李宸儀, 陳慕雁

(海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學), 山東 青島 266003)

神經(jīng)肽是一種作用于神經(jīng)基質的小型蛋白質[1],由神經(jīng)肽前體蛋白切割而來[2-3],是動物生理過程和行為的重要調節(jié)因子,可作為神經(jīng)遞質、神經(jīng)調質在局部發(fā)揮作用,或作為激素系統(tǒng)性地發(fā)揮作用[4]。相較于脊椎動物和陸生無脊椎動物,神經(jīng)肽在海洋無脊椎動物中研究起步較晚,相關研究主要集中在攝食、繁殖、運動、免疫、生長發(fā)育等方面[5-8]。

luqin型神經(jīng)肽最初因其在軟體動物海兔(Aplysiacalifornica)腹神經(jīng)節(jié)左上象限的L5神經(jīng)元(the Left Upper Quadrant cells of the abdominal ganglion)中表達而得以命名[9-10]。此后,根據(jù)luqin型神經(jīng)肽前體和受體的序列相似性分析在兩側對稱動物中發(fā)現(xiàn)了該家族的其他成員,但在后口脊索動物中尚未見報道[11],相較于其他神經(jīng)肽信號系統(tǒng),針對luqin型神經(jīng)肽信號系統(tǒng)功能的研究較少,目前對功能表征的研究表明luqin型神經(jīng)肽是進化上古老的攝食行為調節(jié)子[12-16],在運動[10,17]和繁殖[18-19]方面也有一定的調節(jié)作用。在對棘皮動物的研究中,Yaez-Guerra等[10]利用原位雜交技術對成體紅海盤車(Asteriasrubens)不同組織中l(wèi)uqin型神經(jīng)肽前體ArLQP進行了定位分析,并利用體外藥理學實驗進行了初步的功能表征,但尚未見luqin型神經(jīng)肽在棘皮動物早期發(fā)育階段中的分布及表達特征的研究。

大多數(shù)棘皮動物為間接發(fā)育類型,即在由變態(tài)過程過渡到生殖活躍的成年階段前,會經(jīng)歷一個或多個幼體階段[20],幼體和成年棘皮動物具有完全不同的解剖結構和生活方式。對棘皮動物幼體中神經(jīng)肽及其前體進行定位和定量分析,將豐富神經(jīng)肽信號系統(tǒng)在棘皮動物幼體中潛在功能的認識,為棘皮動物神經(jīng)肽的比較生理學研究奠定基礎。Mayorova等[21]利用整胚原位雜交技術對紅海盤車8種神經(jīng)肽前體(L型SALMFamide、F型SALMFamide、NGFFYamide、加壓素/催產素型、促甲狀腺激素釋放激素型、促性腺激素釋放激素型、降鈣素型和促腎上腺皮質激素釋放激素型)在羽腕幼蟲和短腕幼蟲發(fā)育階段的分布進行了表征。結果表明,這8種神經(jīng)肽前體都在附著復合體中表達,部分神經(jīng)肽前體的表達與纖毛帶相關。Wood等[22]利用原位雜交和免疫組化技術對紫海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)的9種神經(jīng)肽及其前體在其幼蟲中的分布表達進行了研究,鑒定到表達一種或多種NP基因的幾個細胞亞群,它們主要位于頂端器官、臂基部、口周、纖毛帶以及中腸和前腸中。目前,關于刺參(Apostichopusjaponicus)早期發(fā)育階段神經(jīng)肽分布及表達特征的研究尚未見報道。

刺參是我國重要的水產養(yǎng)殖對象之一,具有很高的營養(yǎng)和藥用價值,近年來刺參增養(yǎng)殖產業(yè)迅速發(fā)展的同時也帶來了巨大的挑戰(zhàn)。要保證刺參增養(yǎng)殖產業(yè)的持續(xù)、高效發(fā)展,亟待深入開展刺參生物學特征尤其是神經(jīng)生理學的研究。本研究選取刺參典型的早期發(fā)育階段(囊胚期、原腸胚期、耳狀幼蟲期,樽形幼蟲期和五觸手幼蟲期[23-25]),利用免疫熒光和熒光定量技術初步探究了刺參luqin型神經(jīng)肽AjLQ及其前體基因AjLQP在刺參典型的早期發(fā)育階段的分布表達特征,以期為研究luqin型神經(jīng)肽在刺參早期發(fā)育階段中生理功能提供見解。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和處理

