液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在藥品質(zhì)量分析中的應(yīng)用進(jìn)展

張杰,趙文法,王春雷,馮家龍,李培,胡雨生

(聊城市檢驗(yàn)檢測中心,山東 聊城 252000)

高效液相色譜( HPLC)是一種采用顆粒極細(xì)的高效固定相的柱色譜分離技術(shù),是中國藥典(2020版)[1]規(guī)定的藥品分析的主要方法之一,質(zhì)譜(MS)是強(qiáng)有力地結(jié)構(gòu)分析工具,可以作為色譜檢測器,而串聯(lián)質(zhì)譜是在單級質(zhì)譜給出分子質(zhì)量信息后,對化合物進(jìn)行多極裂解,通過監(jiān)測碎片信息,定量檢測被測物質(zhì)含量,得到化合物結(jié)構(gòu)信息。LC-MS/MS技術(shù)可將 HPLC的在線分離和MS的高選擇、高靈敏度檢測能力相結(jié)合,同時得到化合物的分子量、保留時間和特征結(jié)構(gòu)碎片等信息,短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品的快速篩查、未知樣品的結(jié)構(gòu)確證和極低濃度樣品的微量痕量分析。與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用( GC-MS)[2]相比,HPLC-MS/MS[3]更適用于極性、熱不穩(wěn)定和大分子化合物的測定,且樣品前處理更加簡便,無需衍生化,應(yīng)用前景更加廣闊。

液質(zhì)聯(lián)用儀的主要部件有:液相色譜儀、質(zhì)譜儀、離子源、質(zhì)量分析器,樣品經(jīng)HPLC分離后進(jìn)入離子源,在離子源電離產(chǎn)生帶有不同質(zhì)荷比(m/z)的離子,不同離子在電場中的受力行為不同,質(zhì)量分析器按質(zhì)荷比的不同將碎片離子排列得到質(zhì)譜圖,通過質(zhì)譜圖的處理,得到定性定量信息和化合物結(jié)構(gòu)信息。電離技術(shù)曾一度是液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)發(fā)展的“瓶頸”,如今常見的電離技術(shù)有電噴霧電離(ESI)、大氣壓化學(xué)電離(APCI)和基體輔助激光解吸電離技術(shù)(MALDI)等,其中使用最多的是ESI和APCI。液質(zhì)聯(lián)用儀中常見的質(zhì)譜包括串聯(lián)四級桿、離子阱、高分辨和飛行時間質(zhì)譜等,這些質(zhì)譜與同位素標(biāo)記技術(shù)結(jié)合,在藥品質(zhì)量分析領(lǐng)域應(yīng)用的越來越多,為藥品及其代謝產(chǎn)物的定性定量分析發(fā)揮了重要作用。

藥品質(zhì)量分析離不開藥品檢驗(yàn),藥品檢驗(yàn)一般包括四個方面:外觀性狀檢查、初步鑒別、雜質(zhì)檢查、含量測定。外觀性狀檢查是指對藥品的色澤、晶型、折射率、溶解度等進(jìn)行檢測,初步判斷是否為該藥品;初步鑒別主要是從化學(xué)反應(yīng)的角度,根據(jù)此類藥品的特征反應(yīng),如和某種特定試劑生成某種特定產(chǎn)物或產(chǎn)生特異性顏色,據(jù)此來判斷藥品是否與品名相符;雜質(zhì)檢查[4]是指對藥品的生產(chǎn)、制備、提取等工藝過程可能產(chǎn)生的雜質(zhì)進(jìn)行檢測和確定其副作用的過程;含量測定主要是確定該藥品的有效成分是否在規(guī)定的范圍內(nèi)。

目前藥典規(guī)定的常用的方法有重量法、滴定法、電化學(xué)法、光譜法和色譜法等,每種方法側(cè)重點(diǎn)不同,HPLC-MS作為行業(yè)內(nèi)公認(rèn)的最為有效的監(jiān)測手段之一,主要是對藥品中已知成分進(jìn)行準(zhǔn)確定量,對未知成分和雜質(zhì)進(jìn)行定性和鑒別,進(jìn)而確定藥品質(zhì)量是否達(dá)標(biāo)。除此以外,HPLC-MS技術(shù)在藥品動力學(xué)研究、代謝組學(xué)研究和打擊制售假藥和非法添加等違法行為上也發(fā)揮著不可替代的作用。

1 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在藥品分析各領(lǐng)域中的應(yīng)用

1.1 藥品含量測定

藥品含量測定是藥品質(zhì)量控制中最重要的環(huán)節(jié)之一,藥品含量是指一種藥品制劑中包含的國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的有效成分的數(shù)量,藥品的含量或效價是評定藥品的主要指標(biāo)之一。

