郭秀麗

摘 要 為建立杉木無性系發(fā)育技術(shù)體系，以廣西杉木為試驗材料，選擇樹勢基本相同、生長健壯、無病蟲害的杉木為外植體進行組培快繁技術(shù)試驗研究。結(jié)果表明：（1）外植體最佳消毒方案是使用70%酒精浸泡15 s，滅菌后采用無菌水洗滌3次，再用0.1%升汞浸泡消毒8 min后采用無菌水洗滌5次；（2）初代誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0.6 mg·L^-1，該培養(yǎng)基有利于增加培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率和萌芽率，提高培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果；（3）增殖誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0.6 mg·L^-1+IBA0.3 mg·L^-1，獲得的組培苗芽多，莖粗壯；（4）生根最適培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.8 mg·L^-1+IAA0.1 mg·L^-1；（5）杉木組培苗移栽的最適基質(zhì)是泥炭土∶菜園土∶蛭石=4∶2∶1，其幼苗成活率達到91.93%，幼苗健壯，葉色深綠。

關(guān)鍵詞 廣西杉木；組織培養(yǎng)；培養(yǎng)基；增殖培養(yǎng)

中圖分類號：S791.27.05文獻標識碼：A doi：10.13601/j.issn.1005-5215.2023.06.012

Research on Tissue Culture and Breeding Technology of Superior Clones of Guangxi Fir

Guo Xiuli

（Guangxi Zhuang Autonomous Region State-owned Huangmian Forest Farm， Liuzhou 545600， China）

Abstract In order to establish a technical system for the development of Guangxi fir clones， the experiment took Guangxi fir as the research material， and selected Guangxi fir with basically the same vigor， robust growth， and no pests and diseases as explants to carry out tissue culture rapid propagation technology research.The results showed as the following five aspects. （1） The optimal disinfection scheme of explants was to soak in 70% alcohol for fifteen seconds， wash with sterile water for three times after sterilization， soak and disinfect with 0.1% mercuric chloride for eight minutes， and then wash with sterile water for five times. （2） The best medium for primary induction was 1/2MS+6-BA0.6mg·L^-1， which was beneficial to increasing the induction rate and germination rate of the medium and improving the culture effect of the medium. （3） The optimal medium for proliferation induction was 1/2MS+6-BA0.6mg·L^-1+IBA0.3mg ·L^-1， the obtained tissue culture seedlings had many buds and thick stems. （4） The optimal medium for rooting was 1/2MS+IBA0.8mg·L^-1+IAA0.1mg·L^-1. （5） The most suitable substrate for transplanting Guangxi fir tissue culture seedlings was peat soil： vegetable garden soil： vermiculite = 4：2：1， by which survival rate of seedlings reached 91.93%. Guangxi fir seedlings were robust and the leaves were dark green.

Key words Guangxi fir; tissue culture; culture medium; proliferation culture

杉木（Cunninghamia lanceolata）是我國特有的造林樹種，具有生長速度快、樹干通直、產(chǎn)量高、材質(zhì)軟、易加工等特點，是重要的建筑原料和木纖維工業(yè)原料^[1]。廣西壯族自治區(qū)是杉木種質(zhì)資源的重要保護區(qū)，廣西杉木種子園大多建于20世紀70年代末，現(xiàn)保留面積約333.3 hm²。近年來，廣西大力發(fā)展杉木用材林，現(xiàn)有杉木林119.17萬hm²，蓄積10 565.22萬m³，杉木的發(fā)展為廣西林業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展和林業(yè)產(chǎn)值增加發(fā)揮了重要作用^[2，3]。目前，廣西杉木仍以常規(guī)育種為主，傳統(tǒng)的實生苗因抗逆能力差、成活率相對較低等自身因素的影響，始終制約著杉木產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展^[4]。無性系繁殖是無性系育種的一部分，能夠充分發(fā)掘母株的遺傳潛能，獲得最大限度的遺傳增益^[5，6]。隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外學(xué)者對無性系繁育技術(shù)與組織培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合建立快繁育苗體系做了大量工作，為林木優(yōu)良無性系選育和無性系造林提供了技術(shù)支撐^[7-9]。為進一步提高杉木良種選育效率，促進廣西林業(yè)又好又快發(fā)展，試驗立足于廣西本地優(yōu)質(zhì)杉木種源區(qū)，篩選種源和家系優(yōu)良、單株表型性狀優(yōu)良的杉木并對其進行擴繁，通過對杉木無性系組培繁育技術(shù)的研究，旨在為推動廣西杉木良種化進程提供物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在廣西壯族自治區(qū)國有黃冕林場選擇優(yōu)良無性系杉木作為試驗材料進行組培繁育技術(shù)研究。