刺參典型早期發(fā)育階段的胚胎和幼體采自青島市膠南靈山衛(wèi)刺參養(yǎng)殖廠,將刺參胚胎或幼體于PBS中沖洗并置于4% PFA中4 ℃固定過夜,隨后依次用25%、50%、75%和100%甲醇進行處理,處理好的樣品用于后續(xù)免疫熒光實驗或置于-20 ℃甲醇中長期保存;用凍存管收集刺參早期發(fā)育階段的樣品,于液氮中速凍并保存在-80 ℃超低溫冰箱中,用于后續(xù)熒光定量分析。

1.2 抗體制備

針對AjLQ(KPYKFMRW-NH2)的一抗由Abmart (China) 生產。首先,化學合成多肽AjLQ并偶聯(lián)載體蛋白KLH,將其作為抗原來免疫兔子,處死后取血,進行抗體抗原親和純化;然后,利用酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)驗證一抗效價。

1.3 免疫熒光

用吸管將刺參不同發(fā)育階段的胚胎和幼體吸至載玻片,37 ℃烤片至樣品附著在載玻片上。3%過氧化氫處理25 min阻斷內源性過氧化物酶,PBST洗滌3×5 min,用5%山羊血清室溫封閉30 min,按一抗∶PBS=1∶200的比例稀釋,4 ℃孵育過夜(陰性對照為分別滴加PBS或免疫前血清或預吸收AjLQ的一抗)。PBST洗滌3×5 min,按二抗∶PBS=1∶2 000的比例稀釋二抗(FITC標記, absin, China),室溫孵育50 min。PBST洗滌3×5 min,滴加DAPI染液(G-clone,China)孵育3 min;熒光顯微鏡 (Olympus, Japan) 觀察拍照。

1.4 總RNA提取

采用Trizol法提取早期發(fā)育各階段的刺參總RNA。將組織在液氮中研磨成細粉狀,加入Trizol (Vazyme, China),4 ℃,14 000 r/min離心10 min;取上清液加入到含氯仿的新離心管中,渦旋混勻15 s至乳濁液,靜置5 min;4 ℃,14 000 r/min離心15 min;吸取適量上清液至新的離心管,加入等體積異丙醇,上下輕輕顛倒混勻30 s后4 ℃靜置15 min;4 ℃、14 000 r/min離心10 min;倒去上清液,加入75%乙醇,輕彈管底使沉淀懸浮,上下顛倒數(shù)次后靜置5 min,4 ℃、12 000 r/min離心5 min,重復該步驟一次;倒去上清,14 000 r/min離心1 min。用槍頭吸干液體,室溫晾干10 min。根據(jù)沉淀的多少,加入適量DEPC水,溶解30 min后混勻。隨后立即使用Biodropsis BD-1000核酸分析儀(OSTC, China) 和瓊脂糖電泳(Liuyi, China) 檢測提取總RNA的濃度和質量,保存于-80 ℃待用。

1.5 cDNA克隆與熒光定量

使用Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)試劑盒(Yeasen, China)對早期發(fā)育各階段的刺參胚胎和幼體cDNA進行全長擴增,使用Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒(Yeasen, China)和Corbett Rotoe-Gnen Q(Qiagen, Germany) qPCR儀進行熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR, qRT-PCR),操作步驟參照試劑盒說明書。添加熔解曲線驗證PCR反應產物的特異性。以β-actin和β-tubulin為雙內參,采用2-ΔΔCT方法分析AjLQP基因表達量的變化,利用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行ANOVA方差分析,用平均值±標準誤(Mean ± S.E.M.)來表示相對表達量。P<0.05為差異顯著。所用引物序列如表1所示。

