基于HPLC、GC指紋圖譜及化學計量學的金蓮花質(zhì)量評價研究

都青鈺　高欣　李琳　施杰　和敏　于永杰　張霞

【摘要】目的：建立金蓮花藥材的高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）指紋圖譜，運用化學計量學方法，對不同產(chǎn)地金蓮花藥材的化學成分差異進行分析，為金蓮花全面質(zhì)量控制和綜合利用提供參考。方法：分別采用HPLC、GC法對27批不同產(chǎn)地的金蓮花藥材進行分析，建立相應(yīng)的色譜指紋圖譜。利用偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）對不同產(chǎn)地金蓮花藥材的成分差異進行比較。結(jié)果：金蓮花HPLC指紋圖譜有15個共有峰，指認出4個色譜峰。GC色譜指紋圖譜有8個共有峰，確認了5個色譜峰。基于PLS-DA分析及變量權(quán)重重要性排序（VIP）值，標記出9個對差異貢獻較大的成分。結(jié)論：此研究建立的HPLC及GC指紋圖譜可為金蓮花的整體質(zhì)量評價及控制提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】金蓮花；指紋圖譜；高效液相色譜（HPLC）；氣相色譜（GC）；化學計量學；偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）

【中圖分類號】R284.1【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2023）18-0049-07

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.18.zgmzmjyyzz202318010

Quality Evaluation Study on Flos Trollii Based on HPLC， GC Fingerprint and ChemometricsDU? Qingyu GAO Xin LI Lin SHI Jie HE Min YU Yongjie ZHANG Xia

1. School of Pharmacy， Ningxia Medical University， Yinchuan750004， China;

2.Ningxia Key Laboratory of Drug Development and Generic Drug Research，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004， China;

3.Key Laboratory of Ningxia Minority Medicine Modernization，Ministry of Education， Ningxia medical University，

Yinchuan 750004， China;4. Ningxia Qiyuan Pharmaceutical Co. Ltd， Yinchuan 750001， ChinaAbstract：Objective? To establish HPLC and GC fingerprints of Flos Trollii （FT） and analyze the differences of chemical components of FT from different places by chemometrics， so as to provide reference for overall quality control and comprehensive utilization of FT.Methods? HPLC and GC were used to analyze 27 batches of FT from different habitats， and the corresponding chromatographic fingerprints were established. Partial least squares-discriminant analysis （PLS-DA） was used to compare the components of FT from different habitats. Results? There were 15 common peaks in the HPLC fingerprint of FT and four peaks were identified. There were 8 common peaks in GC fingerprint， and 5 peaks were confirmed. Through PLS-DA analysis and VIP value， nine components that make great contribution to the difference are marked. Conclusion The established HPLC and GC fingerprints can provide the basis for the overall quality evaluation and control of FT.

Keywords：Flos Trollii; Fingerprint; High Performance Liquid Chromatography （HPLC）; Gas Chromatography （GC）; Chemometrics; Partial Least Squares-discriminant Analysis （PLS-DA）

金蓮花（flos trollii， FT）為毛茛科金蓮花屬植物金蓮花（Trollius Chinensis Bunge）的干燥花，味苦性寒。研究［1］表明，金蓮花具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化等藥理活性，臨床主要用于治療呼吸道感染、感冒發(fā)熱、口瘡、牙齦腫痛、疔瘡腫毒等癥。2020年版《中國藥典》收載了金蓮花的6個單方及復(fù)方品種［2］，其復(fù)方制劑2003年被確定為對非典型肺炎的不同病理環(huán)節(jié)能夠明顯改善患者癥狀的8個中成藥之一［3］， 在新冠疫情防控中，金蓮花復(fù)方制劑入選了5個省市的《新型冠狀病毒感染肺炎診療方案》。同時，金蓮花也被廣泛應(yīng)用于功能食品、化妝品及保健品領(lǐng)域。金蓮花中的化學成分類型主要有黃酮類、生物堿類、有機酸、甾醇類及揮發(fā)油類等［4］。目前對金蓮花黃酮類和酚酸類成分的藥理學研究較多，其揮發(fā)油雖然含量低，但藥理作用豐富，有較大的開發(fā)利用空間。研究［5］表明，金蓮花揮發(fā)油能夠降低卷煙煙氣的刺激性，提高香氣質(zhì)和香氣量，可作為卷煙的新型中草藥香原料。

