劉俊飛，楊曉娟，潘根，鄭建樹，黃思齊*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南長沙 410221；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所，廣東深圳 518100)

大麻(Cannabis sativaL.)是大麻科(Cannabinaceae)大麻屬(Cannabis)一年生植物，別名火麻、漢麻、線麻等[1]。工業(yè)大麻是人類栽培利用最早的古老作物之一，原產(chǎn)于中亞和東亞，分布于世界各地，在我國有著悠久的栽培史，也是具有高附加值的特種經(jīng)濟(jì)作物。其種子、纖維和花葉中的天然活性成分被廣泛應(yīng)用于食品、紡織、材料、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域[2]。

目前，工業(yè)大麻的遺傳轉(zhuǎn)化體系不穩(wěn)定、轉(zhuǎn)化效率低，這制約了對其抗逆性、基因功能驗證的研究。病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)是一種不依賴轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基因功能缺失研究方法[3]。轉(zhuǎn)基因法研究基因功能不僅試驗周期長、成本高且需要遺傳轉(zhuǎn)化，相比于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，VIGS 技術(shù)具有沉默效率高、周期短、操作簡單、經(jīng)濟(jì)實惠等優(yōu)點，而且不需要事先知道并克隆基因全長，也無須建立遺傳轉(zhuǎn)化體系，只需要一段300～500 bp 的基因片段就能快速獲得表型，進(jìn)行基因功能的驗證[4]，其應(yīng)用范圍也更加廣泛，被越來越多地應(yīng)用于不同作物的基因功能研究中。

VIGS 是利用病毒載體攜帶植物目的基因片段，通過各種方式侵染植物，重組病毒在植物中復(fù)制產(chǎn)生雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)，在植物自身防衛(wèi)反應(yīng)轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post transcriptional gene silencing，PTGS)的機(jī)制作用下，dsRNA 進(jìn)一步產(chǎn)生siRNA(small interference RNA，siRNA)，該產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)與其具有同源性的植物內(nèi)源目的基因mRNA 的降解，根據(jù)表型變異來進(jìn)行基因功能分析，實現(xiàn)植物基因功能的快速鑒定[5]。VIGS體系不僅在煙草和擬南芥等模式植物上成功建立，而且也廣泛應(yīng)用于木薯[6]、蘋果[7]、玉米[8]、棉花[9]、葡萄[10]等作物中。煙草脆裂病毒(Tobacco Rattle Virus，TRV)具有基因組較小、可以侵染植物生長點、不產(chǎn)生典型病毒性狀、便于改造等優(yōu)點，是目前在植物中應(yīng)用最廣泛、效果最好的VIGS 病毒載體[11]，對包括煙草[12]、辣椒[13]等在內(nèi)的植物均有較好的侵染效果。

目前已有在工業(yè)大麻中構(gòu)建VIGS體系的相關(guān)報道，其中采用了棉花皺葉病毒(Cotton leaf crumple virus，CLCrV)作為載體，在侵染試驗中，嘗試了3 種不同農(nóng)桿菌菌株LBA4404、GV3101 和AGL1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有使用AGL1 轉(zhuǎn)化的幼苗表現(xiàn)出了預(yù)期的表型效果[14]。本研究以煙草脆裂病毒(TRV)為基礎(chǔ)研制的VIGS 載體，其TRV 介導(dǎo)的VIGS 技術(shù)具有沉默株率高、病毒癥狀溫和、沉默持續(xù)性強(qiáng)等優(yōu)點，但在不同宿主植物中，其沉默效率和成功率均有一定的差別[15]。研究顯示，VIGS 系統(tǒng)的沉默株率受多種因素的影響。第一，插入基因序列與靶基因序列的同源性越高，其沉默效率就越高[16]。第二，基因片段的長度、方向和折疊方式對沉默的效果也有一定的影響。有研究[17]顯示，在病毒載體中，基因片段的長度存在一個有效的區(qū)間，其最佳長度為200～350 bp。第三，環(huán)境因子對病毒載體的復(fù)制有一定的影響，沉默后的植物生長環(huán)境對沉默載體的沉默效果也有明顯的影響。研究[18]顯示，當(dāng)培養(yǎng)溫度提高時，VIGS 病毒的效果會明顯減弱。第四，VIGS 的沉默株率受接種方式的影響，應(yīng)針對不同的植物選擇最佳的接種方式。目前的接種方式有:注射法[19]、灌根法[20]和真空浸潤法[21]。VIGS 技術(shù)雖得到了廣泛的應(yīng)用，但工業(yè)大麻植物的再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系尚不完善，且工業(yè)大麻VIGS 沉默株率和沉默效率存在一定的差別。

