陳雷剛 任慧敏 吳遠慧 安國芝 景曉蕾 趙同心

1河北北方學院附屬第一醫(yī)院,河北省張家口市,075000;2河北北方學院,河北省張家口市,075051

瘢痕疙瘩成纖維細胞(keloid fibroblasts,KFs)增殖過度、凋亡異常,進而導致細胞外基質(zhì)大量沉積在瘢痕疙瘩形成中發(fā)揮關鍵作用,相關研究認為抑制KFs增殖、誘導KFs凋亡對預防或延緩瘢痕疙瘩的形成具有一定臨床意義［1-3］。氧化應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是在多種疾病的病理生理條件下異常激活的兩種生物學環(huán)節(jié),兩者之間存在相互影響,氧化應激激活過程中活性氧簇(ROS)大量生成,ROS通過下游信號轉(zhuǎn)導激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激中的c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路,最終引起細胞凋亡。竹紅素A(Hypocrellin A,HA)是一種從中草藥竹紅素中提取得到的光敏劑,用于癌細胞干預顯著抑制細胞增殖、促進細胞凋亡并增加ROS生成［4,5］,與紅光聯(lián)合使用顯著抑制瘢痕疙瘩的生長［6］。但HA本身是否直接影響KFs的凋亡及ROS/JNK通路在HA調(diào)控KFs凋亡中的作用尚不明確。本研究設計細胞實驗,對HA通過ROS/JNK通路促進KFs凋亡展開探索。

1 材料與方法

1.1 組織標本 瘢痕疙瘩組織標本取自6例因瘢痕疙瘩在我院接受手術切除的患者,其中男2例、女4例,年齡23～34歲、平均(27.14±5.86)歲。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準,與患者簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器 HA購自南通飛宇生物科技公司,ROS清除劑乙酰半胱氨酸(NAC )購自美國Sigma公司,CCK8細胞增殖檢測試劑盒購自上海翌圣生物科技公司,I型膠原(Col-I)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、纖維連接蛋白(FN)的檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技公司,TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技公司,丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化力(T-AOC)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所,GRP78、IRE-1、p-IRE-1、JNK、p-JNK、cleaved caspase-3、β-actin的一抗購自美國Abcam公司。細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司,凝膠成像系統(tǒng)購自上海勤翔儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 原代KFs的分離培養(yǎng) 取瘢痕疙瘩組織,用磷酸鹽緩沖液洗滌3次,用手術刀去除表皮、將剩余的真皮放入0.25%胰蛋白酶中、4℃消化10 h,再次用磷酸鹽緩沖液洗滌3次,而后將組織切成1 mm 3小塊,加入30倍量0.2% IV型膠原酶并移入50 mL離心管,37℃持續(xù)消化至組織變?yōu)樾鯛?用200目篩網(wǎng)過濾后得到單細胞懸液,1000 r/min離心10 min、收集細胞沉淀,用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸并調(diào)節(jié)細胞密度至2×106個/mL,接種在培養(yǎng)瓶中,定期換液并消化傳代,取第3代KFs進行分組處理。

1.3.2 第3代KFs的分組及處理 第3代KFs接種在培養(yǎng)板中進行分組處理,方法如下:對照組用不含藥物的培養(yǎng)基處理;不同劑量HA組分布給予含有0.125、0.25、0.5、1.0 μmol/L HA的培養(yǎng)基處理;HA+NAC組用含有1.0 μmol/L HA和1.0 mmol NAC的培養(yǎng)基處理。

1.3.3 細胞增殖的檢測 第3代KFs按照6×103個/孔接種在96孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)20 h后按照1.3.2的方法進行分組處理,24 h后每孔加入10 μL CCK8檢測液,繼續(xù)培養(yǎng)2 h,使用酶標儀檢測450 nm波長的吸光度(OD)。

1.3.4 細胞凋亡的檢測 第3代KFs按照1×104個/孔接種在24孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)20 h后按照1.3.2的方法進行分組處理,24 h后采用TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡率,按照試劑盒說明書進行操作并在顯微鏡下觀察TUNEL陽性細胞數(shù)、即凋亡細胞數(shù)以及DAP陽性細胞數(shù)、即總細胞數(shù),計算細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.3.5 細胞中Col-I、α-SMA、FN、ROS、MDA、SOD、T-AOC含量的檢測 第3代KFs按照1×105個/孔接種在12孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)20 h后按照1.3.2的方法進行分組處理,24 h后加入裂解液提取細胞蛋白,采用試劑盒檢測Col-I、α-SMA、FN、ROS、MDA、SOD、T-AOC的含量,Col-I、α-SMA、FN的檢測方法為酶聯(lián)免疫吸附法,ROS檢測方法為熒光探針DCFH-DA法,MDA檢測方法為硫代巴比妥酸法,SOD檢測方法為羥胺法,T-AOC檢測方法為二銨鹽法,均由同一名人員按照試劑盒說明書進行檢測操作。