金蓮花多分布于河北北部、內(nèi)蒙古東部、山西等寒冷地區(qū)。2010年，寧夏固原市引種成功，現(xiàn)已有近千畝的種植規(guī)模。由于不同地區(qū)氣候條件、土壤等的差異，可能導(dǎo)致不同產(chǎn)地金蓮花化學成分及產(chǎn)品質(zhì)量的差異。目前金蓮花質(zhì)量評價研究多為對一個或幾個成分的含量測定，難以全面反映其內(nèi)在質(zhì)量屬性。中藥指紋圖譜可在整體層面反映中藥內(nèi)在化學物質(zhì)信息的數(shù)據(jù)和變量，已廣泛應(yīng)用于中藥真實性鑒定、安全性評價及有效性評價等各個方面［6-9］。高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜多用于天然產(chǎn)物非揮發(fā)性成分的質(zhì)量控制及評價，而氣相色譜（GC）指紋圖譜可實現(xiàn)對揮發(fā)性成分的質(zhì)量控制［10-14］。本文將HPLC指紋圖譜技術(shù)與GC指紋圖譜技術(shù)相結(jié)合，并采用PLS-DA，從多角度綜合評價不同產(chǎn)地金蓮花的質(zhì)量，以期為金蓮花的全面質(zhì)量控制和綜合利用提供參考。

1儀器與材料

1.1儀器LA-20T型高效液相色譜儀（日本島津公司）；8890型氣相色譜儀（美國安捷倫公司）；GC Agilen7890B氣質(zhì)聯(lián)用儀（MS Agilen5977A）；XS105DU型分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ5200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FW177型中草藥粉機（中國天津泰斯特儀器有限公司）；同時蒸餾萃取裝置（安徽天長康玻實驗設(shè)備有限公司）。

1.2材料葒草素（批號：PS1326-0020）、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷（批號：PS1327-0025）、牡荊素（批號：PS0760-0025）對照品均購自成都普思生物科技股份有限公司。藜蘆酸（批號：AF8051850）購自成都埃法生物科技有限公司。十五烷（批號：12361）購自上海晶純試劑有限公司。月桂酸（批號：111774-201602）、肉豆蔻酸（批號：A15S6L2）、棕櫚酸（批號：M02D11K133109）、二十三烷（批號：Z16N9H75194）均購自上海源葉生物科技股份有限公司。色譜分析用乙腈、甲醇、二氯甲烷為色譜級，購自美國Fisher公司；其他試劑均為分析純。

1.3藥材金蓮花樣品共27個，于2020年6～8月采自3個產(chǎn)地，其中采自河北省承德市（樣品編號：S1-S8）、內(nèi)蒙古呼倫貝爾市（樣品編號：S9-S17）和寧夏固原市（樣品編號：S18-S27）的樣品數(shù)量分別為8個、9個和10個。由寧夏醫(yī)科大學張霞正高級工程師鑒定為毛茛科金蓮花屬植物金蓮花的干燥花，樣品存放于寧夏醫(yī)科大學藥學實驗中心。取所有樣品適量，等量混合均勻得QC樣品。

2方法與結(jié)果

2.1HPLC指紋圖譜

2.1.1供試樣品溶液的制備精密稱取的金蓮花藥材粉末約0.5 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 80%甲醇溶液，稱重，40 kHz超聲30 min。將錐形瓶放冷至室溫，稱定重量后用80%的甲醇補重，10000×g離心10 min，上清液作為供試樣品溶液，取10 μL進行HPLC分析。

2.1.2對照品溶液的制備分別精密稱取葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷、藜蘆酸適量，加80%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為125.00 μg/mL、268.50 μg/mL、53.13 μg/mL、11.59 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3色譜檢測條件色譜柱：EClipse Plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：272 nm。流動相：乙腈（A）-0.05%H3PO4水溶液（B），梯度洗脫分別為0～10 min，96% ～84%B；10～27 min，84%～84%B；27～28 min，84%～78%B；28～31 min，78%～78%B；31～36 min，78%～76%B；36～43 min，76%～75%B；43～52 min，75%～64%B；52～60 min，64%～0%B；60～70 min，0%B；進樣量：10 μL。

