NK細(xì)胞培養(yǎng)及殺傷前列腺癌細(xì)胞效率的研究*

王丙萍 劉彩云 高艷偉 高維實 陸相吉

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院腫瘤研究所,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017;2.北京亦科諾生物科技有限公司,北京 100176;3.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院腹部腫瘤外科,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017;4.武警內(nèi)蒙古自治區(qū)總隊醫(yī)院普外科,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是危害老年男性健康的常見癌癥之一,并且在我國呈明顯的逐年上升趨勢[1-2]。細(xì)胞免疫治療(Cell immunotherapy, CIT)是免疫治療的一種,開始于20世紀(jì)70年代,1997年被美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and drug administration,FDA)批準(zhǔn)正式納入美國藥品法規(guī)接受監(jiān)管,CIT原理是將人體內(nèi)的抗腫瘤免疫細(xì)胞采集后,經(jīng)過體外培養(yǎng)擴增后回輸患者,以增強人體免疫系統(tǒng),從而達到抗腫瘤的目的。NK細(xì)胞(Natural killer cell)是機體除T細(xì)胞之外的另一抗腫瘤利器,本身具有廣譜的腫瘤殺傷能力。NK細(xì)胞數(shù)量減少或者功能受損與各種類型癌癥的進展相關(guān)。在應(yīng)用NK細(xì)胞作為過繼性免疫治療的細(xì)胞時,NK細(xì)胞的主要來源是外周血,但外周血單個核細(xì)胞中NK細(xì)胞的數(shù)量僅占10%～15%,因此NK細(xì)胞的體外擴增培養(yǎng)十分重要。本研究建立了一種快捷、方便、高效的NK細(xì)胞體外擴增方法,將外周血中占比較少的NK細(xì)胞擴增到純度較高、數(shù)量充足,從而為NK細(xì)胞的過繼性免疫治療奠定基礎(chǔ)。通過NK細(xì)胞對3種PCa細(xì)胞系LNCaP、DU145、PC3殺傷率的研究,鑒定其用于后期治療PCa的可行性,為應(yīng)用NK細(xì)胞過繼回輸治療PCa的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 PCa細(xì)胞株P(guān)C3、LNCaP、DU145購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所;VIVOTM15培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)、胰酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)(美國Gibco公司);IL-2、IL-7、IL-15、IL-18、IL-21、OKT3(美國R&D公司);抗人CD16單克隆抗體(中國北京同立海源生物科技有限公司);Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(中國TBDTM公司);熒光標(biāo)記單克隆抗體:CD3-FITC、CD56-PE、鼠抗人IgG-FITC(美國BD公司);CCK8試劑盒(中國博士德生物公司)。

1.2 實驗儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱及生物安全柜(Thermo,美國);倒置熒光顯微鏡(Leica,德國);FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD,美國);高速離心機(Eppendorf,德國);超凈工作臺(蘇州泰安空氣技術(shù)有限責(zé)任公司,中國);ELx808吸收光酶標(biāo)儀(Biotec,美國)。

1.3 方法

1.3.1 PCa細(xì)胞株的培養(yǎng) PCa細(xì)胞株P(guān)C3的培養(yǎng)液為90% DMEM-F12 +10% FBS;LNCaP的培養(yǎng)液為90% RPMI-1640+10% FBS;DU145的培養(yǎng)液為90% DMEM高糖+10% FBS。從液氮罐取出需要解凍的細(xì)胞,立即放入37 ℃水浴鍋中,快速搖動,使凍存的細(xì)胞盡量在1 min內(nèi)融化。將凍存管用酒精消毒后迅速移入超凈工作臺。用移液器將細(xì)胞液移入1.5 mL管中,1 500 rpm/min離心5 min,棄液,加入1 mL培養(yǎng)液輕輕懸浮細(xì)胞,細(xì)胞計數(shù)板計數(shù),按細(xì)胞數(shù)1×106個/瓶的數(shù)量接種在T25的培養(yǎng)瓶中,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁90%左右傳代培養(yǎng),0.25%胰蛋白酶消化的時間分別是LNCaP、DU145為1 min,PC3為3 min。

