基于SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)煙草靶斑病發(fā)病菌量

李鳳巍，裴悅宏，張曉楓，王智，陳海濤，徐宸，冉茂，孫現(xiàn)超

1.西南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，重慶 400715；2.中國(guó)煙草總公司重慶市公司煙葉分公司，重慶 400020；3.中國(guó)煙草總公司重慶市公司石柱分公司，重慶 409100

煙草作為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物,其產(chǎn)品質(zhì)量受到生物與非生物脅迫等多方面的影響[1-3]．煙草葉部病害往往是直接危害煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量最主要的因素之一,常見(jiàn)的煙草葉部真菌、病毒、細(xì)菌類病害主要有煙草赤星病[4]、煙草病毒病[5]、煙草野火病[6]和煙草角斑病[7]等,這些病害的發(fā)生往往會(huì)給煙草行業(yè)帶來(lái)不可估量的經(jīng)濟(jì)損失．隨著對(duì)幾種常見(jiàn)煙草葉部病害重視的加強(qiáng)以及研究的深入,已經(jīng)篩選出有效的防治手段及綜合防控措施[8-10],并且相關(guān)的病害發(fā)生預(yù)測(cè)模型[11-13]也基本建立起來(lái)．比如,袁守超[14]建立了煙草赤星病、野火病及角斑病等3種病害的預(yù)測(cè)模型,并推測(cè)出其發(fā)病規(guī)律與流行趨勢(shì),進(jìn)一步分析出防治指標(biāo)．

煙草靶斑病自2005年在我國(guó)遼寧丹東地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)發(fā)生以來(lái)[15],在東北煙區(qū)大面積發(fā)病,隨后迅速擴(kuò)散至全國(guó)各地．近5年來(lái),云南[16]、湖南[17]、四川[18]、貴州[19]等多個(gè)西南地區(qū)的煙區(qū)均有報(bào)道煙草靶斑病的發(fā)生．煙草靶斑病發(fā)病時(shí),煙草葉片形成不規(guī)則病斑,一般形成同心輪紋,壞死部分易脫落形成穿孔[20],通常在田間相對(duì)濕度較大時(shí)容易大規(guī)模發(fā)生[21-22],導(dǎo)致對(duì)其防治比較困難．目前對(duì)于煙草靶斑病比較有效的防治措施主要為化學(xué)防治,田亮等[23]通過(guò)比較不同藥劑對(duì)煙草靶斑病的防控效果,篩選出80%波爾多液+38%吡唑醚菌酯·啶酰菌胺對(duì)煙草靶斑病防治效果較好,且藥效持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)．吳元華[24]在11種化學(xué)殺菌劑和9種生物殺菌劑中篩選出咯菌腈和丁子香酚對(duì)煙草靶斑病菌抑制作用最強(qiáng)．同時(shí),最近也有研究表明0.3%四霉素對(duì)煙草靶斑病菌的抑制效果較好,其抑制中濃度EC50達(dá)到0.04 mg/L[25]．在生物防治方面,目前對(duì)于煙草靶斑病的防治方法報(bào)道較少,莽春霞[26]、尹秀娟等[27]篩選出一種對(duì)煙草靶斑病菌具有抑制作用的生防菌灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus),其抑菌圈直徑為14 mm,抑菌率達(dá)到90.88%．近幾年,也有研究發(fā)現(xiàn)鏈霉菌KX852460 (Streptomycesstrain)[28]、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)[29]等生防菌對(duì)煙草靶斑病病原菌(Rhizoctoniasolani)具有顯著的拮抗作用．但是,目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于煙草靶斑病還沒(méi)有有效的防治方法,也沒(méi)有建立相關(guān)預(yù)測(cè)模型和形成完整的綠色防控體系．因此,十分有必要建立更快、更準(zhǔn)確及時(shí)的煙草靶斑病檢測(cè)體系,從而更有效地防治煙草靶斑病的發(fā)生,也更利于貫徹“預(yù)防為主,綠色防控”的方針．

