高前磊， 李川皓，陳帥，李?；ǎ瑥埾鄠?，袁震，盛清凱

(1. 天津農學院動物科學與動物醫(yī)學學院/天津市農業(yè)動物繁殖與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384；2. 山東省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東 濟南 250100；3. 山東鑫基牧業(yè)有限公司，山東 泰安 271200)

腸道是動物機體消化吸收的主要場所，也是機體重要的免疫器官[1]，腸道屏障作為防御腸腔毒素和病原微生物的重要防線，其遭到破壞會導致抗原向固有層滲透，引發(fā)炎癥級聯反應，從而引起腸道炎癥，誘發(fā)動物疾病，降低生產性能[2]。群體感應是菌群之間的一種通訊機制，細菌根據種群密度在細胞內或細胞間交換信息、協調群體行為、調節(jié)基因表達[3]。 細菌群落達到一定密度時，細菌會產生小分子物質并向外界釋放，當環(huán)境中信號分子富集濃度達到一定閾值時，會進入細菌細胞內與胞內受體結合調控相關基因的表達，使細菌群落出現新的群體行為，如生物發(fā)光、毒力因子的分泌、生物被膜的形成、抗生素抗性和運動等[4-6]。 銅綠假單胞菌產生的群體感應分子3OC12HSL 在以往的研究中較為集中，發(fā)現其可以對多種細胞類型發(fā)揮細胞毒性，誘導細胞凋亡，破壞細胞間連接，促進細菌透過內皮屏障[7]。3OC12HSL 在宿主體多個部位被檢測到，Xue等[8]在小鼠腸道、血清、肝臟中檢測到群體感應分子，在無菌小鼠中未檢測到。 不同研究結果顯示，3OC12HSL 的作用效果并非一致，不同物種、不同細胞間存在差異。 本試驗選用豬回腸上皮IPI-2I 細胞，探討3OC12HSL 對IPI-2I 細胞的影響及機制，以期為促進畜禽健康養(yǎng)殖生產提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試細胞:豬IPI-2I 回腸上皮細胞系購自上海煊雅生物科技有限公司。

主要試劑:3OC12HSL、DMSO 購自Sigma 公司；胎牛血清(FBS)為Ausbian 品牌；RPMI1640培養(yǎng)液購自Gibco 公司；AnnexinV 凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；細胞增殖活性檢測試劑盒(CCK-8)購自日本同仁化學研究所；白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素8(IL-8)、白介素1(IL-1)、腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA 試劑盒均購自武漢基因美生物技術公司；細胞總RNA 提取試劑盒及反轉錄試劑盒均購自南京諾威贊生物科技股份有限公司。

主要儀器:熒光定量PCR 儀(瑞士，羅氏)，流式細胞儀(美國，BD Biosciences)，酶標儀(美國，伯騰)，倒置相差顯微鏡(日本，Nikon)，CO2細胞培養(yǎng)箱(美國，Thermo)，超高速離心機(德國，Eppendorf)。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和試驗分組 將液氮保存的IPI-2I 細胞37 ℃水浴復蘇后接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，當細胞長至70%時，用0.25%胰蛋白酶(含0.02% EDTA)消化液消化，細胞密度調至105個/mL 接種，96 孔板每孔100 μL，25 cm2培養(yǎng)瓶每瓶4 mL，在37 ℃、5% 濃度CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。細胞生長至70%時進行試驗。 3OC12HSL 用DMSO 溶解，試驗組加入3OC12HSL 溶液，使各組終濃度分別為50、100、200、400 μmol/L，DMSO 濃度控制在0.1%。 對照組加入細胞培養(yǎng)液，其中DMSO 含量為0.1%。