2.1.4方法學考察

2.1.4.1精密度試驗取金蓮花QC樣品，根據(jù)2.1.1項下方法制備樣品溶液，用2.1.3項下色譜分析條件，進樣6次。以峰（8）葒草苷作為參比，計算得到各共有峰的相對保留時間RRT（relative retention time，RRT）的RSD（relative standard deviation，RSD）為0.02%～0.14%，各共有峰相對峰面積RPA（relative peak area，RPA）的RSD為0.67%～2.00%，表明儀器的精密度在規(guī)定范圍之內(nèi)。

2.1.4.2穩(wěn)定性試驗取金蓮花QC樣品，按2.1.1項下方法制備供試樣品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h按2.1.3項下色譜條件進樣，用峰（8）葒草苷作為參比，得到各共有峰RRT的RSD為0.01%～0.08%，各共有峰RPA的RSD值為1.76%～2.95%，說明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4.3重復(fù)性試驗精密稱取金蓮花QC樣品，根據(jù)2.1.1項下方法平行制備6份樣品溶液，照2.1.3項下色譜分析條件進樣，用峰（8）葒草苷作為參比，各共有峰RRT的RSD為1.42%～1.81%，各共有峰RPA的RSD為0.99%～2.93%，說明方法的重復(fù)性良好。

2.1.5金蓮花HPLC指紋圖譜的構(gòu)建、相似度評價以及共有峰指認根據(jù)2.1.1項下方法，分別制備S1-S27 金蓮花樣品溶液，照2.1.3項下色譜分析條件進樣。運用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（國家藥典委員會研制，2012版）》軟件對色譜結(jié)果進行共有峰匹配。設(shè)時間寬度為0.1 min，參照圖譜為各峰信號強度較大，峰形較佳，分離度較好的S1號樣品圖譜。運用“中位數(shù)法”，多點矯正和自動匹配各個指紋圖譜的色譜峰，對照指紋圖譜（R）和27批金蓮花樣品生成的指紋圖譜共有模式。如圖1所示。

葒草苷為金蓮花的主要有效成分之一，《中國藥典》2020年版一部收載的5個金蓮花制劑均以葒草苷為含量測定的指標成分，且葒草苷在金蓮花HPLC色譜圖中峰面積較大，與相鄰峰有較好的分離效果，因此選擇葒草苷色譜峰為參照峰（S），金蓮花HPLC指紋圖譜的共有模式生成了15個共有峰。

相似度評價：計算金蓮花樣品的HPLC指紋圖譜和對照圖譜的相似度，見表1。各批金蓮花指紋圖譜的相似度除S4樣品外均大于0.900，表明來源于河北、內(nèi)蒙古、寧夏3個產(chǎn)區(qū)的金蓮花各批樣品的整體化學成分類似，樣品之間的一致性良好，本實驗建立的HPLC指紋圖譜適用于金蓮花藥材的質(zhì)量評價。各指紋峰RPA的RSD值為16.79%～77.50%，說明各樣品的共有峰差異較大。

共有峰的指認：經(jīng)比對對照品與樣品色譜峰的保留時間及光電二極管陣列檢測器（PDA）光譜圖，指認出4個色譜峰，分別是7號峰葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷，8號峰葒草苷，9號峰牡荊苷，10號峰藜蘆酸。如圖2所示。

2.2GC指紋圖譜

2.2.1供試品溶液的制備同時蒸餾萃取（simultaneous distillation extraction， SDE）可將揮發(fā)性成分的提取與溶劑萃取過程同時進行，是分析中藥揮發(fā)性成分簡便且重復(fù)性好的前處理方法。本實驗采用同時蒸餾萃取法制備供試品溶液。稱取金蓮花粗粉20 g，與350 mL純化水及40 g NaCl加入到1000 mL圓底燒瓶中并混合均勻。在另一個250 mL燒瓶中加入40 mL二氯甲烷。兩個燒瓶在電熱套中加熱至沸騰，提取回流2 h。冷卻至室溫后，將裝有二氯甲烷的燒瓶從儀器中取出，加入2 g無水硫酸鈉靜置1 h用于除去水分，上清液作為供試品溶液。

2.2.2對照品溶液的制備分別精密稱取十五烷、二十三烷、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸適量，加二氯甲烷制成混合對照品溶液，質(zhì)量濃度分別為13.18 μg/mL、37.35 μg/mL、58.23 μg/mL、49.78 μg/mL、23.65 μg/mL。