1.3.6 細胞中蛋白表達的western blot檢測 第3代KFs按照1×105個/孔接種在12孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)20 h后按照1.3.2的方法進行分組處理,24 h后加入裂解液提取細胞蛋白,采用BCA法檢測濃度后取30 μg蛋白加入聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,而后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜,5%脫脂牛奶室溫孵育1 h,用GRP78一抗(1∶400)、IRE-1一抗(1∶1000)、p-IRE-1一抗(1∶1000)、JNK一抗(1∶800)、p-JNK一抗(1∶800)、cleaved caspase-3一抗(1∶1000)或β-actin一抗(1∶5000) 4℃孵育過夜,次日室溫孵育二抗(1∶1000)1 h。最后將硝酸纖維素膜放入凝膠成像系統(tǒng)進行電化學發(fā)光,得到蛋白條帶,以β-actin的條帶灰度值為內(nèi)參、計算GRP78、p-IRE-1、p-JNK、cleaved caspase-3的蛋白表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學處理,實驗數(shù)據(jù)為計量資料,以均數(shù)±標準差表示,組間比較采用單因素方差分析及LSD-t兩兩比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量HA及ROS清除劑對KFs增殖水平及凋亡率的影響 不同劑量HA組KFs的OD450水平低于對照組,凋亡率高于對照組(P<0.05),且HA劑量越高,KFs的OD450水平越低、凋亡率越高;HA+NAC組KFs的OD450水平高于1.0 μmol/L HA組,凋亡率低于1.0 μmol/L HA組(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組KFs增殖水平及凋亡率的比較

2.2 不同劑量HA及ROS清除劑對KFs中膠原合成的影響 不同劑量HA組KFs中Col-I、α-SMA、FN的含量均低于對照組(P<0.05)且HA劑量越高,KFs中Col-I、α-SMA、FN的含量越低;HA+NAC組KFs中Col-I、α-SMA、FN的含量高于1.0 μmol/L HA組(P<0.05)。見表2。

表2 各組KFs膠原合成的比較

2.3 不同劑量HA及ROS清除劑對KFs中氧化應激水平的影響 不同劑量HA組KFs中MDA的含量均高于對照組,SOD、T-AOC的含量低于對照組(P<0.05),且HA劑量越高,KFs中MDA的含量越高,SOD、T-AOC的含量越低;HA+NAC組KFs中MDA的含量低于1.0 μmol/L HA組,SOD、T-AOC的含量高于1.0 μmol/L HA組(P<0.05)。見表3。

表3 各組KFs氧化應激水平的比較

2.4 不同劑量HA及ROS清除劑對KFs中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激水平的影響 不同劑量HA組KFs中GRP78、p-IRE-1的表達水平均高于對照(P<0.05),且HA劑量越高,KFs中GRP78、p-IRE-1的表達水平越高;HA+NAC組KFs中GRP78、p-IRE-1的表達水平低于1.0 μmol/L HA組(P<0.05)。見表4、圖2。

圖2 各組KFs中GRP78、p-IRE-1的表達 圖3 各組KFs中p-JNK、cleaved caspase-3的表達

表4 各組KFs中GRP78、p-IRE-1表達水平的比較

2.5 不同劑量HA及ROS清除劑對KFs中ROS/JNK通路的影響 不同劑量HA組KFs中ROS含量及p-JNK、cleaved caspase-3的表達水平均高于對照(P<0.05),且HA劑量越高,KFs中ROS含量及p-JNK、cleaved caspase-3表達水平越高;HA+NAC組KFs中ROS的含量及p-JNK、cleaved caspase-3的表達水平低于1.0 μmol/L HA組(P<0.05)。見表5、圖3。