本研究以工業(yè)大麻品種云麻7 號為材料，以工業(yè)大麻八氫番茄紅素脫氫酶基因為報告基因(CsPDS)，利用TRV 介導(dǎo)的VIGS 技術(shù)沉默工業(yè)大麻CsPDS基因，當(dāng)出現(xiàn)植株白化現(xiàn)象即可表明PDS基因沉默，配合通過實時熒光定量PCR 檢測，驗證基因表達(dá)量沉默，在此基礎(chǔ)上，研究侵染時苗齡、不同注射方法、不同工作液OD值、不同工作液菌液比例、不同PDS片段、不同農(nóng)桿菌、侵染后不同生長溫度對工業(yè)大麻基因沉默株率的影響，以期建立并優(yōu)化出工業(yè)大麻最適的VIGS 沉默條件，為后續(xù)工業(yè)大麻的興趣基因功能研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

云麻7 號種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所原一年生麻類作物遺傳育種團(tuán)隊提供。將云麻7號種子用4% NaClO 滅菌消毒10 min，用無菌去離子水沖洗，于培養(yǎng)箱中萌發(fā)2 d。將發(fā)芽2 d 的幼苗轉(zhuǎn)移至m(營養(yǎng)土)∶m(蛭石)＝3∶1 的土壤中。幼苗在晝夜溫度為24 ℃/16 ℃，光周期為16 h/8 h(明/暗)，相對濕度為60%，光強(qiáng)度為700 μmol/m2的培養(yǎng)箱中生長，一周齡后用于試驗。

pTRV 病毒載體購自長沙天楚生物公司；大腸桿菌(Escherichia coli)菌株為DH5α，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株為GV3101、EHA105、AGL1。

1.2 病毒載體的構(gòu)建

已知的工業(yè)大麻CsPDS全長1728 bp，從中選擇一個300 bp 的片段，并利用同源重組方法將該片段插入pTRV2 載體中。在篩選過程中，選擇抗卡那霉素(Kanamycin)作為篩選基因，同時選擇EcoR1 和BamH1 作為酶切位點。

首先將工業(yè)大麻CsPDS基因的DNA 提取出來，并使用適當(dāng)?shù)囊飻U(kuò)增出300 bp 的CsPDS基因片段。接下來，準(zhǔn)備pTRV2 載體，并通過EcoR1 和BamH1 酶對PCR 產(chǎn)物和pTRV2 載體進(jìn)行酶切。這一過程會生成互補(bǔ)的黏性末端，然后進(jìn)行同源重組，將回收的目標(biāo)片段與pTRV2 載體連接，形成重組產(chǎn)物。最后，將重組產(chǎn)物導(dǎo)入適當(dāng)?shù)募?xì)菌宿主中，進(jìn)行轉(zhuǎn)化過程，使其擴(kuò)增。最終，利用抗生素篩選確認(rèn)帶有目標(biāo)插入片段的細(xì)菌克隆。

1.3 侵染液的制備

將經(jīng)過正確克隆和測序的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中(包括GV3101、EHA105 和AGL1 菌株)。在含有卡那霉素(Kan 50 mg/mL)和利福平(Rif 100 mg/mL)雙重抗性的LB 固體培養(yǎng)基上挑選單個克隆，并使用10 mL 含有卡那霉素和利福平兩種抗性的LB 液體培養(yǎng)基來活化農(nóng)桿菌。