2.2.3色譜檢測條件程序升溫：初始溫度為50 ℃，保持3 min，再以2 ℃/min升至250 ℃，保持10 min；進樣口溫度為280 ℃；檢測器溫度為300 ℃；載氣流速為40.0 mL/min（恒壓模式）；分流比為2∶1，進樣量為1 μL。色譜柱：Agilent HP-5（30 m×0.32 mm×0.25 μm）毛細管柱。

2.2.4質(zhì)譜分析條件離子源：EI離子源；離子源溫度：230℃；質(zhì)量范圍：m/z 50～500 Da。四級桿溫度為150 ℃，質(zhì)譜接口溫度280 ℃，電子能量70 eV；采用全掃描模式（SCAN）。按2.2.1項下方法制備供試溶液，進樣量為1 μL。

2.2.5方法學考察

2.2.5.1精密度試驗按2.2.1項下方法制備金蓮花QC樣品供試溶液，照2.2.3項下GC分析條件，連續(xù)進樣6次，以峰4（月桂酸）作為參比，得到各共有峰RRT的RSD為0.02%～0.04%，各共有峰RPA的RSD值為0.28%～2.19%，說明儀器有良好的精密度。

2.2.5.2穩(wěn)定性試驗根據(jù)2.2.1項下方法制備金蓮花QC樣品溶液，依照2.2.3項下GC分析條件，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h進樣。以峰4作為參比，各共有峰相對保留時間RRT的RSD值為0.02%～0.06%，各共有峰RPA的RSD值為0.23%～2.65%，說明金蓮花樣品溶液在24 h內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

2.2.5.3重復(fù)性試驗依照2.2.1項下方法平行制備金蓮花QC樣品溶液6份，照2.2.3項下GC分析條件進樣，以峰（4）月桂酸作為參比，得到各共有峰RRT的RSD值為0.04%～0.10%，各共有峰RPA的RSD值為1.97%～6.25%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6GC指紋圖譜的建立及相似度評價按2.2.1項下方法，分別制備S1-S27 批金蓮花樣品GC供試品溶液，照2.2.2項下色譜分析條件進樣。選取的參照圖譜為峰形較佳，各峰信號強度較大，分離完全的S1號樣品圖譜。以與2.1.5項下 HPLC指紋圖譜相同的方法生成金蓮花GC對照指紋圖譜（R）和樣品指紋圖譜共有模式，如圖3A所示，其中R為生成的對照指紋圖譜。因為在各批金蓮花中均有月桂酸（峰4），且RRT適中且RPA較大，因此選其作為參照峰（S），共有8個共有指紋峰被標定出。

相似度評價：對27批金蓮花樣品的GC指紋圖譜運用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》軟件與對照圖譜進行相似度計算，計算結(jié)果見表2。不同產(chǎn)地金蓮花指紋圖譜相似度均＞0.950，表明來源于河北、內(nèi)蒙古、寧夏3個產(chǎn)地的金蓮花樣品整體揮發(fā)性化學成分有類似性，各批次樣品之間一致性較好。

2.2.7共有峰的指認通過比對對照品保留時間及高分辨質(zhì)譜譜庫檢索并經(jīng)對照品驗證，確認了5個色譜峰，分別是峰3為十五烷，峰4為月桂酸，峰5為肉豆蔻酸，峰6為棕櫚酸，峰7為二十三烷。如圖3B和3C1至C5所示。

2.3化學計量學模式識別分別將金蓮花HPLC和GC指紋圖譜共有峰數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件，采用PLS-DA進行分析。

2.3.1基于HPLC共有峰的不同產(chǎn)地金蓮花藥材差異比較分析基于HPLC共有峰進行PLS-DA分析，所建模型中R2X和R2Y分別為0.658和0.664，預(yù)測能力參數(shù)Q2（Cum）為0.608，均大于0.5，表明該模型預(yù)測能力較好，可用于不同產(chǎn)地金蓮花藥材的識別。PLS-DA的Scores圖顯示，27批金蓮花樣品可按產(chǎn)地分成3類（如圖4A所示）。河北、寧夏和內(nèi)蒙古所產(chǎn)金蓮花分別主要集中在第一象限、第四象限和第二、三象限。通過變量權(quán)重重要性排序（VIP）值篩選影響金蓮花產(chǎn)地差異的標志性成分，以VIP值>1為篩選標準，標記出9個貢獻較大的成分（如圖4B所示）。按影響顯著性排序，分別為峰11＞葒草苷＞峰1＞峰12＞峰6＞峰15＞峰13＞藜蘆酸＞牡荊苷，不同產(chǎn)地金蓮花的葒草苷、藜蘆酸、牡荊苷具有顯著差異。因此，可將金蓮花中VIP值>1的9個峰作為特征圖譜，葒草苷、藜蘆酸、牡荊苷作為含量測定的指標成分。