1.2 試驗方法

1.2.1 杉木組培外植體滅菌

選擇杉木樹勢基本相同、生長健壯、無病蟲害的杉木外植體，用無菌剪刀剪去全部針葉，剪切成1～2 cm的帶芽莖段。用10 mL·L^-1洗潔精溶液浸泡洗滌30 min，流水沖洗2～3 h。放入超凈工作臺，用75%酒精和0.1%升汞進行滅菌處理試驗：酒精滅菌試驗設(shè)置10、15、20和25 s 4個滅菌時間梯度，滅菌后采用無菌水洗滌3次；升汞滅菌試驗設(shè)置4、6、8和10 min 4個時間梯度，滅菌后采用無菌水洗滌5次。試驗共16個處理，每個處理接種50個外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)溫度25 ℃，濕度50%～70%，光照時間12～14 h·d^-1，光照強度1 500～2 000 lx，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計外植體的成活率和污染率。

1.2.2 初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選與優(yōu)化

篩選出最佳外植體滅菌處理后，將無菌外植體接入到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，以篩選出最適宜的基本誘導(dǎo)培養(yǎng)基。基本培養(yǎng)基采用1/2MS，添加不同濃度的6-BA進行單因子試驗，6-BA設(shè)置0.2 mg·L^-1（A1）、0.4 mg·L^-1（A2）、0.6 mg·L^-1（A3）、0.8 mg·L^-1（A4）和1.0 mg·L^-1（A5）5個濃度處理，每個處理接種50個外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)溫度25 ℃，濕度50%～70%，光照時間12～14 h·d^-1，光照強度1 500～2 000 lx，培養(yǎng)40 d后觀察培養(yǎng)效果，并統(tǒng)計外植體萌芽率、誘導(dǎo)率。

1.2.3 增殖培養(yǎng)及培養(yǎng)基優(yōu)化

將初代培養(yǎng)基培養(yǎng)40 d的無菌苗接種到增殖培養(yǎng)基上觀察增殖效果。基本培養(yǎng)基采用1/2MS、3%蔗糖、0.7%卡拉膠，添加不同濃度的6-BA（0.4、0.6、0.8和1.0 mg·L^-1）和不同濃度的IBA（0.4、0.8和1.2 mg·L^-1）進行增殖培養(yǎng)試驗。試驗采用完全隨機試驗設(shè)計，共12個處理，每個處理接種20瓶，每瓶接種5株無菌苗，重復(fù)3次。培養(yǎng)溫度25 ℃，濕度50%～70%，光照時間12～14 h·d^-1，光照強度1 500～2 000? lx，培養(yǎng)40 d后觀察組培苗的生長情況，統(tǒng)計不同處理增殖倍數(shù)、有效芽率和平均株高，并根據(jù)試驗結(jié)果對培養(yǎng)基進行調(diào)節(jié)和優(yōu)化。

1.2.4 生根培養(yǎng)及培養(yǎng)基優(yōu)化

采用無菌剪刀剪取2 cm以上生長基本一致、葉色翠綠的增殖苗進行生根試驗。生根試驗培養(yǎng)基采用1/2MS、2%蔗糖、0.7%卡拉膠，添加IBA（0.4、0.8和1.2 mg·L^-1）和IAA（0.1、0.3和0.5 mg·L^-1），共9個處理，每個處理接種50瓶，每瓶接種單苗2株，重復(fù)3次。培養(yǎng)溫度25 ℃，濕度50%～70%，光照時間12～14 h·d^-1，光照強度1 500～2 000 lx，不同處理培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計杉木組培苗的生根率、根長和生長情況，并對生根培養(yǎng)基進行調(diào)節(jié)和優(yōu)化。