表1 熒光定量所用引物序列

2 結果

2.1 AjLQ在刺參早期發(fā)育階段的分布特征

ELISA結果顯示了抗AjLQ抗體的效價(見圖1)。100 ng的AjLQ抗原肽與制備的抗AjLQ抗體在實驗所用的1∶200稀釋度下仍具有較好的反應性,而未與免疫前血清發(fā)生反應。

(■:添加免疫前血清;●:將一抗稀釋相應倍數(shù)后添加100 ng AjLQ抗原。每個稀釋倍數(shù)進行兩次重復,數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤?！? Adding pre-immune serum; ●: Adding 100 ng AjLQ antigen to primary antibody with corresponding dilution. Data represents mean±SEM from two replicates.)

在刺參早期發(fā)育階段,AjLQ免疫熒光陽性信號始見于旋轉脫膜囊胚期的間質(見圖2 A)。發(fā)育至原腸胚時,AjLQ分布于向內凹陷的胚孔處(見圖2 B)。

(A: 囊胚期; B: 原腸胚期。 VP: 植物極; Me: 間質; Bl: 囊胚腔; Be: 胚孔。 比例尺: 50 μm。A: Blastula stage; B: Gastrula stage. VP: Vegetal pole; Me: Mesenchyme; Bl: Blastocoel; Be: Blastopore. Scale bars: 50 μm.)

刺參幼體從耳狀幼蟲期開始攝食[24,26]。在耳狀幼蟲早期,刺參幼蟲的消化道開始明顯分化,此時在口部可見AjLQ免疫熒光陽性信號(見圖3 A)。隨著耳狀幼蟲進一步發(fā)育,可以觀察到AjLQ在口、食道、肛前環(huán)和肛門(見圖3 B)及前背脊、中背脊、后背脊和后側脊等處纖毛帶的陽性信號(見圖3 C),且多集中于幼蟲反口端。

(A: 耳狀幼蟲早期; B: 耳狀幼蟲中期; C: 耳狀幼蟲后期。 Mh: 口; Es: 食道; As: 肛門; PL: 口前環(huán); PL*: 肛前環(huán); AD: 前背脊; MD: 中背脊; PD: 后背脊; PL: 后側脊。 比例尺: 50 μm。 A: Early auricular stage; B: Middle auricular stage; C: Late auricular stage. Mh: Mouth; Es: Esophagus; As: Anus; PL: Preoral loop; PL*: Preanal loop; AD: Anterior dorsal ridge; MD: Mid-dorsal ridge; PD: Posterior dorsal ridge; PL: Posterior lateral ridge. Scale bars: 50 μm.)

在樽形幼蟲期,AjLQ主要分布于纖毛環(huán)和內部器官團中(見圖4 A)。在五觸手幼蟲期的纖毛環(huán)和口觸手中也觀察到了AjLQ免疫熒光陽性染色(見圖4 B)。

2.2 AjLQP在刺參早期發(fā)育階段的表達特征

如圖5所示,AjLQP在刺參囊胚期的表達量最低,在原腸胚期有所上升,耳狀幼蟲期表達量顯著高于其他4個階段(P<0.05)。

3 討論

本研究率先結合免疫熒光和熒光定量PCR技術解析了luqin型神經(jīng)肽在刺參典型早期發(fā)育階段——囊胚期、原腸胚期、耳狀幼蟲期、樽形幼蟲期和五觸手幼蟲期的定位特征,測定了luqin型神經(jīng)肽前體基因在這些早期發(fā)育階段的表達特征,為后續(xù)鑒定神經(jīng)肽在刺參早期發(fā)育階段的生理功能奠定基礎。