三七是我國重要的民族藥,其主根、支根和根莖均可入藥,但是不同部位的成分是否存在差異,截至目前研究尚少,現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)無法實(shí)現(xiàn)三七不同部位的準(zhǔn)確區(qū)分,黃鈺青等人[5]首先利用LC/MS技術(shù)建立三七不同部位的指紋圖譜,利用無監(jiān)督的聚類分析(HCA)、主成分分析(PCA)和有監(jiān)督方法偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)進(jìn)行數(shù)據(jù)建模,尋找三七不同部位間的質(zhì)量差異,最終篩選出4個特征性指標(biāo)(人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3和20(S)-人參皂苷-Rg2)用于區(qū)分三七不同藥用部位,并對分類模型的可靠性和準(zhǔn)確性進(jìn)行了確證,此法可以有效評價三七質(zhì)量。曹妍等人[6]利用1H-NMR的非靶標(biāo)整體代謝輪廓分析快速獲得熊膽粉樣品中化學(xué)成分組的定性信息,再結(jié)合LC-MS的色譜分離功能對10個標(biāo)志性膽酸類成分進(jìn)行準(zhǔn)確定量,精準(zhǔn)找出差異性成分,兩種技術(shù)的結(jié)合為制定熊膽粉及常見膽類中藥的國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù),為中藥化學(xué)成分的分析提供新思路。Darwish等人[4]采用UPLC-MS/MS結(jié)合藥理學(xué)研究方法對側(cè)柏的抗炎生物標(biāo)志物進(jìn)行化學(xué)分析和鑒定,結(jié)果顯示靶向化合物有阿福豆苷、楊梅素、芹菜素-7-O-己糖苷、槲皮苷和金絲桃苷,主要靶向位點(diǎn)有IL2、VEGFA、AKT1、AKT2、CREB1、IL5、RPS6KB1和TNF,進(jìn)一步對槲皮苷和金絲桃苷進(jìn)行抗炎活性測試,結(jié)果表明所鑒定的靶向化合物與炎癥和免疫相關(guān)的靶點(diǎn)和通路表現(xiàn)出較強(qiáng)的協(xié)同作用。Samuel等人[8]采用新的LC-MS/MS測定藥物產(chǎn)品中十三種抗生素,用于篩選藥物產(chǎn)品質(zhì)量。中藥注射劑作用迅速且利用度高,但不良反應(yīng)較多,因此明確引發(fā)不良反應(yīng)的物質(zhì)并控制其含量,對臨床應(yīng)用安全至關(guān)重要。孫衛(wèi)等人[9]建立了益氣復(fù)脈和生脈注射液中人參皂苷Rd、Rg3和雜質(zhì)5-羥甲基糠醛(5-HMF)的LC-MS/MS檢測方法,而且該方法測定樣品中的5-HMF的含量遠(yuǎn)低于《中國藥典》規(guī)定的含量。

1.2 中藥活性成分分析

中藥成分復(fù)雜,發(fā)揮藥效的成分很難確定,要想闡明中藥的作用機(jī)制和療效,就必須對中藥中的化學(xué)活性成分進(jìn)行分離鑒定。傳統(tǒng)的薄層色譜雖能將復(fù)雜的中藥成分分離,但若要準(zhǔn)確定性定量和結(jié)構(gòu)分析,則必須借助其他分析手段,這不僅費(fèi)時費(fèi)力,有時還很難進(jìn)行精準(zhǔn)確定。近年來,液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)發(fā)展迅速,它以高效快速、高通量、前處理簡單、用量少等優(yōu)勢在中藥化學(xué)活性成分分析領(lǐng)域展現(xiàn)出了極大的優(yōu)勢,實(shí)現(xiàn)了中藥的自動化分析,大大降低了分析難度,提高了分析檢測效率。