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)相比于普通PCR具有更高的靈敏性及特異性的特點(diǎn)[30],基于這些優(yōu)點(diǎn),近年來(lái),越來(lái)越多應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)體系快速檢測(cè)植物病原菌的報(bào)道[31]．例如,劉美等[32]建立SYBR Green Ⅰ染料的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)用于檢測(cè)黃瓜綠斑駁花葉病毒．謝中玉等[33]根據(jù)鏈格孢屬ITS基因序列差異位點(diǎn),設(shè)計(jì)特異性引物,并構(gòu)建了基于SYBR Green Ⅰ煙草赤星病菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速定量檢測(cè)方法．目前,已有研究報(bào)道了基于Taqman探針的實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系用于檢測(cè)煙草靶斑病菌[34],但該方法存在檢測(cè)成本較高,不適用于煙草田間大規(guī)模病害發(fā)生的檢測(cè)等缺點(diǎn)．而基于SYBR Green Ⅰ的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)成本相對(duì)較低,并且可以實(shí)現(xiàn)更快、更精確的定量．因此,本研究針對(duì)煙草靶斑病菌建立SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系,并確定了煙草靶斑病最低發(fā)病菌量,對(duì)煙草靶斑病的快速檢測(cè)、提前防治以及降低經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義,為田間煙草靶斑病的有效檢測(cè)和及時(shí)防治提供有效依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

供試病原菌：煙草靶斑病病原菌(RhizoctoniasolaniAG-3)YC-9由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)吳元華教授饋贈(zèng),煙草赤星病病原菌(Alternariaalternata)PZh4和煙草棒孢霉葉斑病病原菌(Corynesporacassiicola) 3-2由西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物免疫與病害生態(tài)防控研究室保存．

1.1.2 試劑與引物

十六烷基三甲基溴化銨(2×CTAB),V(酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1;異丙醇、實(shí)時(shí)熒光定量SYBRPrime qPCR購(gòu)自重慶葆光生物技術(shù)有限公司;Zero Background pTOPO-Blunt Simple Cloning Kit和DN45-FastBeat土壤基因組DNA提取試劑盒(珠磨法)購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司;2×Taq Master Mix(Cat.No.∶E005-01)購(gòu)自蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司;DNA回收試劑盒Universal DNA Purification Kit和質(zhì)粒DNA提取試劑盒購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司;引物合成和測(cè)序均由北京擎科生物科技有限公司完成．

1.1.3 儀器

Q5000超微量核酸蛋白測(cè)定儀(美國(guó)QUAWELL公司);RePure-A基因擴(kuò)增儀(杭州柏恒科技有限公司);CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(百樂(lè)科技有限公司);DYY-12型電泳儀(北京六一儀器廠);凝膠電泳成像儀(基因有限公司)．

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA提取

供試菌株及煙草葉片總DNA的提?。翰捎肅TAB法提取供試菌株及煙草葉片總DNA,根據(jù)韋學(xué)鋒等[35]的方法稍做改動(dòng)．①取0.1 g葉片樣品在液氮中快速研磨成粉狀,加入1 mL 65 ℃預(yù)熱好的CTAB置于65 ℃水浴裂解45～60 min,每10 min混勻一次,于4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min;②吸取上清液700～800 μL,在上清液中加入等體積的酚∶氯仿∶異丙醇(25∶24∶1)混合液充分顛倒混勻后于4 ℃條件下12 000 r/min離心10～15 min,重復(fù)操作兩次．③取上清液500～600 μL,加入等體積的-20 ℃預(yù)冷的異丙醇,于-20 ℃放置2 h左右;④于4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min,棄上清,將剩余液體吸干,管底的沉淀物用75%的乙醇充分洗滌兩次后棄上清,放置3～5 min待乙醇揮發(fā)后,加入60 μL ddH2O溶解沉淀．提取的DNA用Q5000超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)DNA濃度,并置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

土壤樣品DNA的提取：采用DN45-FastBeat土壤基因組DNA提取試劑盒(珠磨法)提取土壤樣品DNA,提取過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)(http：//aidlab.cn/up_product/big/2018-2-13-98845451.pdf)操作．

1.2.2 特異性引物設(shè)計(jì)

利用DNAMAN Version 9軟件對(duì)供試菌株R.solaniAG-3的DNA測(cè)序結(jié)果與NCBI GenBank中的煙草赤星病菌(A.alternata)和煙草棒孢霉葉斑病菌(C.cassiicola)的rDNA-ITS基因序列進(jìn)行比對(duì),根據(jù)3種病原菌不同的ITS序列差異,利用Primer3web version 4.1.0(https：//bioinfo.ut.ee/primer3/)設(shè)計(jì)引物共3對(duì),其中獲得一對(duì)具有特異性的引物RSW1-F(5′-TGTGAACTTGTGAGACAGTTGGGG-3′)和RSW2-R(5′-CAAGGAATACCAAGGAGCGCAAG-3′)．

