松杉靈芝中總?cè)频奶崛」に囇芯?/h1>
2023-11-16 10:04:34王曉明雷鈞濤
吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào) 2023年6期
楊 潺,王曉明,雷鈞濤,王 巖*
(1.長春中醫(yī)藥大學(xué),吉林 長春 130117;2.吉林市中醫(yī)院,吉林 吉林 132011;3.吉林醫(yī)藥學(xué)院,吉林 吉林 132013)
松杉靈芝(GanodermatsugaeMurr.)又稱鐵杉靈芝,屬于多孔菌科(Polyporaceae)靈芝屬真菌,是我國一種重要的靈芝資源,主要分布于黑龍江、吉林、遼寧及甘肅等地區(qū)[1]。松杉靈芝含有多種生物活性成分,主要含有多糖、三萜類和甾醇等成分[2],已被證明具有多種治療作用,其藥理作用包括抗癌、增強(qiáng)細(xì)胞免疫、保肝等[3]。其中,三萜化合物作為松杉靈芝中一類主要的活性成分,這些化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分子量大、大多具有高度氧化結(jié)構(gòu),是松杉靈芝解毒作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[4]。
目前,關(guān)于松杉靈芝提取工藝方面的研究報(bào)道還較少。因此,本實(shí)驗(yàn)以松杉靈芝內(nèi)三萜類化合物的含量為指標(biāo),采用單因素結(jié)合正交試驗(yàn)法考察松杉靈芝的最佳提取工藝,以期為松杉靈芝的進(jìn)一步合理應(yīng)用提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
DHG-9146A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);JD400-3B型電子天平(沈陽龍騰電子有限公司);UV2800S型紫外分光光度計(jì)(上海奧譜勒儀器有限公司);KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)110709-201808,購自中國食品藥品檢定研究院);松杉靈芝(松江河林業(yè)局,經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院雷鈞濤教授鑒定本品為多孔菌科(Polyporaceae)靈芝屬松杉靈芝(GanodermatsugaeMurr.)的干燥子實(shí)體;所用試劑均為分析純。
1.2 含量測定
1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
以齊墩果酸為對(duì)照品,采用香草醛-冰醋酸-高氯酸比色法繪制齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.2.2 樣品中總?cè)坪康臏y定
取濃縮的樣品溶液1 mL,用無水乙醇稀釋至15 mL,搖晃均勻,精密移取0.2 mL溶液,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法,同法操作,測定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總?cè)坪俊?/p>
1.3 單因素實(shí)驗(yàn)
1.3.1 乙醇濃度的考察
稱取5份松杉靈芝樣品,每份20 g,按1∶10的料液比,分別以50%、60%、70%、80%、90%濃度的乙醇,加熱回流提取1次,每次1 h,過濾,濾液分別減壓濃縮至100 mL。
1.3.2 料液比的考察
稱取5份松杉靈芝樣品,每份20 g,以80%的乙醇,分別加6、8、10、12、14倍的乙醇,加熱回流提取1次,每次1 h,過濾,濾液分別減壓濃縮至100 mL。
1.3.3 提取時(shí)間的考察
稱取5份松杉靈芝樣品,每份20 g,以80%的乙醇,1∶14的料液比,加熱回流提取1次,每次0.5、1、1.5、2、2.5 h,過濾,濾液分別減壓濃縮至100 mL。
1.3.4 提取次數(shù)的考察
稱取5份松杉靈芝樣品,每份20 g,以80%的乙醇,1∶14的料液比,加熱回流提取2 h,分別提取1、2、3、4、5次,過濾,濾液分別減壓濃縮至100 mL。
1.4 正交試驗(yàn)
根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)及參考文獻(xiàn)[5-7],以提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度和空白誤差項(xiàng)等4個(gè)因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì),每個(gè)因素3個(gè)水平,見表1。稱取9份松杉靈芝樣品,每份20 g,按照因素水平表中的條件進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),提取2次,測定總?cè)坪俊?/p>
表1 醇提因素水平表
2 結(jié) 果
2.1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線