當(dāng)菌液OD600＝1.0 后，在4000 r/min 的條件下，室溫離心10 min 收集菌液。將收獲的菌塊用10 mmol/L 的MgCl2懸浮至指定濃度(OD600＝0.5/1.0)，確保懸濁液中含有10 mmol/L 的MES-KOH和100 μmol/L 的Acetosyringone(乙酰丁香酮)。將懸濁液在室溫下黑暗環(huán)境靜置3～6 h，即可得到侵染工作液。

侵染時試驗組為TRV1 空載體工作液與TRV2 工作載體工作液按1∶1 的體積比進(jìn)行混合，同時設(shè)置TRV1 與TRV2 空載體對照。

1.4 沉默體系優(yōu)化探索

1.4.1 侵染方法的探索

選擇1 周齡的云麻7 號進(jìn)行葉背注射法試驗。葉背注射法是使用去針頭的1 mL 一次性注射器，將含有PDS基因的病毒載體侵染液(農(nóng)桿菌菌種為GV3101、工作液濃度OD600＝0.8、接種后溫度24 ℃)通過去針注射器壓迫的方式將混合液注入試驗材料的第一片真葉。同時，在本試驗中還嘗試了真空滲透法進(jìn)行侵染，具體步驟為將試驗材料的真葉完全浸沒于含有PDS基因的病毒載體的工作液中，然后在真空壓強(qiáng)為0.07 MPa 的條件下進(jìn)行真空處理，處理時間分別設(shè)置為5、10、15 min。

1.4.2 高效PDS片段的探索

將工業(yè)大麻PDS基因的CDS 序列輸入VIGS 預(yù)測網(wǎng)站(https:/ /vigs.solgenomics.net/)，并以擬南芥、川桑和甜瓜作為模板植物，選擇3 個大小為300 bp 的片段構(gòu)建載體TRV2::PDS1、TRV2::PDS2、TRV2::PDS3。其引物分別為:PDS1F:GTGAGTAAGGTTACCGAATTCCTGTATGCCCATAGT；PDS1R:AGGTGATCATATGTGCTCGGTACCGGATCC；PDS2F:GTGAGTAAGGTTACCGAATTCTTTGGCTTTTGGGTCT；PDS2R:TGGACGAGGAGAGCCCTCGGTACCGGATCC；PDS3F:GTGAGTAAGGTTACCGAATTCTCTGCCAGCTCCCTT；PDS3R:CCATGCTTCTCCTGACTCGGTACCGGATCC(定量為采用葉背注射法，農(nóng)桿菌菌株為GV3101，接種后在24 ℃條件下進(jìn)行，工作液濃度設(shè)定為OD600＝0.8。)

1.4.3 高效工作液濃度的探索

TRV 作為載體的VIGS 工作液由TRV1 空載體菌液和搭載目的基因的TRV2 載體菌液混合而成，工作液OD600的數(shù)值對農(nóng)桿菌侵染有重要的影響。本研究采用葉背注射法，選擇工業(yè)大麻PDS基因的960～1259 bp 片段作為目標(biāo)片段。農(nóng)桿菌菌株為GV3101，在接種后保持溫度為24 ℃。通過調(diào)節(jié)工作液的濃度來探索不同OD600值(包括0.5 和1.0)下VIGS 對PDS基因沉默效果的影響。

1.4.4 高效農(nóng)桿菌菌種的探索

采用葉背注射法將攜帶pTRV2::CsPDS1 的農(nóng)桿菌菌株GV3101、EHA105 和AGL1 分別用于侵染工業(yè)大麻的第一片真葉。定量試驗中，選擇工業(yè)大麻PDS基因的960～1259 bp 片段作為目標(biāo)區(qū)域，工作液的濃度設(shè)定為OD600＝1.0，接種后保持溫度為24 ℃。