1.2.3 普通PCR引物特異性檢測(cè)及靈敏度檢測(cè)

將提取的供試菌株R.solaniAG-3的DNA經(jīng)超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)濃度,并按10倍梯度用ddH2O依次稀釋為100,10,1,10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6ng/μL,使用特異引物RSW1F/RSW2R進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增,50 μL常規(guī)PCR體系按推薦的反應(yīng)體系進(jìn)行(https：//www.novoprotein.com.cn/group1/M00/00/04/rBKQbGLszNiAI1DyAARWBqaNWR4981.pdf),以雙蒸水作為陰性對(duì)照,測(cè)定特異引物靈敏度．

1.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和序列測(cè)定

以1.2.1中提的煙草靶斑病菌基因組DNA為模板,用設(shè)計(jì)的煙草靶斑病菌特異性引物RSW1F/RSW2R進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增,得到276 bp左右的PCR產(chǎn)物．將PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳后膠回收,將回收片段連接到pTOPO-Blunt Simple載體上,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,挑取陽(yáng)性菌落37 ℃過(guò)夜培養(yǎng),菌檢后將含有目的DNA片段的菌液送至北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序．

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

提取含有目的DNA片段的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,以10倍梯度稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為擴(kuò)增模板,采用SYBR qPCR Master Mix推薦的反應(yīng)體系(http：//cloud.bgbiotech.com/#s/78DlXioQ)進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增．以拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)(lgCt)為橫坐標(biāo),循環(huán)閾值(Ct)為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得數(shù)據(jù)分析拷貝數(shù)與Ct值之間的關(guān)系,并建立數(shù)學(xué)模型,檢驗(yàn)相關(guān)性．

1.2.6 重慶龔灘煙區(qū)土壤及發(fā)病煙株葉片中靶斑病菌RT-qPCR檢測(cè)

重慶龔灘地區(qū)土壤采樣：對(duì)重慶龔灘煙區(qū)土壤樣品進(jìn)行取樣,每個(gè)地區(qū)設(shè)置3個(gè)取樣點(diǎn)．3個(gè)取樣點(diǎn)分散在不同的地塊上并各取3個(gè)處理,每個(gè)處理取煙草根基周邊土壤．

發(fā)病煙株葉片采樣：龔灘煙區(qū)每個(gè)地區(qū)設(shè)置3個(gè)取樣點(diǎn)．3個(gè)取樣點(diǎn)分散在不同的地塊上并各取3個(gè)處理,采集田間發(fā)病煙株中下部葉．

RT-qPCR檢測(cè)：按照1.2.1的方法提取煙草葉片樣品總DNA并進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè),反應(yīng)體系與1.2.5相同．

1.2.7 利用RT-qPCR體系檢測(cè)煙草靶斑病最低發(fā)病菌量

圖1 煙草靶斑病菌菌餅接種示意圖

靶斑病菌接種：采用菌餅接種法(圖1)．試驗(yàn)采用K326煙草葉片進(jìn)行接種,用針均勻刺傷煙草葉片,造成傷口,然后將活化15 d左右的直徑為1 cm2的靶斑菌菌餅接種在煙草葉片上,以同等大小的水瓊脂培養(yǎng)基接種健康煙草葉片為對(duì)照,設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),接種后密封放置于室溫26 ℃觀察．從0 h開(kāi)始每間隔24 h取一次樣,取兩個(gè)接種菌餅之間的葉片樣品0.1 g,同時(shí)觀察接種處發(fā)病情況并拍照記錄．RT-qPCR檢測(cè)方法同1.2.6．

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 26統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)．使用Microsoft excel 2016軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制．

2 結(jié)果與分析

2.1 普通PCR引物特異性和靈敏度的檢測(cè)

通過(guò)普通PCR技術(shù)檢測(cè)引物的特異性．PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示,引物RSW1F/RSW2R可以檢測(cè)出煙草靶斑病菌,并且煙草棒孢霉葉斑病菌、煙草赤星病菌沒(méi)有擴(kuò)增出條帶,說(shuō)明該引物特異性較好．測(cè)序結(jié)果表明該引物可以擴(kuò)增出大小為276 bp的特異性條帶(圖2)．?dāng)U增序列：TGTGAACTTGTGAGACAGTTGGGGAATTTATTTGTTATTTTTTGTAATAAAATAATAATAAGTCATTGAACCCTTCTGTCTACTCAACTTATATAAACTCAATTTATTTTAAATGAATGTAATGGATGTAACACATCTCATACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTG．進(jìn)一步對(duì)不同濃度的煙草靶斑病菌R.solaniAG-3的DNA進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增,電泳結(jié)果顯示,該引物最低能夠檢測(cè)到濃度為1×10-1ng/μL的靶斑病病原菌DNA(圖3)．