1.2.5 煉苗與移栽基質(zhì)的優(yōu)化

生根培養(yǎng)30～40 d，當幼苗根長為2 cm左右時進行煉苗試驗。將瓶蓋擰松并置于室外散射光環(huán)境下進行煉苗，以增強組培苗適應(yīng)環(huán)境的能力，提高組培苗的成活率。煉苗時間為10 d，然后取出用清水漂洗根部的培養(yǎng)基，準備移栽。移栽基質(zhì)采用本地菜園土和泥炭土相結(jié)合的方式，設(shè)置（1）菜園土，（2）泥炭土∶菜園土=2∶1，（3）泥炭土∶菜園土∶蛭石=2∶1∶1，（4）泥炭土∶菜園土∶蛭石=4∶2∶1，共設(shè)置12個處理，每個處理移栽苗木100株，重復(fù)3次。根據(jù)生產(chǎn)實際，移栽時間為4月5日，移栽后澆灌定植水，并覆蓋小拱棚以保溫保濕，移植60 d后統(tǒng)計苗木的成活率和幼苗質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel2007進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用DPS7.05進行數(shù)據(jù)分析，采用LSD法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒試驗

由表1可知，酒精浸泡時間和升汞浸泡時間對杉木外植體的成活率和污染率影響較大，外植體的成活率、污染率隨著酒精和升汞浸泡時間的增加呈逐漸降低趨勢，兩者對外植體成活率和污染率影響的主次因素均為酒精>升汞。

通過極差分析，4個酒精浸泡時間水平以浸泡10 s處理的成活率和污染率均達到最大值，平均成活率和污染率分別達到94.61%和83.21%（表2）。與浸泡15 s處理相比，外植體的成活率和污染率增加不顯著，但與浸泡20 s和浸泡25 s的處理相比，外植體成活率分別增加了17.05%和23.64%，污染率分別增加了17.84%和53.18%，差異達到顯著水平。4個升汞浸泡時間水平以浸泡4 min處理的成活率和污染率達到最大值，平均成活率和污染率達到90.39%和83.45%（表2）。該處理的外植體成活率分別比浸泡8 min和10 min處理增加了6.95%和13.53%；污染率分別比浸泡8 min和10 min處理增加了23.36%和32.02%，差異均達到顯著水平。浸泡4 min處理的成活率和污染率與浸泡6 min處理相比均略有增加，但差異未達到顯著水平。

由此可見，杉木外植體的成活率與污染率成正比，在保證成活率的前提下，合理控制污染率極為重要，試驗條件下，以使用70%酒精浸泡15 s用無菌水洗滌后，再用0.1%升汞浸泡消毒8 min的消毒效果最佳，此方式可避免酒精長時間對外植體的浸染傷害，也可避免升汞在外植體表面殘留過多造成外植體后期死亡，污染率控制在76.05%，且成活率為88.22%。

2.2 初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選與優(yōu)化

由表3可知，杉木的誘導(dǎo)率和萌芽率均隨6-BA濃度的增加呈先增加后降低趨勢，并以A3處理效果最佳，其誘導(dǎo)率和萌芽率分別達到80.42%和74.35%。與A1、A2和A5處理相比，A3處理的誘導(dǎo)率分別增加了99.80%、64.90%和55.43%；萌芽率分別增加了93.52%、62.76%和59.04%，差異均達到顯著水平。與A4處理相比，A3處理的誘導(dǎo)率和萌芽率雖略有增加，但差異未達到顯著水平。從誘導(dǎo)情況來看，A3和A4處理的幼芽粗壯、長勢旺盛；A1、A2和A5處理的芽小而弱，長勢一般，特別是A1處理葉色偏黃，頂芽有枯死現(xiàn)象。

由此可見，選用1/2MS作為基本培養(yǎng)基時，添加0.6 mg·L^-1的6-BA有利于提高培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果，增加培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率和萌芽率，進而為培育壯芽打下基礎(chǔ)。

2.3 增殖培養(yǎng)及培養(yǎng)基優(yōu)化

由表4可知，在基本培養(yǎng)基采用1/2MS+3%蔗糖+0.7%卡拉膠的基礎(chǔ)上，添加不同濃度的NAA和IBA對杉木幼苗的影響差異顯著，杉木幼苗的增殖系數(shù)、有效芽數(shù)和平均株高均隨著NAA濃度的增加呈先增加后降低趨勢，并隨著IBA濃度的增加先增加后降低，試驗條件下以0.6 mg·L^-1NAA+0.8 mg·L^-1IBA的培養(yǎng)基效果最佳，其增殖系數(shù)達到3.76，有效芽率達到78.16%，平均株高達到2.4 cm，且芽多，莖粗壯。

