基于BALB/c 小鼠模型的松茸低溫水提物的免疫調(diào)節(jié)作用

杜漢廷，林松毅，李冬梅，葛 麒，陳冬

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心 遼寧大連 116034）

松茸（Tricholoma matsutake Singer）是一種純天然珍貴稀有的藥食兩用真菌，享有“菌中之王”的美譽(yù)[1]，在我國(guó)主要分布于吉林、云南以及川藏地區(qū)等。松茸營(yíng)養(yǎng)豐富，化學(xué)成分組成復(fù)雜，含有多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽、甾類(lèi)、萜類(lèi)、油脂以及多酚和維生素等物質(zhì)，其多種營(yíng)養(yǎng)成分被廣泛應(yīng)用于藥品、保健品及化妝品領(lǐng)域[2]。已有研究證實(shí)，松茸中的生物活性組分具有抗癌、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化，降低膽固醇的能力[3]。

免疫穩(wěn)態(tài)平衡對(duì)維持機(jī)體健康狀況具有至關(guān)重要的作用。當(dāng)機(jī)體受到外來(lái)污染物和內(nèi)部壞死、突變細(xì)胞的感染、侵害時(shí)，機(jī)體將通過(guò)免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞與器官的協(xié)同作用以及免疫反應(yīng)來(lái)維持身體健康的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡[4-5]。然而，情緒、工作壓力和化療等諸多因素會(huì)破壞這種平衡，進(jìn)而導(dǎo)致免疫紊亂，引發(fā)免疫相關(guān)疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病、癌癥以及肥胖等[6]。目前臨床上，常使用放線(xiàn)菌素、長(zhǎng)春新堿、地塞米松等常規(guī)化學(xué)藥物作為免疫調(diào)節(jié)劑來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，然而，這些化學(xué)藥物成本較高，具有不可避免的副作用，并不適合長(zhǎng)期使用[7]。開(kāi)發(fā)一個(gè)新的、更安全的免疫調(diào)節(jié)策略，如開(kāi)發(fā)天然來(lái)源的免疫調(diào)節(jié)劑是預(yù)防和治療免疫抑制疾病的有效方法之一。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)食用菌源免疫調(diào)節(jié)劑的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)活性研究已取得一些進(jìn)展。Meng等[8]研究發(fā)現(xiàn)，翹鱗肉齒菌提取物通過(guò)增加血清免疫球蛋白和免疫因子，中和氧化應(yīng)激，顯著改善CTX 誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的免疫功能。張瑞[9]研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌水提物具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，能明顯增強(qiáng)環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力和脾臟淋巴細(xì)胞的增殖能力，顯著提高NK 細(xì)胞的殺傷活性，提高小鼠肝臟和血清中的GSH-PX、SOD、CAT、AKP 等酶的活性。Ditamo等[10]研究雙孢菇中凝集素具有減少先天性和適應(yīng)性反應(yīng)的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用。Jedrzejewski等[11]發(fā)現(xiàn)云芝提取物具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性，能夠促進(jìn)大鼠細(xì)胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-2 的產(chǎn)生，增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)能力[11]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，猴頭菇[12]、香菇[13]和裂蓋馬鞍菌[14]中獲得的提取物對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠免疫抑制也有保護(hù)作用。然而，目前關(guān)于松茸源免疫調(diào)節(jié)劑的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)研究較為缺乏。