M：DL 2000 DNA marker;1～3：靶斑病菌DNA;赤星病菌DNA;棒孢霉葉斑病菌DNA;N：陰性對(duì)照(ddH2O)．圖2 煙草靶斑病菌引物特異性檢測(cè)結(jié)果

M：DL 2000 DNA marker;1～8：標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度分別為1×102 ng/μL-1,1×10 ng/μL,1×1 ng/μL,1×10-1 ng/μL,1×10-2 ng/μL,1×10-3 ng/μL,1×10-4 ng/μL和1×10-5 ng/μL;N：陰性對(duì)照(ddH2O)．圖3 靶斑病特異性引物RSW1F/RSW2R靈敏度檢測(cè)結(jié)果

2.2 RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將1.2.5中所得標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒按10倍梯度稀釋為6個(gè)濃度,每個(gè)梯度設(shè)置8個(gè)重復(fù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,計(jì)算每個(gè)梯度的Ct均值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．結(jié)果顯示,實(shí)時(shí)熒光定量PCR能夠檢測(cè)到濃度最低為1×10-3ng/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,為常規(guī)PCR靈敏度的100倍(圖4a)．此外,溶解曲線圖可以看出熔解曲線呈單一熔解峰,并且熔點(diǎn)溫度趨于一致,約為82.1 ℃,表明擴(kuò)增產(chǎn)物比較單一,引物的特異性較好并且無(wú)明顯的引物二聚體生成(圖4b)．由擴(kuò)增曲線可以看出計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.557 4x+27.74,相關(guān)系數(shù)R2為0.995 4(圖4c),由擴(kuò)增效率計(jì)算公式(E=10-1/k-1)計(jì)算出擴(kuò)增效率E約為91.03%,趨近于1,表明所得標(biāo)準(zhǔn)曲線符合要求．

圖4 引物RSW1F/RSW2R的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

圖5 K326葉片接種煙草靶斑病菌菌餅不同時(shí)間靶斑病菌含量檢測(cè)

2.3 RT-qPCR體系檢測(cè)煙草靶斑病最低發(fā)病菌量的檢測(cè)

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)接種煙草靶斑病菌菌餅24 h,48 h,72 h,96 h和120 h后兩個(gè)接種菌餅之間葉片樣品的靶斑病菌含量,實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示接種后5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的Ct值分別為20.76,20.65,20.34,17.61,15.33,對(duì)照健康葉片無(wú)Ct值,將各處理Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算靶斑病菌的相對(duì)含量,得出其煙草靶斑病菌含量分別為9.16 pg/μL,9.84 pg/μL,12.03 pg/μL,70.40 pg/μL和307.97 pg/μL．由圖5可以看出,24～72 h含菌量變化較小,沒(méi)有顯著性差異,接種處無(wú)明顯病斑出現(xiàn)．而第96 h與第24～72 h相比,靶斑病菌含量顯著上升,并且伴隨著較大病斑的出現(xiàn)．說(shuō)明在72 h時(shí),即Ct值為20.34,靶斑病菌含量為12.03 pg/μL時(shí),達(dá)到煙草靶斑病的最低發(fā)病菌量．