1.2.2 CCK-8 法檢測細胞活性 將IPI-2I 細胞接種于96 孔板，分別用0、50、100、200、400 μmol/L的3OC12HSL 處理細胞，每組設6 個重復，分別培養(yǎng)4、8、12、24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，培養(yǎng)箱孵育2 h，用酶標儀測定450 nm 處各孔吸光度值，計算細胞活性。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 將IPI-2I 細胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，分別用0、50、100、200、400、800 μmol/L 的3OC12HSL 處理細胞12 h，倒掉培養(yǎng)液，PBS 沖洗3 次，加入1 mL 胰蛋白酶37 ℃消化5 min 后，加入1 mL 含胎牛血清的細胞培養(yǎng)液輕輕吹打未脫壁細胞，收集細胞懸液，1 000 r/min 離心5 min，去上清，加入100 μL緩沖液重懸細胞，加入5 μL FITC，輕輕混勻，加入10 μL PI 染液，25 ℃孵育10 min，流式細胞儀上機檢測細胞凋亡。

1.2.4 ELISA 法檢測炎癥因子 將IPI-2I 細胞接種于6 孔板中，每孔重復3 次，分別用0、50、100、200、400 μmol/L 的3OC12HSL 處理細胞12 h，收集細胞培養(yǎng)液，使用ELISA 試劑盒檢測培養(yǎng)液中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α的含量。

1.2.5 實時熒光定量RT-PCR 檢測mRNA 表達水平 細胞培養(yǎng)與處理方法同1.2.4。 RT-PCR引物利用Primer 5.0 軟件設計，由上海生物工程有限公司合成。 利用試劑盒提取細胞內總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 純度和完整性。 按反轉錄試劑盒說明書將總RNA 反轉錄為cDNA。RT-PCR 反應體系為20 μL，根據試劑盒說明書配制，反應程序為:95 ℃預變性30 s；95 ℃10 s，60 ℃30s，40個循環(huán)；95℃15s，60℃60s，95 ℃15 s。 以GAPHD作為內參照基因，所用引物見表1，用2-△△Ct計算mRNA 的相對表達量。

1.3 數據統計分析

采用GraphPad Prism 9.0 軟件進行統計分析作圖，組間比較采用ANOVA 分析，進一步比較采用LSD 檢驗，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 3OC12HSL 對IPI-2I 細胞活性的影響

不同濃度3OC12HSL 分別處理IPI-2I 細胞不同時間，CCK-8 檢測結果發(fā)現，隨著3OC12HSL 濃度的增加和作用時間的延長，細胞活性逐漸降低。 如圖1所示，作用時間為4 h，各組之間細胞活性沒有顯著差異；作用時間8 h、濃度為200 μmol/L 時，細胞活性較對照極顯著下降(P＜0.01)；作用時間延長至12 h，濃度為400 μmol/L 時，細胞活性降至對照組的50%以下；進一步延長作用時間至24 h，細胞活性未繼續(xù)下降。 3OC12HSL 濃度為400 μmol/L、作用時間為8 h時，細胞活性極顯著降低(P＜0.01)，12 h 時降到最低，繼續(xù)延長作用時間，細胞活性無顯著變化。 結果顯示，3OC12HSL 對IPI-2I 抑制效果呈時間與濃度依賴性。

圖1 3OC12HSL 濃度和作用時間對細胞活性的影響

2.2 3OC12HSL 對IPI-2I 細胞凋亡的影響

利用流式細胞儀檢測不同濃度3OC12HSL 作用12 h 時對IPI-2I 細胞凋亡的影響(圖2)，結果顯示，與對照組相比，100 μmol/L 3OC12HSL 極顯著增加細胞凋亡率(P＜0.01)。 隨著濃度增加，細胞凋亡率進一步增大，濃度達到800 μmol/L 時，細胞凋亡比例達到17.24%。 說明3OC12HSL 可以誘導IPI-2I 細胞凋亡，其濃度越高細胞凋亡率也越高。

2.3 3OC12HSL 對IPI-2I 細胞炎癥因子的影響

ELISA 檢測結果顯示(圖3)，與對照組相比，200 μmol/L 3OC12HSL 處理細胞后，細胞培養(yǎng)液中IL-6、IL-8、IL-1、TNF-α的濃度極顯著增加(P＜0.01)，隨3OC12HSL 作用濃度增大，炎癥因子濃度進一步升高。 與200 μmol/L 濃度處理相比，400 μmol/L 3OC12HSL 處理的炎癥因子濃度差異不顯著(P＞0.05)。 表明3OC12HSL 可以促進IPI-2I 細胞發(fā)生炎癥反應。