吳福林等人[10]采用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)對止痛化癥膠囊(簡稱"ZTHZC")中的化學(xué)成分進(jìn)行分離,通過UNIFI數(shù)據(jù)庫篩查,對ZTHZC中化學(xué)成分進(jìn)行定性分析,共鑒定出70個化學(xué)成分,包括38個有機(jī)酸及有機(jī)酸酯類、8個生物堿類、9個黃酮類、5個三萜皂苷類、5個醛類、2個酮類、1個醌類、1個聚炔類和1個單萜類化合物,實(shí)現(xiàn)了ZTHZC中化學(xué)成分的快速檢測。譚靜等人[11]利用UPLC-Q-TOF MS技術(shù),結(jié)合UNIFI分析平臺,通過比對各成分之間的分子量、保留時間、質(zhì)譜碎片信息等,對中藥大品種血栓心脈寧片(XXT)化學(xué)成分進(jìn)行分析,共鑒定出包括甾體類、菲醌類和三萜皂苷類等在內(nèi)的187種化學(xué)成分,研究可為XXT的質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)參考。Gao等人[12]采用AB-8大孔樹脂將大粒車前子( PAL )提取物分成3個部分,分別采用UHPLC-Q-TOF MS和UHPLC-IM-MS進(jìn)行分離鑒定,通過兩種技術(shù)提供的質(zhì)譜信息和碎片離子信息,共鑒定了三萜類、環(huán)烯醚萜類、苯乙醇苷類、胍類衍生物、有機(jī)酸類、脂肪酸類等86個化合物。其中UHPLC-IM-MS主要用于鑒定同分異構(gòu)體和共洗脫化合物,使出現(xiàn)在相同保留時間的產(chǎn)物離子可以通過其不同的漂移時間明確區(qū)分母離子所屬的位置,結(jié)合理論計(jì)算方法檢測并鑒定了來自PAL的一對車前草苷異構(gòu)體。該策略可為中藥復(fù)雜體系中化學(xué)成分的分離鑒定和同分異構(gòu)體的區(qū)分提供有效的方法。龐博等人[13]在其論文中詳細(xì)論述了微透析-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥活性成分分析中的應(yīng)用,認(rèn)為該技術(shù)可針對特定的疾病靶點(diǎn)(分子、細(xì)胞)對中藥活性成分進(jìn)行高通量篩選,有利于從分子、細(xì)胞水平闡明藥物的作用機(jī)理,為疾病治療和新藥研發(fā)提供依據(jù)。

1.3 藥品有關(guān)物質(zhì)分析

藥品中的有關(guān)物質(zhì)即原料藥和藥物制劑中的有機(jī)雜質(zhì)[4],這些雜質(zhì)的來源途徑有合成過程中的副反應(yīng)、原料帶入、藥物存儲過程中產(chǎn)生的降解產(chǎn)物等。FDA的指南中指出當(dāng)藥品雜質(zhì)低于0.1%時一般不必進(jìn)行鑒定,但是對于那些可能產(chǎn)生毒副作用的雜質(zhì)即使含量低于0.1%也應(yīng)當(dāng)鑒定。

Ming等人[14]利用液相色譜-高分辨質(zhì)譜( LC-HRMS )法對合成催產(chǎn)素(OXT )原料中存在的18種結(jié)構(gòu)相關(guān)肽雜質(zhì)進(jìn)行了定性鑒定和定量檢測,且該法被用于測量用來進(jìn)行國際比較的OXT研究材料,以評價實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行肽表征的能力。鄧博等人[15]在其論文中詳細(xì)介紹了近年來UPLC-MS/MS在應(yīng)用于人體、動物體的化學(xué)藥品以及中醫(yī)藥分析三方面的最新應(yīng)用研究,為醫(yī)藥產(chǎn)品檢測與分析、臨床藥物應(yīng)用提供了參考。Yang等人[16]利用LC-MS/MS技術(shù)對輔酶A生產(chǎn)過程和主藥降解產(chǎn)生的10種雜質(zhì)進(jìn)行了確證,并合成了其中3種未知雜質(zhì),并利用核磁共振技術(shù)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。鄒文博等人[17]采用二維色譜-高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜法(2D-LC-Q-TOF-MS)對熱降解頭孢美唑鈉中的未知雜質(zhì)進(jìn)行了定性鑒定,其中一維液相色譜為等度洗脫,流動相為非揮發(fā)性鹽,二維液相色譜為梯度洗脫,流動相為質(zhì)譜兼容的揮發(fā)性流動相,兩個色譜采用中心切割技術(shù)實(shí)現(xiàn)切換,質(zhì)譜采用ESI源進(jìn)行離子化,氬氣做碰撞氣,全掃描-數(shù)據(jù)相關(guān)分析模式( DDA) 進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示雜質(zhì)1和雜質(zhì)3為頭孢美唑的甲氧亞胺鍵的順反異構(gòu)體和 6R,7S-的異構(gòu)體,雜質(zhì)2(7-甲巰基頭孢美唑)可能是在合成過程中原料藥中殘留的甲硫醇與頭孢美唑上的甲氧基發(fā)生取代反應(yīng)生成的雜質(zhì)。替格瑞洛主要用于急性冠狀動脈綜合征的治療,但其工藝雜質(zhì)N,N-二乙基苯胺卻被視為遺傳毒性雜質(zhì),能引起 DNA 損傷,王慶鵬等人[18]以Ultimate?UHPLC XB-Phenyl(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)為色譜柱,以0.1 %甲酸水溶液和0.1 %甲酸的甲醇溶液為流動相建立了替格瑞洛原料藥中的N,N-二乙基苯胺的LC-MS/MS測定法,結(jié)果顯示該法靈敏度高,線性關(guān)系良好,定量限(LOQ)為0.2 ng/mL,回收率95.3 %,可滿足基因毒性雜質(zhì)測定要求。