1.3.2 外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)分離 Ficoll密度梯度離心法分離PBMCs:使用肝素鈉采血管抽取靜脈血15 mL,Ficoll與血液體積比為1∶2,用移液管緩慢地在Ficoll上層加入血液;在水平轉(zhuǎn)頭離心機中離心(22 ℃,800 g,15 min,升速5,降速4);離心結(jié)束后,在不擾動白膜層的情況下,用注射器吸出血漿層,轉(zhuǎn)移至1支15 mL離心管,將血漿管置于56 ℃水浴鍋內(nèi)保持30 min,之后置于4 ℃冰箱內(nèi)10 min進行冷卻,離心(1 500 g,5 min,22 ℃,升速9,降速9)后轉(zhuǎn)移上清至1支新的15 mL離心管,保存于4 ℃?zhèn)溆?用巴氏吸管將白膜層仔細(xì)移出,移到另1支15 mL離心管,加入PBS至15 mL,吹打清洗,上離心機后(22 ℃,600 g,7 min,升速9,降速7),棄上清液,用2 mL VIVOTM15培養(yǎng)基重懸PBMCs細(xì)胞,顯微計數(shù),取樣進行流式檢測。

1.3.3 NK細(xì)胞的誘導(dǎo)擴增 ①Day0接種:調(diào)整PBMCs細(xì)胞密度為1.5 M/mL, 加入自體血清10%,IL-2 1 000 IU/mL,IL-7 10 ng/mL,IL-15 50 ng/mL,IL-18 10 ng/mL,IL-21 50 ng/mL,OKT3 10 ng/mL,Anti-CD16 10 ng/mL,90% VIVOTM15培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,細(xì)胞接種密度≤1.5 M/mL,密度過大影響NK生長,放入37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。②Day3補液:細(xì)胞計數(shù),根據(jù)細(xì)胞數(shù)量補充培養(yǎng)液,補液調(diào)節(jié)細(xì)胞的密度為1.0 M/mL;培養(yǎng)基=90% VIVOTM15培養(yǎng)基+自體血漿10%+IL-2 1 000 IU/mL,如果細(xì)胞團較小,或者無細(xì)胞團,本次不計數(shù),不晃動培養(yǎng)瓶,直接補充原體積1/2培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。③Day5補液:細(xì)胞計數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為1.0 M/mL,培養(yǎng)基=90% VIVOTM15培養(yǎng)基+自體血清10%+IL-2 1 000 IU/mL)。④Day7～Day14補液:每次補液調(diào)整細(xì)胞密度為0.5～1.0 M/mL, 自體血漿10%,加入IL-2 1 000 IU/mL,培養(yǎng)過程中細(xì)胞密度不可超過2.0 M/mL。⑤Day14收獲:流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果,合格后收獲細(xì)胞。

1.3.4 流式細(xì)胞檢測 免疫熒光標(biāo)記法進行流式細(xì)胞分析,取NK細(xì)胞1 mL,PBS洗滌,1 500 rpm/min離心5 min,棄液,加入50 uL PBS輕輕懸浮細(xì)胞20 μL CD3-FITC和20 uL CD56-PE,4 ℃避光保存30 min。PBS洗滌后流式細(xì)胞儀分析檢測,用異硫氰酸(FITC)標(biāo)記IgG作為陰性對照,根據(jù)流式細(xì)胞分析圖中 CD3-CD56+的百分比,確定NK細(xì)胞所占比例。

1.3.5 CCK-8法檢測殺傷效率 以NK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞,靶細(xì)胞分別為PCa細(xì)胞株LNCaP、DU145、PC3。將3種靶細(xì)胞以5×103個/孔 的數(shù)量分別接種于96孔板中,于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后,輕輕吸除培養(yǎng)液。按效靶比0.1∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1的比例分別加入效應(yīng)細(xì)胞,每孔200 μL培養(yǎng)液,同時設(shè)置單獨靶細(xì)胞孔和每種比例的單獨效應(yīng)細(xì)胞孔,每個比例3個復(fù)孔。共同培養(yǎng)24 h后,加入CCK8試劑20 μL/孔,放于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中,孵育3.5 h后用酶標(biāo)儀測定450 nm波長的OD值,以此方法檢測NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性,公式如下:殺傷率(%)=[1-(實驗組OD值-單獨效應(yīng)細(xì)胞OD值)/單獨靶細(xì)胞組OD值]×100%。

2 結(jié)果

2.1 NK細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果 健康人外周血分離PBMCs后,經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)擴增NK細(xì)胞。第0天為散落的顆粒狀細(xì)胞(圖1A),3～4 d后聚集成團,出現(xiàn)細(xì)胞集落(圖1B),培養(yǎng)10～14 d后,細(xì)胞重新分散為單個細(xì)胞(圖1C)。經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定CD3-CD56+細(xì)胞(圖1D～F),外周血中占比較少的NK細(xì)胞(10.97±3.28)%,擴增到占比(83.20±8.54)%以上,細(xì)胞總數(shù)擴增倍數(shù)為(251.66±19.05)倍,NK細(xì)胞擴增倍數(shù)為(1 940.17±402.22)倍,見圖1G～I。