由表5可以看出，基本培養(yǎng)基內(nèi)添加NAA0.6 mg·L^-1處理的增殖系數(shù)達到3.20，有效芽率達到59.69%，平均株高為2.00 cm，為最佳處理。與添加NAA0.6 mg·L^-1處理相比，添加NAA0.8 mg·L^-1處理的有效芽率和平均株高降低不顯著，但是增殖系數(shù)降低了17.81%，差異達到顯著水平。添加NAA0.4 mg·L^-1和NAA1.0 mg·L^-1處理的增殖系數(shù)、有效芽率和平均株高與添加NAA0.6 mg·L^-1的處理相比，差異均達到顯著水平?；九囵B(yǎng)基內(nèi)添加IBA0.3 mg·L^-1的效果最佳，增值系數(shù)為2.62，有效芽數(shù)為56.50%，平均株高為1.85 cm，與添加IBA0.1 mg·L^-1和0.5 mg·L^-1的處理相比，差異達到顯著水平，但0.1和0.5 mg·L^-1之間的差異不顯著。

由此可見，對于杉木增殖培養(yǎng)來講，試驗以添加NAA0.6 mg·L^-1+IBA0.3 mg·L^-1為最佳培養(yǎng)基配方。

2.4 生根培養(yǎng)及培養(yǎng)基優(yōu)化

由表6可知，杉木組培苗生根率以添加IBA0.8 mg·L^-1+IAA0.1 mg·L^-1的處理效果最佳，生根率達到82.00%，除與添加IBA0.8 mg·L^-1+IAA0.3 mg·L^-1處理差異不顯著外，與其他處理差異均達到顯著水平。平均根數(shù)以添加IBA0.8 mg·L^-1+IAA0.3 mg·L^-1處理最高，添加IBA0.4 mg·L^-1+IAA0.3 mg·L^-1處理次之，兩者之間的差異不顯著，但顯著高于其他處理。平均根長以添加IBA0.8 mg·L^-1+IAA0.3 mg·L^-1處理最佳，平均根長達到2.95 cm；以添加IBA1.2 mg·L^-1+IAA0.1 mg·L^-1處理次之，平均根長達到2.82 cm。

由表7可知，通過極差分析，影響杉木組培苗生根率、平均根數(shù)和平均根長的主次因素均為IBA>IAA。對于IBA而言，杉木組培苗生根率和平均根長均以IBA0.8 mg·L^-1處理的生根率最佳，與其他濃度相比差異達到顯著水平；平均根數(shù)以IBA0.8 mg·L^-1處理最多，IBA0.4 mg·L^-1處理次之，兩者之間的差異不顯著，但與IBA1.2 mg·L^-1處理相比，差異達到顯著水平。對于IAA而言，隨著IAA濃度的增加，杉木組培苗生根率和平均根長呈逐漸降低趨勢，并以IAA0.1 mg·L^-1處理達到最大值，IAA0.3 mg·L^-1處理次之，兩者之間的差異不顯著，但與IAA0.5 mg·L^-1處理相比，差異均達到顯著水平。杉木組培苗的平均根數(shù)以IAA0.1 mg·L^-1最少，與IAA0.3 mg·L^-1、IAA0.5 mg·L^-1處理相比，差異達到顯著水平。

由此可見，降低IAA濃度有利于提高杉木組培苗的生根率和平均根長，但卻降低了根系數(shù)量。總的來說，杉木試管內(nèi)生根的最佳理論培養(yǎng)基為在基本培養(yǎng)基中添加IBA0.8 mg·L^-1+IAA0.3 mg·L^-1，可用于杉木組培苗的生根誘導(dǎo)。