刺參luqin型神經(jīng)肽前體在耳狀幼蟲期顯著上調表達,而耳狀幼蟲期的顯著特征之一是攝食開始[24,26],在刺參早期發(fā)育階段游泳、攝食相關組織[21](耳狀幼蟲的口、食道、肛前環(huán)、肛門和纖毛帶,樽形幼蟲和五觸手幼蟲的纖毛環(huán))中也發(fā)現(xiàn)了AjLQ免疫熒光陽性信號,由此我們推測luqin型神經(jīng)肽可能參與刺參幼蟲的游泳和攝食調控。我們在刺參成體luqin型神經(jīng)肽功能表征的研究中同樣發(fā)現(xiàn)luqin型神經(jīng)肽是刺參運動和攝食潛在的調節(jié)子(未發(fā)表數(shù)據(jù))。類似的,在對棘皮動物成體的研究中,Yaez-Guerra等[10]利用原位雜交技術對成體紅海盤車不同組織中l(wèi)uqin型神經(jīng)肽前體ArLQP進行了定位分析,發(fā)現(xiàn)ArLQP在成體海盤車運動器官(管足)、消化系統(tǒng)的賁門胃和幽門胃中有所分布,體外藥理學實驗進一步表明ArLQP可能參與了紅海盤車運動和攝食方面的調節(jié)[10]。此外,luqin型神經(jīng)肽類似的潛在功能也在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)[17]、綠頭蠅(Phormiaregina)[13-14]和蝦(Marsupenaeusjaponicus)[16]等物種中被報道。Nakano等[27]使用3種一抗對刺參幼體神經(jīng)元進行免疫熒光標記,在耳狀幼蟲、樽形幼蟲和五觸手幼蟲時期,沿纖毛帶/環(huán)觀察到大量陽性信號,這與我們觀察到的luqin型神經(jīng)肽的免疫熒光陽性信號分布區(qū)域重疊。有研究發(fā)現(xiàn),棘皮動物幼蟲的神經(jīng)系統(tǒng)可能通過控制纖毛帶的擺動方向以及食道和幼蟲臂的肌肉組織來控制游泳和攝食[28],這暗示了包括AjLQ在內的神經(jīng)肽作為神經(jīng)系統(tǒng)的重要調節(jié)因子,可能是通過控制纖毛擺動從而調節(jié)刺參早期發(fā)育階段的游泳和攝食行為。本研究結果表明了luqin型神經(jīng)肽在棘皮動物幼體和成體中的功能保守性,但仍需對其進行進一步的藥理學表征。未來,神經(jīng)肽在棘皮動物早期發(fā)育階段和成體中的比較生理學研究可以擴充我們對神經(jīng)肽生理功能的認知,并有助于理解神經(jīng)肽信號系統(tǒng)的進化。

口觸手和管足是海膽、海參和海蛇尾幼蟲的主要粘附器官[29-30],而粘附對包括棘皮動物在內的海洋無脊椎動物的生長發(fā)育至關重要[31]。有研究表明,粘附器官中與附著和分離相關的分泌細胞受神經(jīng)分泌樣細胞的調節(jié),在其中表達的神經(jīng)肽可能參與控制幼蟲的附著相關過程[21,32]。AjLQ在五觸手幼蟲期口觸手中的陽性表達表明其在幼體粘附過程中的潛在調控作用, Mayorova等[21]同樣發(fā)現(xiàn)紅海盤車的8種神經(jīng)肽前體(L型SALMFamide、F型SALMFamide、NGFFYamide、加壓素/催產素型、促甲狀腺激素釋放激素型、促性腺激素釋放激素型、降鈣素型和促腎上腺皮質激素釋放激素型)在羽腕幼蟲和短腕幼蟲附著復合體中的表達,這表明神經(jīng)肽在棘皮動物早期發(fā)育階段的潛在生理功能上有一定的共性。

4 結語

本研究利用免疫熒光和熒光定量技術初步探究了luqin型神經(jīng)肽信號系統(tǒng)在刺參典型早期發(fā)育階段的分布及表達特征。AjLQ免疫熒光陽性信號主要分布在游泳、攝食和附著相關器官中,AjLQP基因在刺參耳狀幼蟲期表達量達到最高且與其他階段有顯著性差異。研究結果提示,luqin型神經(jīng)肽可能參與了刺參幼蟲的游泳、攝食和附著調控。