1.4 中藥材中農(nóng)藥殘留檢測

中醫(yī)藥在我國歷史悠久,是人類同疾病做斗爭的重要法寶,然而隨著現(xiàn)代社會對中藥需求量的急劇增加,野生中藥材難以滿足需求,人們在種植過程中會使用農(nóng)藥來防止病蟲害,而這勢必會造成藥材中殘留農(nóng)藥,影響中藥材品質(zhì),使之成為“藥中藥”[19],危害人類健康,影響我國中藥材的出口和國際聲譽(yù)。中藥材中農(nóng)藥殘留種類繁多,從化學(xué)結(jié)構(gòu)和檢驗(yàn)檢測的角度來看,農(nóng)藥殘留大致可以分為:有機(jī)氯類農(nóng)藥、有機(jī)磷類農(nóng)藥、氨基甲酸酯類農(nóng)藥和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥等[20]。農(nóng)藥檢測的方法主要有薄層色譜法(TLC),氣相色譜法,GC/MS法[2],LC-MS/MS法[21]等。

農(nóng)殘檢測前處理技術(shù)包括固相萃取(SPE)、分散固相萃取(DSPE)、固相微萃取(MSPE)和凝膠滲透色譜技術(shù)( GPC) 等,在食品藥品檢測領(lǐng)域目前使用最多的技術(shù)就是DSPE,也就是QuEChERS技術(shù),其操作步驟主要是先用1%乙酸乙腈溶液或緩沖溶液提取樣品,然后用無水硫酸鎂或氯化鈉等進(jìn)行鹽析,用乙二胺-N-丙基硅烷( PSA)、C18粉末或石墨炭黑( GCB)吸附雜質(zhì),離心過濾后,對上清液進(jìn)行上機(jī)分析。該方法靈活性強(qiáng),提取溶液和吸附劑用量可以根據(jù)藥材和目標(biāo)物性質(zhì)進(jìn)行調(diào)整,也可與其他方法配合使用,能對大多數(shù)農(nóng)藥進(jìn)行高質(zhì)量提取,已經(jīng)成為世界各國農(nóng)藥殘留分析技術(shù)的模板[22]。

茵梔黃口服液處方由四種中藥提取物組成,常用于新生兒黃疸的治療中,檢測和控制其農(nóng)藥殘留尤為重要,李媛等人[23]采用QuEChERS法結(jié)合UPLC-MS/MS技術(shù)快速測定茵梔黃中的14種農(nóng)藥殘留,該法前處理快速簡便,用時短,平均回收率為71.64%～127.58% (RSD<15%),檢出限(LOD)為0.04～3.58 μg/L,能滿足我國藥典和歐盟標(biāo)準(zhǔn)的要求。Fan等人[24]對QuEChERS法進(jìn)行了改良,采用10 mg氨基修飾多壁碳納米管(MWCNTs-NH2)和150 mg無水硫酸鎂為吸附劑進(jìn)行分散固相萃取,對3種中藥中108種農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測,并對方法性能進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果顯示在所選基質(zhì)中所有農(nóng)藥在2～200 μg/L范圍內(nèi)線性良好,準(zhǔn)確度、精密度良好,靈敏度高,95%以上的農(nóng)藥回收率在70%～120%之間,對浙貝母、菊花和鐵皮石斛的LOD和LOQ分別為0.01～3.87 μg/kg和0.07～12.90 μg/kg。武曉麗等人[25]使用了一種新型QuEChERS樣品制備系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了振蕩、離心、提取液轉(zhuǎn)移和凈化的自動化,節(jié)約了人力,減輕了勞動強(qiáng)度,一次可以處理10批次樣品,提高了效率,通過從根莖類、花類、葉類藥材中各選擇1種代表性藥材,即半夏、金銀花、紫蘇葉,進(jìn)行加樣回收試驗(yàn),并將自動 QuEChERS與手動QuEChERS方法對比,結(jié)果顯示兩種方法處理后,3種藥材中農(nóng)藥的回收率和RSD基本一致,兩種方法的RSD都小于15%,30種禁用農(nóng)藥的回收率均在 60%～130%之間,LOQ均低于2020年版《中華人民共和國藥典》對禁用農(nóng)藥殘留的限量要求,能夠滿足分析方法的要求。