1.4.5 侵染苗齡的探索

將1 周齡和3 周齡的云麻一號葉片使用葉背注射法進(jìn)行注射。1 周齡葉片較厚且柔軟，易于注射；3 周齡葉片變薄且堅硬，難以進(jìn)行注射。

1.5 數(shù)據(jù)處理

以白化植株出現(xiàn)的百分率標(biāo)記為VIGS 的沉默株率，計算方法為:植株沉默株率＝(白化株數(shù)/轉(zhuǎn)化總株數(shù))×100%。

1.6 侵染后白化基因表達(dá)量變化

選擇出現(xiàn)白化表型的工業(yè)大麻植株，取其第一對真葉作為注射葉片(機(jī)械損傷)。隨后，分別采集第二對和第三對真葉進(jìn)行取樣。使用預(yù)冷的剪刀迅速剪下葉片，并將其放入液氮中進(jìn)行冷凍處理，隨后儲存在-80 ℃冰箱備用。接下來，采用Trizol 方法提取RNA，并使用HisScript III RT SuperMix for qPCR(南京諾維贊生物公司)將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。最后，利用實時熒光定量PCR(RTqPCR)檢測目標(biāo)基因的表達(dá)情況。RT-qPCR 引物為F:GCCCCAGACAAAGATCTCCT，R:AAATTCTCTGACCCCGAGCA；工業(yè)大麻內(nèi)參基因ACTIN 為F:CCAATAGCCTTGCATTCCAT，R:TCGATTGGAAAGCCGAATAC。

2 結(jié)果與分析

2.1 工業(yè)大麻沉默體系優(yōu)化

由圖1 可以看出，PDS基因沉默后，植株都出現(xiàn)了不同程度的白化現(xiàn)象。

圖1 PDS 基因沉默后植株表型Fig.1 Plant phenotypes after PDS gene silencing

圖2 注射PDS1、PDS2、PDS3 及空載體(CK)片段后兩周的植株Fig.2 Plants injected with PDS1， PDS2， PDS3 and empty vector(CK)fragments for two weeks

圖3 兩個不同OD600工作液的侵染效果Fig.3 Infection effects of working solutions at two different OD600

圖4 3 種不同農(nóng)桿菌侵染效果Fig.4 Infection effects of three Agrobacterium strains

圖5 不同真空時間抽真空法侵染后的植株Fig.5 Plants infected by vacuum pumping method at different vacuum time

圖6 白化后的工業(yè)大麻葉片F(xiàn)ig.6 Cannabis leaves after albinism

圖7 兩株VIGS 處理后工業(yè)大麻出現(xiàn)白化和未出現(xiàn)白化的真葉中PDS 基因表達(dá)量Fig.7 The expression levels of PDS genes in the albino and non albino true leaves of two VIGS treated cannabis plants

2.1.1 侵染苗齡的確定

VIGS 侵染的效率與病毒感染的細(xì)胞數(shù)量有直接關(guān)系，感染細(xì)胞數(shù)越多，沉默效率越高。采用注射法侵染時，當(dāng)苗齡超過3 周，葉片逐漸變薄變硬，葉背注射難以實現(xiàn)，細(xì)胞感染數(shù)量變少，而在1 周齡時葉片最容易注射，故選用1 周齡作為注射時間。

2.1.2 不同PDS片段注射后的表型

使用葉背注射法進(jìn)行侵染試驗，工作液的濃度設(shè)定為OD600＝0.8。農(nóng)桿菌菌株采用GV3101，TRV2 載體分別攜帶PDS基因的不同片段，包括TRV2::PDS1(960～1259 bp)、TRV2::PDS2(126～425 bp)、TRV2::PDS3(618～917 bp)。每個組分別侵染了15 株植株。結(jié)果顯示，PDS1 和PDS2 組的白化率均為13.3%，而PDS3 組沒有出現(xiàn)白化現(xiàn)象。

表1 不同PDS 片段注射后的白化效率Table 1 Albinism efficiency after injection of different PDS fragments