2.3.2基于GC共有峰的不同產(chǎn)地金蓮花藥材差異比較分析基于GC共有峰的PLS-DA：R2X為0.92，R2Y為0.557，Q2為0.29，表明該模型不能有效識別樣品間差異。PLS-DA的 scores 圖5顯示，27批不同產(chǎn)地金蓮花交錯分布，說明金蓮花中揮發(fā)性成分的種類及含量較相近，和產(chǎn)地無顯著性關(guān)聯(lián)。

3討論

3.1樣品制備方法的優(yōu)化超聲提取法能促使植物組織破壁或變形，更充分提取中藥有效成份，因此本研究選取超聲提取法制備樣品?？疾炝瞬煌崛∪軇ㄋ?、甲醇、乙醇），結(jié)果表明以甲醇為溶劑提取效率最高。進而比較了不同甲醇濃度（80%、60%、40%）以及不同提取時間（10 min，30 min，50 min），結(jié)果表明80%甲醇超聲提取30 min的提取效率最高，能更充分提取中藥有效成分。

3.2色譜條件的優(yōu)化樣品全波長掃描結(jié)果表明檢測波長為272 nm時，色譜峰數(shù)目較多且具有較強的信號。本研究考察了InertSustain C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters Xbeiage C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Agilent Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）等不同色譜柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用Agilent Eclipse Plus C18色譜柱進行洗脫時，金蓮花中各化學成分的分離效果較佳。本實驗在文獻中［15］流動相系統(tǒng)的基礎(chǔ)上進行了優(yōu)化，實驗發(fā)現(xiàn)采用乙腈-0.05%磷酸水為流動相時各成分分離效果理想，色譜峰峰型較好。

3.3揮發(fā)性成分提取方法的選擇提取方法對金蓮花揮發(fā)性成分的測定具有重要影響，水蒸氣蒸餾法、有機溶劑提取和SDE法是從植物樣本中提取熱穩(wěn)定揮發(fā)物的有效方法，本實驗對3種提取方法進行了比較。SDE法僅需約2.5 h，提取時間遠少于HD法和有機溶劑提取法，而且，SDE法重復(fù)性好，提取得到的成分更豐富，因此，金蓮花氣相色譜分析中揮發(fā)性成分的提取方法選擇SDE法。

綜上，本研究分別采用HPLC、GC法對27批不同產(chǎn)地的金蓮花藥材進行分析，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”建立相應(yīng)的色譜指紋圖譜。采用PLS-DA對不同產(chǎn)地金蓮花藥材的成分差異進行比較。結(jié)果顯示：金蓮花藥材HPLC指紋圖譜有15個共有峰，經(jīng)與對照品的保留時間及PDA光譜圖比對，指認出4個色譜峰，分別是葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、葒草苷、牡荊苷和藜蘆酸。GC色譜指紋圖譜有8個共有峰，通過高分辨質(zhì)譜解析并經(jīng)對照品比對，確認了5個色譜峰，分別是十五烷、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸和二十三烷。共有特征峰基本上可以反映藥品的整體質(zhì)量狀況。經(jīng)PLS-DA分析，基于金蓮花HPLC指紋圖譜共有峰可將樣品按產(chǎn)地明顯地聚集為3組，以VIP值>1為篩選標準，標記出9個對差異貢獻較大的成分。基于金蓮花GC指紋圖譜共有峰不能進行產(chǎn)地區(qū)分，金蓮花中揮發(fā)性成分的種類及含量較相近，和產(chǎn)地無顯著性關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果為金蓮花的全面質(zhì)量控制和綜合利用提供了參考。

金蓮花藥材產(chǎn)地分布于我國北方較寒冷地區(qū)，本研究主要對來源于河北，內(nèi)蒙，寧夏3個產(chǎn)地金蓮花藥材的指紋圖譜及成分差異進行了分析，還需要收集更多藥材對本研究結(jié)果加以佐證。同時，不同產(chǎn)地金蓮花植物代謝物差異的影響因素以及不同產(chǎn)地金蓮花的藥理作用效果是否有差異還需進一步研究。參考文獻

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（收稿日期：2022-12-21編輯：陶希睿）