1.5 藥品中非法添加成分的檢測

如果說農(nóng)藥是人們在中藥材種植過程中不得已添加的,那么藥品中檢出非法添加成分則是不法商販有意為之的。現(xiàn)代人越來越重視身體健康,具有安神、降糖、降血脂等功能的中藥保健品也隨之增加,常有不法分子向其非法添加化學(xué)藥品,使之快速起效,但這些非法添加的化學(xué)物質(zhì)和添加劑量未知,長期食用將產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)[26-27],給群眾用藥安全帶來極大的威脅,食品藥品非法添加已成為近年來政府打擊的重要內(nèi)容,并且亟需系統(tǒng)有效的檢測手段進(jìn)行監(jiān)控。目前非法添加檢測面臨的主要困難就是中藥制劑成分復(fù)雜,非法添加行為隱蔽,常用的檢測手段主要有TLC[28]、HPLC[29]和LC-MS[30]法。2012年國家食藥總局發(fā)布了第一批保健食品中可能非法添加的物質(zhì)名單,并逐步發(fā)布了藥品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法2009029、2009032、2011008、2013001、2014008等,這些補(bǔ)充檢驗(yàn)方法多采用TLC初篩,HPLC定性定量分析,LC-MS進(jìn)行陽性確證。

Gao等人[31]建立了UHPLC-Q-TOF高分辨質(zhì)譜法對宣稱具有抗痤瘡作用的化妝品中非法添加的37種抗感染藥物進(jìn)行鑒別、確證和定量,方法驗(yàn)證線性關(guān)系良好,LOD和LOQ分別在0.000 3～0.106 3 μg/g和0.001 2～0.354 μg/g范圍內(nèi),平均回收率為70.1%～117.7%,基質(zhì)效應(yīng)為73.0%～121.4%,此法完全可以應(yīng)用于化妝品摻假的常規(guī)篩查。Gao等人[32]采用QuEChERS法建立了減肥降脂膠囊類保健品中16種非法添加化學(xué)藥物的分析,前處理時間大大縮短,實(shí)際測定后有兩批次樣品中檢出氟西汀。許江紅等人[33]建立了UPLC-MS法測定中草藥外用制劑中41種糖皮質(zhì)激素和8種抗真菌藥物的快速檢測,該法使用Kinetex-C18(4.6 mm×50 mm,2.6 μm)為色譜柱,乙腈和水為流動相,梯度洗脫,回收率范圍為88.3%～96.1%,RSD為0.47%～4.98%,該法為外用中草藥制劑中添加糖皮質(zhì)激素和抗真菌類藥物國家檢測標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了文獻(xiàn)參考。左甜甜等人[34]對具有活血化瘀功能的46批共78個益心酮片樣品中37個非法添加化合物進(jìn)行LC-MS檢測,結(jié)果顯示LOQ為3～10 μg/L,37個待測化合物的平均回收率為63.4%～138.3%,實(shí)際樣品測定過程中37個化合物只有阿司匹林有檢出。近年來中藥飲片的染色問題日趨嚴(yán)重,商家為追逐利益,保證飲片色澤,常會用非法染色劑進(jìn)行染色,這些染色劑會刺激皮膚黏膜和呼吸道,在體內(nèi)難以降解,影響中藥原料及其中藥制劑的臨床用藥安全性[35-36]。莫顯超等人[37]采用高效液相色譜二極管陣列檢測器(UPLC-DAD)對綠袍散及原料藥中金胺O、檸檬黃、日落黃、金橙Ⅱ和酸性橙10進(jìn)行了快速篩查,對于一批次原料藥中篩查出金胺O陽性,用LC-MS/MS進(jìn)行確證,結(jié)果顯示金胺O對照品的一級二級質(zhì)譜圖與供試品溶液中的色譜質(zhì)譜峰完全吻合。此外,李明華等人[38]和鄧杰華等人[39]利用LC-MS/MS技術(shù)分別對阿膠中的雜皮源和中藥中名貴成分以次充好的現(xiàn)象進(jìn)行了測定,以保障藥品質(zhì)量。

1.6 藥代動力學(xué)研究

藥物代謝動力學(xué)主要是研究藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄的一門學(xué)科,是確定給藥劑量和間隔時間的依據(jù),是判斷該藥能否到達(dá)靶向部位并達(dá)到安全有效濃度的依據(jù),是藥物臨床研究的重要組成部分。