2.4 重慶龔灘煙區(qū)土壤和發(fā)病煙株葉片中靶斑病菌含量檢測(cè)分析

使用設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)重慶龔灘煙區(qū)土壤樣品DNA以及5～7月發(fā)病煙株的葉片樣品DNA進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)其靶斑病菌含量．實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示,5月15日、5月30日、6月15日龔灘煙區(qū)土壤RT-qPCR的擴(kuò)增Ct值分別為25.14,24.12和23.91,代入2.2所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出其煙草靶斑病菌含量分別為0.54 pg/μL,1.04 pg/μL和1.19 pg/μL(圖6)．本研究發(fā)現(xiàn)重慶龔灘煙區(qū)土壤中的靶斑病菌含量隨時(shí)間推移升高,一定程度上可以推測(cè)該地區(qū)的靶斑病菌可能通過(guò)土壤傳播到煙株上,但具體證據(jù)需進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證,但可說(shuō)明需加強(qiáng)對(duì)該地區(qū)土壤的消毒殺菌,以降低土壤中煙草靶斑病菌含量．5月15日雜草以及6月15日、6月30日、7月30日龔灘煙區(qū)發(fā)病煙株葉片RT-qPCR的擴(kuò)增Ct值分別為23.95,19.11,17.40和22.29,其煙草靶斑病菌含量分別為1.16 pg/μL,26.66 pg/μL,80.65 pg/μL和3.40 pg/μL(圖6b)．根據(jù)2.2中的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得出各時(shí)期龔灘煙區(qū)土壤樣品、發(fā)病葉片樣品中靶斑病菌含量,發(fā)現(xiàn)雜草中煙草靶斑病菌的含量較高,說(shuō)明應(yīng)當(dāng)及時(shí)清除煙田周邊雜草,以阻斷煙草靶斑病菌從煙田周邊雜草傳入煙葉的可能．同時(shí),結(jié)合2.3中已知的煙草靶斑病最低發(fā)病菌量的Ct值(20.34),龔灘煙區(qū)煙葉6月15日的煙草靶斑病菌含量接近臨界發(fā)病菌Ct值,說(shuō)明應(yīng)該在此之前對(duì)煙草靶斑病進(jìn)行預(yù)防,以避免其進(jìn)一步侵染為害其他煙株導(dǎo)致病害流行．此外,由圖6可以看出,5～6月,龔灘煙區(qū)土壤和病葉中靶斑病菌含量顯著上升．但到7月底發(fā)病葉片中含菌量顯著下降,可能是由2022年重慶7月持續(xù)高溫(>40 ℃)引起,表明高溫對(duì)靶斑病菌生長(zhǎng)有一定影響．

小寫(xiě)字母不同表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)．圖6 重慶龔灘煙區(qū)土壤樣品和發(fā)病煙株葉片樣品中靶斑病菌含量檢測(cè)結(jié)果

3 討論

煙草靶斑病自在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)以來(lái),其擴(kuò)散速度十分迅速,同時(shí)具有再侵染頻繁、危害性大等特點(diǎn)[15],一旦發(fā)病便帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失．對(duì)于煙草靶斑病的有效防治仍然主要采取化學(xué)防治的手段,然而,煙草靶斑病在田間的發(fā)病癥狀與煙草赤星病、煙草棒孢霉葉斑病等常見(jiàn)煙草葉部病害的發(fā)病癥狀極為相似,尤其是與煙草赤星病常常難以區(qū)分[36],而該3種煙草病害常用的有效藥劑以及最佳防治時(shí)期不同,無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分該3種病害往往會(huì)導(dǎo)致在化學(xué)藥劑的針對(duì)性選擇上以及準(zhǔn)確把握藥劑使用時(shí)期等方面造成困難．同時(shí),在西南地區(qū)常發(fā)的煙草葉部病害主要有煙草赤星病、煙草棒孢霉葉斑病以及煙草靶斑病,尤其是近幾年煙草靶斑病在西南多個(gè)地區(qū)暴發(fā)[37-39]．因此,開(kāi)發(fā)一種針對(duì)煙草靶斑病的特異性定量引物用于區(qū)分此3種癥狀相似的病害以及田間煙草靶斑病的快速準(zhǔn)確檢測(cè)十分重要,一旦發(fā)病便可以對(duì)癥下藥,選取有效的藥劑以及在有效的防治時(shí)期進(jìn)行防治．而對(duì)于煙草其他真菌病害,如煙草黑脛病、煙草灰霉病等,在癥狀上可以與煙草靶斑病有明顯的區(qū)分,對(duì)于藥劑選擇以及防治時(shí)期上沒(méi)有造成困難．因此,本研究針對(duì)煙草靶斑病以及與其癥狀相似的兩種常見(jiàn)的煙草葉部病害設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物RSW1F/RSW2R,結(jié)果表明該引物能夠特異性檢測(cè)煙草靶斑病菌R.solaniAG-3,能夠有效區(qū)分其與另外兩種癥狀相似的煙草真菌病害,從而可以對(duì)發(fā)病初期的煙草病害有針對(duì)性的進(jìn)行化學(xué)防治．然而,R.solani目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道的有14個(gè)融合群(AG1-13和AGBI)[19]．根據(jù)地理位置不同,煙草靶斑病的致病病原菌R.solani存在不同的菌絲融合群．目前在我國(guó)已鑒定出的煙草靶斑病病原菌主要為R.solaniAG-3融合群,主要分布于湖南[17]、湖北[38]以及貴州[39]等地區(qū),但也有少數(shù)地區(qū)如廣西、貴州等地區(qū)檢測(cè)出R.solaniAG-2、R.solaniAG-4[40]以及R.solaniAG-6[41]等融合群．因此,對(duì)于重慶龔灘地區(qū)的煙草靶斑病病原菌是否存在除R.solaniAG-3以外的融合群還需要進(jìn)一步探究．

