表面呈油性光澤。熟附片總生物堿、酯型生物堿含有量均低于白附片，可能蒸制時間過長會造成生物堿類成分流失。

3.4 蒸、炒工藝影響 相比于白附片、熟附片，蒸附片、炒附片的總生物堿與單酯型生物堿的含有量均較高，雙酯型生物堿含有量均較低，其中總生物堿含有量蒸附片較高，單酯型生物堿含有量炒附片較高，雙酯型生物堿含有量在兩種附片中差異不大。見圖5。

圖5 蒸附片與炒附片生物堿類成分對比Fig.5 Comparison of alkaloid content between steamed and fried monkshood

3.4.1 漂洗影響 蒸附片與炒附片不經(jīng)膽巴炮制與漂洗，工藝簡單，總生物堿及單酯型生物堿含有量均高于白附片、熟附片 （有膽）的平均水平，其總生物堿的保留率較高，雙酯型生物堿轉化率也較高。白附片、熟附片為膽巴炮制附片，炮制過程中經(jīng)膽巴水浸泡，后用流水反復漂洗退膽，推測漂洗工藝可能會造成附子中生物堿類成分大量流失。

3.4.2 無膽炮制附子工藝優(yōu)勢 2015年版 《中國藥典》規(guī)定，采用膽巴水浸泡、煮、漂洗退膽、蒸等系列工序炮制附子，工藝繁瑣，盡管能有效去毒，但漂洗退膽過程中損失有效成分而存性不足，同時易引入膽巴中的無機雜質；而無膽蒸制、炒制附子炮制工藝簡單，去毒存性且不易引入無機雜質。蒸附片、炒附片現(xiàn)收載于 《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》，主要流通于四川當?shù)?，為地方沿用品種，從化學成分及臨床反饋看，炮制工藝優(yōu)勢明顯，建議 《中國藥典》 增加蒸制和炒制工藝［18-19］。3.5 總結 以生物堿類成分的平均含有量對比附子不同炮制品的差異，見圖6。

圖6 附子不同炮制品生物堿含有量對比Fig.6 Comparison of alkaloid content in different processed products of monkshood

附子各炮制品中總生物堿含有量以生附片最高，其次是蒸附片和炒附片，含有量較低的為白附片及熟附片，即生附片＞蒸附片＞炒附片＞白附片＞熟附片。相比生附片，炮制后的附片單酯型生物堿含有量明顯升高，雙酯型生物堿含有量明顯降低，單酯型生物堿與雙酯型生物堿含有量占比發(fā)生改變，各炮制品中，單酯型生物堿含有量為炒附片＞蒸附片＞白附片＞生附片＞熟附片，雙酯型生物堿含有量為生附片＞白附片＞蒸附片＞炒附片＞熟附片。檢測分析表明，不同的炮制方法，能不同程度的降低附子中毒性成分雙酯型生物堿的含有量，增加有效成分單酯型生物堿的含有量，達到增效減毒的目的。