圖3 3OC12HSL 對細胞炎癥因子的影響

2.4 3OC12HSL 對IPI-2I 細胞凋亡相關基因mRNA 表達的影響

利用RT-PCR 檢測不同濃度3OC12HSL 作用12 h 后細胞Fas、Caspase3、Caspase8、Bax、Bcl-2基因mRNA 相對表達量。 結果(圖4)顯示，與對照組相比，3OC12HSL 濃度達到100 μmol/L 時顯著提高Bax基因mRNA 相對表達量(P＜0.05)，達到400 μmol/L 時顯著降低Bcl-2基因mRNA 相對表達量(P＜0.05)，達到50 μmol/L 時分別極顯著和顯著提高Fas(P＜0.01)、Caspase8(P＜0.05)基因的mRNA 表達水平，濃度達到100 μmol/L 時可極顯著提高Caspase3基因mRNA 相對表達量(P＜0.01)。 表明3OC12HSL 可能通過線粒體介導的內源性凋亡途徑和Fas/Fasl介導的外源性凋亡途徑誘導IPI-2I細胞凋亡。

圖4 3OC12HSL 對細胞凋亡基因mRNA 表達水平的影響

3 討論與結論

銅綠假單胞菌是畜禽腸道常見的條件致病菌，可引起宿主多個部位感染，其群體感應系統主要分泌3OC12HSL 和C4HSL 兩種群體感應分子，它們參與銅綠假單胞菌一系列生理過程的調節(jié)和與外界的信息交流[9]。 3OC12HSL 除了參與發(fā)揮細菌的致病作用，還可影響宿主細胞的功能及基因表達。 腸道是營養(yǎng)物質消化吸收的主要場所，腸道中聚集著大量的菌群，參與宿主免疫、代謝、內分泌等生理功能[10]。 腸道菌群產生的代謝物也影響著宿主，當腸道上皮細胞受損，腸黏膜屏障受到破壞[11]，會加劇宿主感染風險。 3OC12HSL作為脂溶性小分子，可以進入腸道上皮細胞，影響腸道細胞正常的生理功能，引起細胞凋亡，破壞腸道屏障。 Taguchi 等[12]利用低濃度3OC12HSL 作用于未分化的Caco-2 細胞，可使細胞活性降低，誘導細胞凋亡，通過抑制Akt 磷酸化增加細胞存活率，說明3OC12HSL 通過靶向促進Akt 磷酸化，引起細胞死亡。 Shimizu 等[13]發(fā)現低濃度的3OC12HSL 可以通過激活ERK1/2 途徑，減少黏糖蛋白(MUC3)的產生，進一步引起Caco-2 的凋亡。 Schwarzer 等[14]在3OC12HSL 誘導的呼吸道上皮細胞凋亡中發(fā)現，3OC12HSL 通過調控細胞內Ca2+的信號傳導促進凋亡，使用Ca2+抑制劑預處理10 min，可以保護呼吸道上皮屏障，顯著減少細胞死亡。 Nishimura-Danjobara等[15]發(fā)現3OC12HSL 可以干擾大鼠胸腺淋巴細胞膜對鉀離子的通透性，引起細胞膜超極化，擾亂淋巴細胞正常功能，表明3OC12HSL 可能通過影響宿主細胞內外的離子濃度發(fā)揮功能。 本研究中，3OC12HSL 以濃度和時間依賴性降低IPI-2I 細胞活性，引起細胞凋亡，表明3OC12HSL 對不同細胞的影響可能與物種、器官、劑量及作用時間有關。