Lin等人[40]成功建立并驗(yàn)證了利用LC-MS/MS同時測定大鼠血漿中野百合堿(MCT)和野百合堿N-氧化物( MNO )的快速、靈敏的方法,方法在1～2 000 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r>0.997。選擇性、基體效應(yīng)、準(zhǔn)確度和精密度、回收率結(jié)果均在接受標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi),該方法已成功應(yīng)用于MCT在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)行為和生物利用度研究,結(jié)果顯示MCT口服后迅速吸收(0.400±0.149)h,絕對生物利用度為78.2%。Cui等人[41]建立了基于LC-MS/MS法檢測人血漿中表皮生長因子受體(EGFR)新型突變選擇性抑制劑ASK120067及其主要代謝產(chǎn)物CCB4580030的快速高通量方法,采用乙腈沉淀蛋白,以0.1%甲酸和乙腈為流動相,BEH C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)進(jìn)行分離,ASK120067采用MRM模式,CCB4580030采用正離子模式,結(jié)果表明該法的精密度和準(zhǔn)確度較高,研究者還進(jìn)一步考察了從全血采集到血漿提取和分析的整個實(shí)驗(yàn)過程兩種分析物和內(nèi)標(biāo)物的穩(wěn)定性,并首次針對中國患者進(jìn)行臨床試驗(yàn),測定口服ASK120067的藥代動力學(xué)。Khadiga等人[42]建立了一種新型、高通量、靈敏的LC-MS/MS法用于人血漿中吡格列酮、羥基吡格列酮、阿格列汀的定量測定,結(jié)果表明三種藥物的線性范圍分別為10～3 000,5～2 000 ng/mL和3～300 ng/mL,均在4 min內(nèi)完成分析,該方法經(jīng)FDA指南進(jìn)行了充分驗(yàn)證,適用于測定人血漿中的三種分析物的濃度,并在埃及健康志愿者口服Oseni?片劑后證明了藥代動力學(xué)參數(shù)。黃僑宗等人[43]采用UPLC-MS/MS法首次對太子參及其有效成分太子參環(huán)肽B的體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)進(jìn)行了系統(tǒng)研究,研究表明在注射給藥后0.03 h和0.08 h太子參環(huán)肽B在大鼠血藥濃度較高,0.17 h時血藥濃度急劇降低,0.17 h后血藥濃度緩慢降低,1 h后血藥濃度趨近于零,通過軟件計(jì)算得到藥動學(xué)參數(shù)清除率CL為(27 868.71±779.63) L/( h·kg),表明太子參環(huán)肽 B 在大鼠血漿中清除速度快。李宇等人[44]在國內(nèi)首次報道了用LC-MS/MS技術(shù)內(nèi)標(biāo)法測定人血漿中尼美舒利及其主要活性代謝產(chǎn)物4-羥基尼美舒利,兩種物質(zhì)的最低定量限均為10.0 ng/mL,雖低于杜萍等[45]報道的1.0 ng/mL,但卻兼顧了尼美舒利和4-羥基尼美舒利,定量限與Halder等人[46]報道的大抵相當(dāng)。

1.7 藥物代謝組學(xué)研究

代謝組學(xué)是通過組群指標(biāo)定量分析研究生物體內(nèi)源性小分子代謝物(一般指MW<1 000)種類、數(shù)量變化的動態(tài)規(guī)律及與生理、病理變化的關(guān)聯(lián)[47]。代謝組學(xué)并不是對少數(shù)代謝物的分析,而是以代謝組(全體小分子物質(zhì))為研究對象,通過比較分析給藥前后個體的代謝表型和反應(yīng)表型來進(jìn)行藥物療效或毒性評價、預(yù)測[48-49],目前已廣泛應(yīng)用到藥物研發(fā)、分子病理學(xué)、營養(yǎng)學(xué)等領(lǐng)域。