2.5 移栽基質(zhì)優(yōu)化試驗

由表8可知，杉木組培苗的成活率和株高均以泥炭土∶菜園土∶蛭石=4∶2∶1處理最高，成活率達到91.93%，與菜園土處理和泥炭土∶菜園土=2∶1處理相比，差異達到顯著水平；與泥炭土∶菜園土∶蛭石=2∶1∶1處理相比，差異不顯著。從生長情況來看，泥炭土∶菜園土∶蛭石=4∶2∶1和泥炭土∶菜園土∶蛭石=2∶1∶1處理的杉木幼苗健壯、葉色深綠，而菜園土的幼苗弱、生長慢，后期葉色偏黃。由此可見，泥炭土∶菜園土∶蛭石=4∶2∶1的基質(zhì)更適合杉木幼苗的生長。

3 結(jié)論與討論

自然條件下，植物組織培養(yǎng)階段容易帶菌導(dǎo)致組培苗污染現(xiàn)象的發(fā)生。酒精和升汞是外植體常用的消毒劑，兩者搭配使用增強了酒精的消毒殺菌效果，但因升汞較強的殺菌效果，使用后難以清洗，易引起外植體褐化^[11]。本研究結(jié)果也表明，杉木外植體的污染率隨著酒精和升汞浸泡時間的增加呈逐漸降低趨勢，但成活率也隨之降低，這與田廣玉等^[12]的研究結(jié)果相似。因此，在使用消毒劑時要根據(jù)消毒劑的優(yōu)缺點，合理搭配，試驗條件下以使用 70% 酒精浸泡 15 s用無菌水洗滌后，再用0.1%升汞浸泡消毒8 min的消毒效果最佳，此方式可避免酒精長時間對外植體的浸染傷害，也可避免升汞在外植體表面殘留過多造成外植體后期死亡。

植物組織培養(yǎng)離不開植物生長調(diào)節(jié)劑，但激素的長期大量使用會對植物產(chǎn)生傷害。比如高濃度的生長素易使植物發(fā)生愈傷化和褐化現(xiàn)象，而高濃度的分裂素容易產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象。試驗選擇1/2MS作為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑以誘導(dǎo)愈傷組織、生根培養(yǎng)、促進植物生長。（1）在初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選時，選用1/2MS作為基本培養(yǎng)基時，添加0.6 mg·L^-1的6-BA有利于提高培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果，增加培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率和萌芽率，進而為培育壯芽打下基礎(chǔ)。（2）繼代培養(yǎng)時，杉木幼苗的增殖系數(shù)、有效芽數(shù)和平均株高均隨著NAA濃度的增加呈先增加后降低趨勢，并隨著IBA濃度的增加先增加后降低，試驗條件下以0.6 mg·L^-1NAA+0.8 mg·L^-1IBA的培養(yǎng)基效果最佳，其增殖系數(shù)達到3.76，有效芽率達到78.16%，平均株高達到2.4 cm，且芽多，莖粗壯。這一試驗結(jié)果與張佳寧等^[13]的研究結(jié)論相似。（3）在杉木生根試驗中，影響杉木組培苗生根率、平均根數(shù)和平均根長的主次因素均為IBA>IAA。降低IAA濃度有利于提高杉木組培苗的生根率和平均根長，但卻降低了根系數(shù)量，這與陳煌等^[14]的研究結(jié)論一致，試驗條件下以添加IBA0.8 mg·L^-1+IAA0.1 mg·L^-1的處理效果最佳，生根率達到82.00%。

組培育苗擺脫了時間的限制，實現(xiàn)了林木種苗的周年生產(chǎn)，但組培苗的移栽成活率受自然條件的影響較大，其中移栽基質(zhì)是影響組培苗移栽成活率及生長的重要因素。前人研究認為，黃心土、菜園土因自身帶有部分細菌，影響組培苗的成活率。本試驗結(jié)果也表明，降低菜園土的比例有助于提高組培苗的成活率，促進杉木幼苗的生長，以泥炭土∶菜園土∶蛭石=4∶2∶1更適合杉木幼苗的生長，幼苗生長健壯，葉色深綠。

綜上所述，組培技術(shù)與傳統(tǒng)繁殖方式相比，具有繁殖速度快、周期短、管理方便等特點。本試驗條件下，杉木組培苗的各項指標達到了快繁育苗的要求，可進行規(guī)?；缟a(chǎn)，也可大面積進行移栽推廣。組培工廠化育苗對移栽后的管理技術(shù)要求較高^[15]，本研究僅探討了栽培基質(zhì)，對水肥管理、病蟲害防治等管理技術(shù)方面尚待進一步研究。

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