精密稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品5.15 mg,用少量甲醇溶解后,定容至25 mL,即得0.206 g/L的齊墩果酸對(duì)照品溶液。精密吸取齊墩果酸對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于15 mL具塞試管中,揮干溶劑。加入新配置的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL,搖勻,于70 ℃水浴加熱15 min,取出后立即置冰浴冷卻5 min,取出,加入精密吸取的乙酸乙酯4 mL,搖勻。以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照,使用紫外可見分光光度計(jì)在546 nm波長處測定吸光度。以吸光度(x)為橫坐標(biāo)、齊墩果酸質(zhì)量(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其回歸方程為y=118.59x+6.2766,R2=0.999 4,三萜含量在20.6～103.0 μg內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。
2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.2.1 乙醇濃度的考察結(jié)果
隨著乙醇濃度的增大,三萜的含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,80%的乙醇提取的三萜含量最高,而90%的乙醇提取的三萜含量有所下降。因此,選取70%、80%、90%的3個(gè)水平濃度的乙醇進(jìn)行正交試驗(yàn)。
2.2.2 料液比的考察結(jié)果
隨著料液比的增大,三萜的含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢,14倍的乙醇提取的三萜含量最高。因此,選取10、12、14倍3個(gè)水平的乙醇進(jìn)行正交試驗(yàn)。
2.2.3 提取時(shí)間的考察結(jié)果
隨著提取時(shí)間的增加,提取的三萜的含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢,其中2 h提取的三萜含量最高,而2.5 h提取的三萜含量有所下降,可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過長導(dǎo)致部分三萜的結(jié)構(gòu)被破壞。因此,選取1、1.5、2 h的3個(gè)水平因素時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)。
2.2.4 提取次數(shù)的考察結(jié)果
當(dāng)其他條件保持相同時(shí),不同提取次數(shù)對(duì)于三萜含量的影響較小,隨著提取次數(shù)的增大,提取的三萜的含量逐漸增加,但提取2次與4次的三萜含量并無顯著性差異?？紤]到生產(chǎn)成本,松杉靈芝三萜的提取次數(shù)為2次較合適。
2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果
由表2的直觀分析可知,RA>RB>RC,說明影響松杉靈芝三萜乙醇回流提取的因素順序?yàn)?乙醇濃度>料液比>提取時(shí)間。采用SPSS 23.0進(jìn)行方差分析,見表3,由方差分析結(jié)果可知:乙醇濃度和料液比具有顯著性(P<0.05),70%乙醇濃度和1∶14料液比提取效果最佳,提取時(shí)間不具有顯著性,提取1.5 h效果最佳,同時(shí)考慮到提取效率和生產(chǎn)成本,提取時(shí)間選擇k2水平。因此,本實(shí)驗(yàn)確定松杉靈芝總?cè)频淖罴烟崛」に嚍?A1B3C2,即用14倍量的70%乙醇作提取劑,回流提取2次,每次1.5 h。
表2 正交試驗(yàn)L9(34)結(jié)果
表3 方差分析結(jié)果
2.4 提取工藝的驗(yàn)證
根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果,在最優(yōu)的提取工藝條件A1B3C2下進(jìn)行三次平行試驗(yàn),提取2次,計(jì)算總?cè)频暮?驗(yàn)證該工藝的可行性和合理性。結(jié)果表明,用14倍量的70%乙醇作提取劑,回流提取2次,每次1.5 h,總?cè)坪縍SD為1.24%,表明該工藝較為穩(wěn)定,具有簡單、可行的特點(diǎn),見表4。
表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
3 討 論