2.1.3 不同OD值工作液注射后的表型

采用葉背注射法，在使用工業(yè)大麻PDS的960～1259 bp 片段、農(nóng)桿菌菌種為GV3101 的情況下，工作液OD600＝0.5 以及OD600＝1.0 組分別侵染一周齡工業(yè)大麻10 株。當(dāng)工作液OD600＝1.0 時，有5 株樣品出現(xiàn)白化現(xiàn)象，沉默株率為50%，當(dāng)工作液OD600＝0.5 時有1 株樣品出現(xiàn)白化現(xiàn)象，沉默株率為10%。

表2 不同濃度工作液注射后的白化效率Table 2 Albinism efficiency after injection of working solution at different concentrations

2.1.4 不同農(nóng)桿菌菌株注射后的表型

在定量為葉背注射法、使用工業(yè)大麻PDS的960～1259 bp 片段、工作液OD600＝1.0 的情況下，分別用GV3101、EHA105、AGL1 3 種攜帶TRV2::PDS的農(nóng)桿菌菌株侵染工業(yè)大麻，每組分別侵染一周齡工業(yè)大麻10 株。侵染3 周后，注射GV3101 菌株的有3 株出現(xiàn)白化，注射EHA105 菌株的未出現(xiàn)白化，注射AGL1 菌株的有1 株出現(xiàn)白化。

表3 不同農(nóng)桿菌注射后的白化效率Table 3 Albinism efficiency after injection of different Agrobacterium strains

2.1.5 抽真空法真空時間的探索

采用真空滲透法侵染1 周齡工業(yè)大麻，在真空壓力為0.7 MPa 條件下，分別抽真空5、10、15 min。每組各設(shè)10 株重復(fù)，在生長3 周后發(fā)現(xiàn)3 組樣品均無白化現(xiàn)象，表明抽真空法在云麻7 號上較難實現(xiàn)。

2.1.6 葉片的侵染效果

在侵染后2～3 周，植株出現(xiàn)白化現(xiàn)象，可以觀察到第一對真葉由于注射引起機(jī)械損傷及老化，出現(xiàn)干枯壞死現(xiàn)象，靠近注射葉的第二對真葉出現(xiàn)白化，且僅接種植株的新生葉片局部白化，表明感染是局部性的，TRV 在細(xì)胞間和植物體全身的運動都受到限制，尤其是在整個植物體中的運動受限。

2.2 沉默后基因表達(dá)量分析

選取兩株VIGS 處理后的工業(yè)大麻植株，分別為出現(xiàn)(W)和未出現(xiàn)(G)白化的植株。取其第二對(W-2、G-3)及第三對真葉(W-3、G-3)進(jìn)行RT-qPCR 檢測。根據(jù)結(jié)果可知，出現(xiàn)白化的植株，第二對真葉(W-2)的PDS基因表達(dá)量相比其他葉片明顯降低，可證明白化現(xiàn)象是由PDS基因沉默導(dǎo)致。

3 討論

人們常通過沉默或敲除八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)基因，觀察是否獲得白化表型植株，以此驗證沉默體系是否工作。以TRV 病毒為基礎(chǔ)的VIGS 系統(tǒng)具有寄主范圍廣、沉默效率高、持續(xù)時間長、病毒癥狀輕、分生感染等優(yōu)勢，是VIGS 中應(yīng)用最為廣泛的一種系統(tǒng)[22]。但是，VGIS 載體的使用受宿主的限制，大多數(shù)只能用于煙草和番茄。

有報道使用棉花皺葉病毒(CLCrV)為載體[14]，并以AGL1 作為侵染農(nóng)桿菌，得到的沉默效率高于使用GV3101 農(nóng)桿菌的。但在不同宿主植物中，同樣的載體選擇，其沉默效率和成功率都有一定的差別。TRV 載體沉默株率高，病毒癥狀溫和，沉默持續(xù)性強(qiáng)。本研究以煙草脆裂病毒(TRV)為基礎(chǔ)探索VIGS 載體，結(jié)果表明，當(dāng)使用TRV 時，GV3101 農(nóng)桿菌侵染會得到預(yù)期的結(jié)果。