動物機體促炎因子和抗炎因子的失調會引起宿主炎癥反應，炎癥性腸炎可破壞腸黏膜屏障，增加腸道通透性，擾亂腸黏膜免疫系統，破壞菌群平衡，最終引起腸道菌群失調，進而引起一系列腸道疾病，因此，維持腸道屏障的完整性對動物體的健康至關重要。 研究發(fā)現，3OC12HSL 對宿主免疫細胞具有多種調控功能，能夠調控宿主細胞炎癥反應，影響宿主固有免疫[16]。 Rahbari 等[17]研究表明，化膿性鏈球菌利用細菌群體感應系統產生的3OC12HSL，通過抑制巨噬細胞和樹突狀細胞中NF-kβ 蛋白活性，顯著降低細胞液中TNF-α和IL-6 表達水平，減少促炎因子的濃度，減弱宿主對病原菌的抵抗。 Jahoor 等[18]發(fā)現3OC12HSL增加了小鼠成纖維細胞和人上皮細胞中促炎因子mRNA 的水平，提出細胞PPAR 受體可能作為3OC12HSL 的靶點調控宿主的基因表達，這種促炎反應和抑炎反應的表現可能與細胞類型不同有關系。 Glucksam-Galnoy 等[19]發(fā)現銅綠假單胞菌產生的 3OC12HSL 以劑量依賴的方式對RAW264.7 小鼠巨噬細胞產生炎癥反應，降低促炎因子TNF-α的濃度，提高抑炎因子IL-10 的濃度。 本研究中發(fā)現IPI-2I 細胞在3OC12HSL 影響下顯著增加IL-6、IL-8、IL-1、TNF-α的濃度，表明3OC12HSL 可誘導細胞炎癥反應。

細胞凋亡是真核細胞生物中一種程序性死亡，對維持機體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)和發(fā)育具有重要作用，主要包括內源性途徑和外源性途徑[20]。 內源性途徑由線粒體介導，可由多種因素誘導發(fā)生，引起促凋亡蛋白Bax 寡居化，增加線粒體膜的通透性，細胞色素c 透過細胞膜進入細胞質， 激活Caspase9，繼而活化Caspase3，活化的Caspase3 可以直接降解細胞內的結構蛋白和功能蛋白，從而導致細胞凋亡[21]。 線粒體內抗凋亡蛋白Bcl-2可抑制Bax 的寡聚化，保持線粒體膜的完整性，阻止細胞凋亡[22]，細胞內Bcl-2 和Bax 的表達比例對細胞凋亡有重要意義。 本研究中3OC12HSL 作用IPI-2I 細胞，Bcl-2的mRNA 表達量降低，Bax的表達量升高，說明3OC12HSL 可以通過調控線粒體介導的Bcl-2家族抗凋亡和促凋亡基因的表達量，誘導細胞的凋亡。 外源性凋亡途徑由膜受體與配件結合傳遞凋亡信號，激活胞內信號級聯反應，引起細胞凋亡，死亡受體Fas 作為上游信號分子與其配體FasL 結合，招募死亡結構域蛋白(FADD)，與Caspase8 酶原形成死亡誘導信號復合物(DISC)，活化Caspase8 酶原，激活Caspase3，啟動細胞凋亡[23]。 Shin 等[24]研究發(fā)現，LPS 與3OC12HSL 聯合作用于人臍帶靜脈內皮細胞可加劇細胞凋亡，3OC12HSL 激活受體相互作用蛋白激酶1(RIPK1)通路，導致Caspase8和Caspase3水平的增加，用RIPK1 抑制劑作用后可減少細胞死亡。 Woo 等[25]發(fā)現3OC12HSL 可導致Ca2+外流和Caspase12活化，通過活性氧(ROS)損傷線粒體功能，導致細胞色素c 外漏，增加Caspase3，Caspase8，Caspase9的mRNA 表達量，進而引起細胞凋亡。 本研究發(fā)現，3OC12HSL 作用可以顯著增加Fas、Caspase8的mRNA 的表達水平，表明3OC12HSL 可以通過Fas/FasL凋亡途徑誘導細胞凋亡。

本研究結果表明，一定濃度的群體感應分子3OC12HSL 導致豬回腸上皮細胞多種促炎性因子的表達，能夠通過激活線粒體介導的內源性凋亡途徑和Fas/FasL介導的外源性凋亡途徑，促進腸道上皮細胞的凋亡，損傷腸道屏障功能，為后續(xù)開發(fā)群體感應抑制劑提供參考。