圖1 NK細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果

2.2 NK細(xì)胞毒活性的檢測 以NK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞,靶細(xì)胞分別為PCa細(xì)胞株LNCaP、DU145、PC3,在不同效靶比的情況下(0.1∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1),加入CCK8 試劑,孵育3.5 h后,用酶標(biāo)儀測定450 nm波長OD值的方法檢測NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性(圖2)。通過公式分別計算不同效靶比下NK細(xì)胞對靶細(xì)胞LNCaP、DU145、PC3的殺傷率,結(jié)果表明(圖3),NK細(xì)胞對靶細(xì)胞LNCaP在效靶比為1∶1時殺傷率最高(92.03±9.95)%,與效靶比為0.5∶1、2∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1的實驗組相比,各實驗組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但與效靶比0.1∶1實驗組相比差異顯著(P<0.05)(表1～2);NK細(xì)胞對靶細(xì)胞DU145在效靶比為10∶1時殺傷率最高(72.40±8.30)%,與效靶比為5∶1的實驗組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但與其它實驗組相比差異顯著(P<0.05)(表1、3);NK細(xì)胞對靶細(xì)胞PC3的殺傷率在除了效靶比為0.1∶1、0.5∶1的實驗組外,其余各實驗組的殺傷率均為負(fù)數(shù),并且各實驗組間差異顯著(P<0.05)(表1、4),說明NK細(xì)胞對前列腺癌PC3細(xì)胞株沒有殺傷效果;并且隨著效靶比逐步增高,其負(fù)數(shù)值越大,說明NK細(xì)胞對其有促進生長作用。

表1 NK細(xì)胞對靶細(xì)胞LNCaP、DU145、PC3的殺傷率

表2 NK細(xì)胞在不同效靶比時對LNCaP靶細(xì)胞的殺傷率分組

表3 NK細(xì)胞在不同效靶比時對DU145靶細(xì)胞的殺傷率分組

表4 NK細(xì)胞在不同效靶比時對PC3靶細(xì)胞的殺傷率分組

圖2 效應(yīng)細(xì)胞NK對靶細(xì)胞LNCaP、DU145、PC3在效靶比為10∶1時的殺傷圖

圖3 NK細(xì)胞對靶細(xì)胞LNCaP、DU145、PC3的殺傷率

3 討論

PCa是目前全世界男性中最常見的惡性腫瘤之一,近年來死亡人數(shù)在持續(xù)增加[3]。在我國,PCa發(fā)病率近年來已出現(xiàn)逐步升高趨勢[4],并且PCa發(fā)病隱匿,導(dǎo)致大多數(shù)人發(fā)病時已處于癌癥晚期[5-6]。目前對于PCa的治療手段主要包括手術(shù)治療、內(nèi)分泌治療、放療以及化療[7-8]。而對于晚期和轉(zhuǎn)移性的PCa患者,雄激素剝奪治療是其主要治療手段,但由于其副作用嚴(yán)重、發(fā)生概率高,且疾病進展后,患者將失去所有現(xiàn)有治療手段對生存期的收益。因此,對于這部分PCa患者急需開發(fā)出新的治療手段,以提高其生活質(zhì)量、延長生存期。

NK細(xì)胞是大顆粒淋巴細(xì)胞,約占人體外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)的10%左右[9]。NK細(xì)胞參與天然免疫和適應(yīng)性免疫,是先天免疫系統(tǒng)中最具殺傷性的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞,能夠介導(dǎo)強大的抗病毒和抗腫瘤作用[10]。NK細(xì)胞是除T細(xì)胞之外的機體抗腫瘤的另一重要利器,其本身具有廣譜抗腫瘤的作用,同時還具有強大的間接增強T細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用,是T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤功能的基礎(chǔ)[11]。

有研究表明,NK細(xì)胞過繼性回輸在晚期非小細(xì)胞肺癌的治療中取得了令人滿意的效果[12]。免疫檢查點抑制劑與NK細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用,在治療白血病和非小細(xì)胞肺癌患者時是安全、有效且具有生存益處的[13]。與T細(xì)胞相比,NK細(xì)胞的過繼性回輸具有耐受性良好,神經(jīng)毒性、細(xì)胞因子釋放綜合征(Cytokine release syndrome,CRS)和移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease GVHD)等嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生率大大降低;同種異體NK細(xì)胞的回輸還能避免或降低殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(Killer-cell immunoglobulin-like receptors,KIRs)介導(dǎo)的抑制性信號,從而發(fā)揮更好的抗腫瘤作用[14-16]。