同時(shí),煙草靶斑病菌R.solani是一種土傳真菌病害[42-43],其侵染范圍廣泛[44-46],可以侵染煙草、番茄、玉米和黃瓜等．本研究在重慶龔灘地區(qū)5～6月土壤樣品及雜草中檢測(cè)出靶斑病菌,說(shuō)明在該地區(qū)靶斑病初侵染來(lái)源主要存在于土壤和雜草中．Budge等[47]的研究表明表面淺層土壤更容易比深層土壤中檢測(cè)出R.solani,因此,可以通過(guò)深翻耕等農(nóng)藝措施來(lái)預(yù)防其侵染煙株地上部分．此外,在重慶龔灘地區(qū)5月中旬-6月中旬土壤中靶斑病菌含量逐漸增高．趙艷琴等[48]測(cè)定了遼寧丹東地區(qū)一年中土壤中靶斑病菌的動(dòng)態(tài)變化數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)在一年中該地區(qū)土壤靶斑病菌含量于6月28日達(dá)到最高值,本研究結(jié)果與其基本一致,表明5～6月為靶斑病菌在田間適宜生長(zhǎng)的時(shí)期．另外,田間5～6月葉片靶斑病菌含量變化趨勢(shì)與土壤中變化趨勢(shì)基本一致．同時(shí),葉片中6月中旬的Ct值較為接近最低發(fā)病菌量的Ct值,提示我們可以在此之前采集田間樣品檢測(cè)煙草靶斑病菌含量,在其達(dá)到最低發(fā)病菌量之前采取措施防止靶斑病的進(jìn)一步流行．因此,在該地區(qū)靶斑病的最佳防治時(shí)期為5月15日至6月15日．另一方面,7月煙草葉片中靶斑病菌含量顯著降低,說(shuō)明降雨、溫度、濕度等環(huán)境因素對(duì)該菌的生長(zhǎng)有較大的影響．

綜上所述,對(duì)于煙草靶斑病的防控可以根據(jù)建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系檢測(cè)田間煙草靶斑病菌含量,并在達(dá)到最低發(fā)病菌量之前及時(shí)利用藥劑進(jìn)行有效控制防治．此外,聶曉等[49]根據(jù)新疆澤普縣2012-2019年內(nèi)的小麥白粉病發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)和數(shù)據(jù)分析后,將往年病害發(fā)生情況與病害發(fā)生流行的關(guān)鍵氣象因子相結(jié)合,利用多元回歸分析法建立了小麥白粉病的病害預(yù)測(cè)模型．因此,對(duì)于煙草靶斑病的預(yù)防,還可以在將田間氣候預(yù)測(cè)與GIS技術(shù)等相結(jié)合從而建立預(yù)測(cè)模型等方面繼續(xù)深入探索,做到精準(zhǔn)把控田間施藥,以預(yù)防煙草靶斑病的發(fā)生與流行．

4 結(jié)論

本研究設(shè)計(jì)了一對(duì)能夠特異性檢測(cè)煙草靶斑病菌的引物RSW1F/RSW2R,該引物能夠有效區(qū)分煙草靶斑病菌、煙草赤星病菌、煙草棒孢霉葉斑病菌等重慶煙區(qū)常見(jiàn)煙草病害,同時(shí)建立了煙草靶斑病菌的實(shí)時(shí)熒光定量體系,計(jì)算出煙草靶斑病的最低發(fā)病菌量為12.03 pg/μL,并且將已建立檢測(cè)體系運(yùn)用到重慶龔灘煙區(qū)靶斑病的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)該煙區(qū)的土壤和雜草可能為煙草靶斑病菌的來(lái)源,同時(shí)確定了5月15日至6月15日為該地區(qū)預(yù)防煙草靶斑病的最佳時(shí)期,為煙草靶斑病的預(yù)報(bào)預(yù)警及科學(xué)用藥提供依據(jù)．