表5 各組KFs中ROS含量及p-JNK、cleaved caspase-3表達水平的比較

3 討論

KFs增殖和凋亡的異常是導致瘢痕疙瘩形成的關鍵生物學因素,越來越多的學者開始關注抑制KFs增殖、促進KFs凋亡在瘢痕疙瘩防治中的價值［7、8］。HA是從真菌竹紅菌中提取得到的天然光敏化合物,瘢痕疙瘩相關的研究證實HA與光動力療法聯(lián)合顯著抑制KFs增殖［6］,肺癌相關的研究證實單獨使用HA能夠抑制癌細胞增殖、促進癌細胞凋亡［4］,提示HA可以在不與光動力療法聯(lián)用的條件下單獨發(fā)揮調(diào)控細胞增殖及凋亡的作用。但HA單獨使用在瘢痕疙瘩中的治療價值尚不清楚。基于此,本研究在原代培養(yǎng)的KFs中初步探索了HA用于瘢痕疙瘩治療的價值。

瘢痕疙瘩形成過程中成纖維細胞的異常增殖和凋亡會引起細胞外基質(zhì)異常沉積,出現(xiàn)間質(zhì)樣改變和纖維化表現(xiàn)。相關研究報道,Col-I、α-SMA、FN是瘢痕疙瘩中異常沉積的細胞外基質(zhì)成分,多種瘢痕疙瘩的治療手段抑制KFs增殖及Col-I、α-SMA、FN的合成［9-11］。本研究中,不同劑量HA處理KFs后細胞增殖明顯減弱、凋亡率明顯增加,細胞中Col-I、α-SMA、FN的含量明顯降低,表明HA單獨使用顯著抑制KFs增殖及膠原合成、促進KFs凋亡,進而提示HA可能可以在不與紅光等光動力療法聯(lián)用的條件下發(fā)揮瘢痕疙瘩的治療價值。

細胞凋亡的調(diào)控機制復雜且與氧化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激等多個生物學環(huán)節(jié)存在相互作用。ROS在生理條件下生成量極低,在不同疾病的病理條件下以及不同藥物的刺激下ROS大量生成并造成組織損傷［12,13］。Cheng等［14］的研究顯示:瘢痕疙瘩組織中ROS的含量降低,麻藝群等的研究顯示:增加ROS生成對KFs增殖具有抑制作用。以上結(jié)果提示ROS生成減少與瘢痕疙瘩的形成有關,增加ROS生成有助于抑制瘢痕疙瘩。HA在人表皮癌細胞中的抑制增殖作用與增加ROS生成有關［5］。本研究中,不同劑量HA處理KFs后細胞中ROS含量增加,表明HA促進KFs中ROS生成,進而提示HA可能通過增加ROS生成的方式抑制KFs增殖、促進KFs凋亡。

ROS引起組織損傷、導致細胞凋亡的生物學作用與氧化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的激活及下游相關信號通路的活化有關。ROS引起氧化應激的過程中,脂質(zhì)發(fā)生過氧化并生成MDA,同時不斷消耗抗氧化物SOD、表現(xiàn)為T-AOC降低。ROS刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、導致錯誤折疊蛋白聚集、GRP78增加并激活下游內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的多條途徑,其中IRE-1途徑的激活能夠引起JNK磷酸化為p-JNK,后者能夠增加cleaved caspase-3生成并介導細胞凋亡［15,16］。在瘢痕疙瘩中,刺激氧化應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、JNK途徑的激活對KFs增殖具有抑制作用［17,18］。本研究中,不同劑量HA處理KFs后細胞中MDA含量及GRP78、p-IRE1、p-JNK、cleaved caspase-3的表達,SOD和T-AOC含量降低,表明HA在增加ROS生成的基礎上促進KFs中氧化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及下游JNK/cleaved caspase-3途徑發(fā)生激活。

為進一步認識增加ROS生成在HA抑制KFs增殖、促進KFs凋亡中的作用,初步揭示HA發(fā)揮治療價值的分子機制,本研究設計了ROS清除劑NAC處理細胞的回復實驗。在1.0 μmol/L HA處理的基礎上聯(lián)用NAC后,KFs增殖增強,凋亡及氧化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激減弱,相應ROS/JNK/cleaved caspase-3途徑的激活也受到抑制。以上回復實驗結(jié)果表明ROS清除劑NAC削弱HA對KFs增殖的抑制作用以及凋亡、氧化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、ROS/JNK通路的激活作用。

綜上所述,HA通過抑制KFs增殖、促進KFs凋亡,同時激活ROS/JNK通路介導的氧化應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激;結(jié)合回復實驗,HA對KFs增殖和凋亡的調(diào)控作用與激活ROS/JNK通路介導的氧化應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激有關。