藥物代謝組學(xué)完整的研究流程包括生物樣品采集與制備、數(shù)據(jù)采集、處理與分析等步驟,其中血樣和尿樣是最常用的樣品采集類型,樣品前處理則以預(yù)冷甲醇(-20 ℃或4 ℃)或甲醇-氯仿(體積比3∶1)液液萃取為主,主要目的是最大程度地保留和體現(xiàn)代謝物信息,降低干擾。目前代謝組學(xué)研究中使用最多的數(shù)據(jù)采集分析技術(shù)有NMR[50-51]、GC-MS[52-53]和LC-MS[54-56],NMR具有非破壞性的特點(diǎn),但其檢測動態(tài)范圍有限,具有“多峰多來源”這一特殊現(xiàn)象,影響后期代謝通路詮釋;LC-MS則存在基質(zhì)效應(yīng)和離子抑制/誘導(dǎo)作用。依托這三種技術(shù)得到的原始譜圖復(fù)雜,信息量大,需對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行信息挖掘和整合,得到代謝物輪廓的量化表達(dá),篩選出差異性變量即潛在生物標(biāo)記物,并深度挖掘其生化意義以指導(dǎo)相關(guān)生理病理機(jī)制的闡釋。

蔡蕭君等人[57]采用超高液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)采集細(xì)胞內(nèi)容物進(jìn)行代謝組學(xué)分析,探討丹貝益肺方對人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)的作用機(jī)制,實(shí)驗(yàn)將經(jīng)丹貝益肺方提取物預(yù)處理24 h的MRC-5設(shè)為給藥組,未經(jīng)丹貝益肺方提取物干預(yù)的MRC-5為模型組,未經(jīng)丹貝益肺方提取物干預(yù)的人胚肺正常細(xì)胞為空白組,結(jié)果顯示給藥組的細(xì)胞增殖抑制率為94%,遠(yuǎn)高于模型組,進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析后獲得磷脂酰乙醇胺、谷氨酰胺等6個差異代謝產(chǎn)物,這表明丹貝益肺方之所以能較好干預(yù)肺纖維化可能與調(diào)節(jié)精氨酸生物合成、天冬氨酸和谷氨酸代謝及D-谷氨酰胺代謝等有關(guān)。青稞( HB )具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減輕肝損傷等特性,Li等人[58]通過對小鼠糞便的代謝組學(xué)分析旨在探討HB、青稞麩皮( HBB )、全谷物青稞( WGHB )對高脂高膽固醇( HFCD )飲食小鼠脂質(zhì)代謝、肝臟炎癥、腸道菌群和代謝物譜的影響,結(jié)果表明HBB組和HFCD組的重要差異代謝物為脫氧膽酸、腈菌唑和順-4-羥基-D-脯氨酸,重要差異代謝通路為花生四烯酸代謝、酪氨酸代謝和膽汁分泌,HBB是一種有效的改善高脂血癥的膳食干預(yù)候選物。當(dāng)前,新冠病毒肆虐全球三年有余,給人類帶來了巨大損失與危害,通過對COVID-19患者進(jìn)行代謝組學(xué)分析,可以使我們有效評估疾病進(jìn)展,指導(dǎo)疾病控制策略。Ivanisenko等人[59]使用LC-MS/MS對30例COVID-19患者和19例對照者的血漿樣本進(jìn)行代謝組學(xué)分析,鑒定了103個富集于KEGG代謝通路的代謝物,利用AND系統(tǒng)軟件重建了SARS-CoV-2蛋白擾動COVID-19患者代謝通路的潛在遺傳調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò),為控制COVID-19疾病的進(jìn)展和非結(jié)構(gòu)蛋白疫苗的研發(fā)提供了理論依據(jù)。

2 未來的研究趨勢和研究熱點(diǎn)

LC-MS/MS技術(shù)分離效果好、靈敏度高、選擇性強(qiáng),通過獲得指紋圖譜還可以很好地解決藥品質(zhì)量控制問題,輕松實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的定性定量分析,也可以完成藥品真?zhèn)魏唾|(zhì)量優(yōu)劣的判定,與其他技術(shù)相比,LC-MS/MS技術(shù)檢出限更低,可以實(shí)現(xiàn)藥物在人體代謝后的痕量代謝產(chǎn)物分析,該技術(shù)極大地促進(jìn)了藥品質(zhì)量的提升和藥品行業(yè)的發(fā)展。但是我們也要認(rèn)識到LC-MS/MS技術(shù)的缺點(diǎn),如儀器價格昂貴,體積較大,維護(hù)運(yùn)行成本高,耗材需要定期更換,操作相對復(fù)雜,對使用人員的學(xué)歷水平要求較高,在某些領(lǐng)域的應(yīng)用上,往往需要與其他技術(shù)聯(lián)合使用才能達(dá)到研究目的,因此我們要認(rèn)清LC-MS/MS技術(shù)在藥品質(zhì)量分析領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀,準(zhǔn)確分析把握研究熱點(diǎn)和趨勢,更好地為醫(yī)藥行業(yè)健康發(fā)展貢獻(xiàn)力量。