松杉靈芝對(duì)多種疾病有良好的治療效果,具有很好的開發(fā)價(jià)值,本研究在選擇含量測定方法及指標(biāo)時(shí)參考了2020版《中國藥典》中靈芝的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)[8-9],通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn),確定了松杉靈芝三萜的最佳提取工藝為:14倍量70%乙醇,回流提取2次,每次1.5 h。其中,乙醇濃度和料液比對(duì)于三萜含量的影響具有顯著性,而提取時(shí)間不具有顯著性。此外,三萜類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分子量大、大多具有高度氧化結(jié)構(gòu),在提取過程中,是否會(huì)因?yàn)闇囟茸兓瘜?dǎo)致三萜結(jié)構(gòu)和活性改變,仍需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究探討。相信隨著研究的不斷深入,松杉靈芝這一寶貴的中藥材資源將會(huì)得到更充分的利用。
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目前,關(guān)于松杉靈芝提取工藝方面的研究報(bào)道還較少。因此,本實(shí)驗(yàn)以松杉靈芝內(nèi)三萜類化合物的含量為指標(biāo),采用單因素結(jié)合正交試驗(yàn)法考察松杉靈芝的最佳提取工藝,以期為松杉靈芝的進(jìn)一步合理應(yīng)用提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
DHG-9146A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);JD400-3B型電子天平(沈陽龍騰電子有限公司);UV2800S型紫外分光光度計(jì)(上海奧譜勒儀器有限公司);KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)110709-201808,購自中國食品藥品檢定研究院);松杉靈芝(松江河林業(yè)局,經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院雷鈞濤教授鑒定本品為多孔菌科(Polyporaceae)靈芝屬松杉靈芝(GanodermatsugaeMurr.)的干燥子實(shí)體;所用試劑均為分析純。
1.2 含量測定
1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
以齊墩果酸為對(duì)照品,采用香草醛-冰醋酸-高氯酸比色法繪制齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.2.2 樣品中總?cè)坪康臏y定
取濃縮的樣品溶液1 mL,用無水乙醇稀釋至15 mL,搖晃均勻,精密移取0.2 mL溶液,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法,同法操作,測定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總?cè)坪俊?/p>
1.3 單因素實(shí)驗(yàn)
1.3.1 乙醇濃度的考察
稱取5份松杉靈芝樣品,每份20 g,按1∶10的料液比,分別以50%、60%、70%、80%、90%濃度的乙醇,加熱回流提取1次,每次1 h,過濾,濾液分別減壓濃縮至100 mL。
1.3.2 料液比的考察
稱取5份松杉靈芝樣品,每份20 g,以80%的乙醇,分別加6、8、10、12、14倍的乙醇,加熱回流提取1次,每次1 h,過濾,濾液分別減壓濃縮至100 mL。
1.3.3 提取時(shí)間的考察
稱取5份松杉靈芝樣品,每份20 g,以80%的乙醇,1∶14的料液比,加熱回流提取1次,每次0.5、1、1.5、2、2.5 h,過濾,濾液分別減壓濃縮至100 mL。
1.3.4 提取次數(shù)的考察
稱取5份松杉靈芝樣品,每份20 g,以80%的乙醇,1∶14的料液比,加熱回流提取2 h,分別提取1、2、3、4、5次,過濾,濾液分別減壓濃縮至100 mL。
1.4 正交試驗(yàn)
根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)及參考文獻(xiàn)[5-7],以提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度和空白誤差項(xiàng)等4個(gè)因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì),每個(gè)因素3個(gè)水平,見表1。稱取9份松杉靈芝樣品,每份20 g,按照因素水平表中的條件進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),提取2次,測定總?cè)坪俊?/p>
表1 醇提因素水平表
2 結(jié) 果
2.1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線
精密稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品5.15 mg,用少量甲醇溶解后,定容至25 mL,即得0.206 g/L的齊墩果酸對(duì)照品溶液。精密吸取齊墩果酸對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于15 mL具塞試管中,揮干溶劑。加入新配置的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL,搖勻,于70 ℃水浴加熱15 min,取出后立即置冰浴冷卻5 min,取出,加入精密吸取的乙酸乙酯4 mL,搖勻。以相應(yīng)試劑為空白對(duì)照,使用紫外可見分光光度計(jì)在546 nm波長處測定吸光度。以吸光度(x)為橫坐標(biāo)、齊墩果酸質(zhì)量(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其回歸方程為y=118.59x+6.2766,R2=0.999 4,三萜含量在20.6～103.0 μg內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。