目前，VIGS 沉默的主要途徑有機(jī)械、金屬離子轟擊和農(nóng)桿菌等，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)相對于其他途徑更加簡便、有效，因而得到了廣泛的應(yīng)用[23]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的途徑有多種，如:牙簽刺傷法、真空滲透法、葉背注射法、高壓噴槍法等。本試驗采用葉背注射法進(jìn)行侵染，得到了沉默效果，采用真空浸透法未出現(xiàn)沉默，可能是菌液進(jìn)入植株的數(shù)量不足，可以探討是否可將兩種方法結(jié)合使用。保證帶有重組載體的菌液進(jìn)入植株，是確保VIGS 技術(shù)成功的關(guān)鍵因素。

本研究使用了葉背注射法和抽真空法使菌液進(jìn)入植物體內(nèi)，其中抽真空法適用于葉片較窄且較硬的植物，注射法適用于葉片較厚且軟的植物[24]。工業(yè)大麻在3 周齡前葉片較厚而柔軟，使用注射法可將菌液順利注射進(jìn)入植物體內(nèi)，但此時葉片較小，進(jìn)入的菌液量較少，這可能導(dǎo)致了葉片不能完全白化。本研究使用三周齡前的工業(yè)大麻進(jìn)行抽真空法侵染，而工業(yè)大麻在3 周齡后葉片逐漸變薄變硬，易于抽真空法菌液的進(jìn)入[25]，這可能是本研究抽真空法未能出現(xiàn)表型的原因之一。

在本試驗所有白化結(jié)果中，只有靠近注射葉的第二對真葉出現(xiàn)白化，白化葉片也并未像馬鈴薯、棉花等作物一樣整株白化，即單株沉默效果較低，說明TRV 在工業(yè)大麻細(xì)胞間和全身的運動都受到限制，下一步研究方向為提高病毒對工業(yè)大麻的侵染效率，以優(yōu)化沉默體系。

有研究[26]顯示，在適宜溫度條件下，SiRNA 能夠調(diào)控VIGS 的活性，但在較高的溫度條件下，VIGS基因會迅速退化，無法保持持久、穩(wěn)定的沉默。此外，很多抗病毒的通路還取決于溫度的調(diào)控，比如AGOs、DCLs、RDR[27]。病毒在入侵宿主細(xì)胞后，必須在適當(dāng)?shù)臏囟认逻M(jìn)行繁殖[28]。除了對低溫依賴性的病毒以外，大部分的植物病毒都能在20～25 ℃發(fā)生感染[29]。本研究侵染后將植株放在24 ℃環(huán)境下培養(yǎng)，可根據(jù)溫度調(diào)控進(jìn)一步優(yōu)化體系。本研究使用的材料為2～3 周齡的工業(yè)大麻，對于一些在更大周齡表達(dá)的功能基因，該VIGS體系是否起作用還有待商榷，后續(xù)需使用花期的工業(yè)大麻繼續(xù)探索其沉默體系，沉默該時期表達(dá)的基因，以驗證基因功能。

對于工業(yè)大麻VIGS 沉默體系，目前還存在沉默株率低、沉默葉片數(shù)較少、等待周期較長、條件不夠完善等缺點，需要繼續(xù)優(yōu)化體系，以保證更高效的沉默。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，侵染的苗齡、侵染方式、目的基因的片段、菌液濃度、農(nóng)桿菌的菌株對VIGS 沉默效果均具有明顯的影響，其中最適宜的體系為使用GV3101 農(nóng)桿菌，PDS基因選取片段為960～1259 bp 或126～425 bp，接種濃度OD600為1.0，最佳的接種方式是在一周苗齡采用葉背注射法，接種后培養(yǎng)溫度為24 ℃，培養(yǎng)2～3 周即可出現(xiàn)表型。