本研究建立了一種NK細(xì)胞體外誘導(dǎo)擴增的方法,將外周血中占比較少的NK細(xì)胞(10.97±3.28)%,擴增到占比(83.20±8.54)%以上,細(xì)胞總數(shù)擴增倍數(shù)為(251.66±19.05)倍,NK細(xì)胞擴增倍數(shù)為(1 940.17±402.22)倍。高效的NK細(xì)胞體外擴增方法的成功建立為NK細(xì)胞的過繼性免疫治療的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

LNCap細(xì)胞系保留了PCa腫瘤細(xì)胞學(xué)及其早期分化功能的特征,代表著早期雄激素依賴性的PCa的顯著特征。LNCap細(xì)胞傾向分泌總前列腺特異性抗原(tPSA),而升高的tPSA提示為雄激素依賴性和早期腫瘤[17]。DU145細(xì)胞系分化程度低,為雄激素非依賴的PCa細(xì)胞,具有強大的轉(zhuǎn)移潛能,缺乏內(nèi)源性的雄激素受體的表達[18]。DU145以分泌游離前列腺特異性抗原(fPSA)為主,而升高的fPSA應(yīng)警惕雄激素非依賴性腫瘤的存在[19]。PC3細(xì)胞系分化程度低,為雄激素非依賴性PCa細(xì)胞,不含有內(nèi)源性的雄激素受體,具有中等強度的轉(zhuǎn)移潛能,被廣泛用于雄激素抵抗型的PCa的研究[20]。本研究結(jié)果顯示效應(yīng)細(xì)胞NK細(xì)胞對3種靶細(xì)胞的殺傷率差異極顯著(P<0.01),殺傷效率為由高到低分別為LNCaP細(xì)胞、DU145細(xì)胞、PC3細(xì)胞;并且對于PC3細(xì)胞,隨著效靶比的增高,不但沒有殺傷作用,反而促進其生長(殺傷效率為負(fù)數(shù))。本研究通過對以往研究資料的梳理,發(fā)現(xiàn)在生物學(xué)特性方面[18],PC3細(xì)胞、DU145細(xì)胞是激素抵抗性前列腺癌(Castration resistant Pros-tate Cancer,CRPC),而LNCaP細(xì)胞是激素敏感性前列腺癌(Metastatic hormone-sensitive prostate cancerm,mHSPC),為什么NK細(xì)胞對LNCaP的殺傷效果好,而對PC3細(xì)胞反而無殺傷力?甚至促進其生長?可能的機制是NK細(xì)胞對mHSPC殺傷效果好而對于CRPC殺傷效果差甚至起到反作用。PC3與DU145均為低分化、雄激素非依賴的PCa細(xì)胞,均具有轉(zhuǎn)移潛能且缺乏內(nèi)源性的雄激素受體的表達,均同時表達細(xì)胞生長因子CK5和CK8/18;而PC3與LN-CaP均表現(xiàn)為上皮細(xì)胞特性、高表達E-cadherin、不表達Vimentin。因此,除PC3細(xì)胞不表達野生型P53蛋白,而DU145和LNCaP細(xì)胞均可表達野生型P53蛋白外,并沒有發(fā)現(xiàn)PC3細(xì)胞系與另外兩株P(guān)Ca細(xì)胞系的不同之處。然而,P53基因是人體的抑癌基因之一,其突變會導(dǎo)致原有抑癌功能的喪失,同時獲得新的致癌功能;有研究證明表達野生型P53基因的腫瘤細(xì)胞對放、化療的敏感性強于不表達野生型P53基因的腫瘤細(xì)胞[21]。這說明本研究中“NK細(xì)胞促進PC3細(xì)胞系生長”的結(jié)果,可能是由PC3細(xì)胞系不表達野生型P53蛋白引起的;也可能是由PC3細(xì)胞系的特殊性導(dǎo)致的,而這種“特殊性”在目前的研究資料中并沒有呈現(xiàn)出來,因此需要后續(xù)進行深入研究探索其作用機制。本研究的結(jié)果為腫瘤免疫逃逸的研究提供了可作為目標(biāo)的研究細(xì)胞以及研究方向,為應(yīng)用NK細(xì)胞過繼性回輸治療前列腺癌的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

采用細(xì)胞因子誘導(dǎo)擴增PBMCs的方法能夠獲得純度較高、數(shù)量足夠的NK細(xì)胞,為NK細(xì)胞的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ);NK細(xì)胞對3種PCa細(xì)胞系的殺傷率差異極顯著,為后續(xù)進行深入研究探索原因及作用機制提供了方向。