2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.2.1 乙醇濃度的考察結(jié)果
隨著乙醇濃度的增大,三萜的含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,80%的乙醇提取的三萜含量最高,而90%的乙醇提取的三萜含量有所下降。因此,選取70%、80%、90%的3個(gè)水平濃度的乙醇進(jìn)行正交試驗(yàn)。
2.2.2 料液比的考察結(jié)果
隨著料液比的增大,三萜的含量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢,14倍的乙醇提取的三萜含量最高。因此,選取10、12、14倍3個(gè)水平的乙醇進(jìn)行正交試驗(yàn)。
2.2.3 提取時(shí)間的考察結(jié)果
隨著提取時(shí)間的增加,提取的三萜的含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢,其中2 h提取的三萜含量最高,而2.5 h提取的三萜含量有所下降,可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過長導(dǎo)致部分三萜的結(jié)構(gòu)被破壞。因此,選取1、1.5、2 h的3個(gè)水平因素時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)。
2.2.4 提取次數(shù)的考察結(jié)果
當(dāng)其他條件保持相同時(shí),不同提取次數(shù)對(duì)于三萜含量的影響較小,隨著提取次數(shù)的增大,提取的三萜的含量逐漸增加,但提取2次與4次的三萜含量并無顯著性差異?？紤]到生產(chǎn)成本,松杉靈芝三萜的提取次數(shù)為2次較合適。
2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果
由表2的直觀分析可知,RA>RB>RC,說明影響松杉靈芝三萜乙醇回流提取的因素順序?yàn)?乙醇濃度>料液比>提取時(shí)間。采用SPSS 23.0進(jìn)行方差分析,見表3,由方差分析結(jié)果可知:乙醇濃度和料液比具有顯著性(P<0.05),70%乙醇濃度和1∶14料液比提取效果最佳,提取時(shí)間不具有顯著性,提取1.5 h效果最佳,同時(shí)考慮到提取效率和生產(chǎn)成本,提取時(shí)間選擇k2水平。因此,本實(shí)驗(yàn)確定松杉靈芝總?cè)频淖罴烟崛」に嚍?A1B3C2,即用14倍量的70%乙醇作提取劑,回流提取2次,每次1.5 h。
表2 正交試驗(yàn)L9(34)結(jié)果
表3 方差分析結(jié)果
2.4 提取工藝的驗(yàn)證
根據(jù)正交試驗(yàn)的結(jié)果,在最優(yōu)的提取工藝條件A1B3C2下進(jìn)行三次平行試驗(yàn),提取2次,計(jì)算總?cè)频暮?驗(yàn)證該工藝的可行性和合理性。結(jié)果表明,用14倍量的70%乙醇作提取劑,回流提取2次,每次1.5 h,總?cè)坪縍SD為1.24%,表明該工藝較為穩(wěn)定,具有簡單、可行的特點(diǎn),見表4。
表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
3 討 論
松杉靈芝對(duì)多種疾病有良好的治療效果,具有很好的開發(fā)價(jià)值,本研究在選擇含量測定方法及指標(biāo)時(shí)參考了2020版《中國藥典》中靈芝的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)[8-9],通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn),確定了松杉靈芝三萜的最佳提取工藝為:14倍量70%乙醇,回流提取2次,每次1.5 h。其中,乙醇濃度和料液比對(duì)于三萜含量的影響具有顯著性,而提取時(shí)間不具有顯著性。此外,三萜類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分子量大、大多具有高度氧化結(jié)構(gòu),在提取過程中,是否會(huì)因?yàn)闇囟茸兓瘜?dǎo)致三萜結(jié)構(gòu)和活性改變,仍需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究探討。相信隨著研究的不斷深入,松杉靈芝這一寶貴的中藥材資源將會(huì)得到更充分的利用。
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