2.1 在藥品質(zhì)量控制領(lǐng)域

藥品質(zhì)量控制是保障老百姓用藥安全的重要手段,在未來不僅要繼續(xù)關(guān)注藥品本身的成分是否符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定,還要全面系統(tǒng)分析藥品中可能的雜質(zhì),確保臨床用藥安全性。為此一方面要研發(fā)新的液質(zhì)技術(shù),實(shí)現(xiàn)從藥品原料,藥品生產(chǎn)和藥品上市的全鏈條自動化檢測和監(jiān)管,節(jié)省大量的人力物力。另一方面要建立藥品有關(guān)物質(zhì)檢測質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫,做好數(shù)據(jù)比對和篩查,對不同種類的藥品分別建立數(shù)據(jù)庫,同時要加大對藥品中微量雜質(zhì)的篩查力度,先借助LC-MS/MS和相關(guān)技術(shù)確定雜質(zhì)化合物的結(jié)構(gòu),再結(jié)合藥物代謝組學(xué)和動力學(xué)研究其副作用和危害。第三個方面充分利用LC-MS/MS技術(shù)做好藥品上市后的監(jiān)管和抽檢,及時發(fā)現(xiàn)有問題的藥品,讓老百姓的損失降到最低。

2.2 在中藥研究領(lǐng)域

未來LC-MS/MS在中藥領(lǐng)域研究應(yīng)該主要集中以下幾個方面:一方面要利用液質(zhì)特有的結(jié)構(gòu)鑒定和定性定量功能,建立中藥指紋圖譜,提高中藥化學(xué)成分定性的速度、準(zhǔn)確度和可信度。大力發(fā)展分子網(wǎng)絡(luò)、最佳碰撞能量、碰撞截面、定量結(jié)構(gòu)-保留關(guān)系模型等新的技術(shù)和方法,擴(kuò)大化合物的分析范圍,特別是對異構(gòu)體、手性分子和微量成分的分析。另一方面要加強(qiáng)對中藥農(nóng)殘的篩查檢測力度,目前新版《中國藥典》中已經(jīng)收錄了農(nóng)藥多殘留的檢測方法,而且LC-MS/MS適用于復(fù)雜樣本體系中多種目標(biāo)化合物快速定量,分析效率極高,極大地節(jié)約了時間和試劑成本。但是在查閱文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)在該領(lǐng)域的新研究較少,基質(zhì)效應(yīng)問題難以克服,儀器成本較高,影響方法使用的普及性,因此要根據(jù)不同農(nóng)藥性質(zhì)及限量,結(jié)合中藥材本身性質(zhì)選擇最適合的檢測方式,同時要輔助制定用藥規(guī)范,避免中藥材的外源性污染,保證用藥安全。第三個方面要關(guān)注中藥材和保健品中非法添加的新趨勢,如同一功效的物質(zhì)添加數(shù)量多,同時添加多種功效的化學(xué)物質(zhì),添加劑量不同,隨意添加,為規(guī)避檢測,添加新型結(jié)構(gòu)的衍生物等,目前非法添加的違法行為已經(jīng)由系統(tǒng)性、高發(fā)性向隱蔽性、偶發(fā)性轉(zhuǎn)變,未來LC-MS/MS技術(shù)可以重點(diǎn)關(guān)注新型衍生物的篩查,降低基質(zhì)干擾,避免復(fù)雜的前處理,實(shí)現(xiàn)快速檢測和篩查。

2.3 在藥物代謝動力學(xué)和代謝組學(xué)研究領(lǐng)域

在藥物代謝動力學(xué)和代謝組學(xué)研究領(lǐng)域,未來人們可以充分利用LC-MS/MS特有的結(jié)構(gòu)鑒定、未知物和代謝產(chǎn)物篩查以及定性定量等特點(diǎn)來研究藥物在體內(nèi)的代謝特點(diǎn),分析比較藥物干預(yù)前、后生物體代謝譜,評價和預(yù)測藥物的療效、毒性及藥動學(xué)特征,為臨床個體化用藥和精準(zhǔn)治療提供新的思路與策略。

3 結(jié)論

LC-MS/MS技術(shù)的出現(xiàn)為藥品質(zhì)量分析提供了全新的思路與方法,在藥物安全性和有效性研究中已取得一定成果,但仍有很多問題亟待解決,不過隨著技術(shù)的發(fā)展,LC-MS/MS將更好地服務(wù)于藥品質(zhì)量控制和藥品質(zhì)量提升,為打擊藥品領(lǐng)域違法違規(guī)行為提供技術(shù)支撐,為藥品行業(yè)健康發(fā)展保駕護(hù)航。