本文采用環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）誘導(dǎo)建立免疫抑制小鼠模型，評(píng)價(jià)松茸低溫水提物（Tricholoma matsutake water extract，TMWE）及其粗蛋白組分（Tricholoma matsutake water extract-crude protein，TMWE-CP）對(duì)BALB/c 免疫抑制小鼠免疫調(diào)節(jié)活性的調(diào)節(jié)作用，包括非特異性免疫（小鼠體質(zhì)量與免疫器官指數(shù)、脾臟組織病理學(xué)和單核-巨噬細(xì)胞清除能力）、體液免疫（血清半溶血值和血清免疫球蛋白G、M 水平）和細(xì)胞免疫（遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)和脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力）3個(gè)方面的影響，研究結(jié)果可為松茸生物活性成分的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，松茸源免疫調(diào)節(jié)劑及其功能性產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料及試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為清潔級(jí)（Specific pathogen free，SPF）雄性BALB/c 小鼠（6～8 周齡，20 g±2 g），購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司（大連，中國(guó)）。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)研究均經(jīng)大連工業(yè)大學(xué)倫理委員會(huì)（IDSYXK2017-0005）批準(zhǔn)，并符合其標(biāo)準(zhǔn)，小鼠飼養(yǎng)于無(wú)菌動(dòng)物房中（溫度：23℃±2 ℃，濕度：50%±5%，12 小時(shí)照明光暗循環(huán)）。所有動(dòng)物可以自由攝取SPF 級(jí)飲用水和飼料。

1.1.2 受試物（樣品）的制備 松茸：長(zhǎng)白山野生松茸凍干片，吉林省延吉市順鑫松茸貿(mào)易有限公司。

松茸粉：取適量?jī)龈伤扇灼?，用高速粉碎機(jī)打碎成粉，過(guò)60 目篩，密封置于干燥處備用。

TMWE：根據(jù)實(shí)驗(yàn)室先前研究，將松茸粉（200 g）與蒸餾水（6 L）混合，20 ℃提取2 h，取上清液凍干，并在-80 ℃下保存，備用。

TMWE-CP：從TMAE 中經(jīng)硫酸銨鹽析[15]、離心、透析、凍干等操作分離得到粗蛋白組分，并在-80 ℃下保存，備用。

采用雙縮脲法測(cè)定蛋白含量[16]，苯酚硫酸法測(cè)定總糖含量[17]，TMWE 中蛋白含量18.72%±3.19%，總糖含量34.64%±4.09%；TMWE-CP 蛋白含量58.79%±0.07%，總糖含量9.62%±0.08%。

1.1.3 試劑 鹽酸左旋咪唑（Levamisole，LMS），山東仁和堂藥業(yè)有限公司；環(huán)磷酰胺，上海麥克林生化科技有限公司；紅細(xì)胞裂解液，北京索萊寶科技有限公司；刀豆球蛋白A（Concanavalin A，Con A）、印度墨水，上海源葉生物科技有限公司；綿羊紅細(xì)胞（Sheep red blood cell，SRBC）、豚鼠血清，廣州鴻泉生物科技有限公司；SA 緩沖液、都氏試劑、多聚甲醛固定液（4%），北京雷根生物技術(shù)有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）和免疫球蛋白A（Immunoglobulin M，IgM）ELSIA 試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Leica DM2500 熒光顯微鏡，徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司；日本Infinite M 200 多功能酶標(biāo)，瑞士Tecan 公司；NU-437-400S 垂直流生物安全柜、NU-5810E CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Nuaire 公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組設(shè)計(jì) 如圖1 所示，所有小鼠適應(yīng)7 d 后，將50 只雄性BALB/c 小鼠隨機(jī)分為5 組（n=10）：正常對(duì)照組（Normal control group，NC），模型對(duì)照組（Model control group，MC），陽(yáng)性對(duì)照組（Positive control group，PC），松茸低溫水提物組（Tricholoma matsutake water extract group，TMWE）和松茸水提粗蛋白組（Tricholoma matsutake water extract -crude protein group，TMWE-CP）。如圖1 所示，NC 和MC 組小鼠分別灌胃0.2 mL 生理鹽水（0.1 mL/10 g BW，Body weight），PC 組灌胃25 mg/（kg·d）LMS[18]，TMWE 組灌胃200 mg/（kg·d）TMWE[19]，TMWECP 組給予200 mg/（kg·d）TMWE 中蛋白含量相當(dāng)?shù)腡MWE-CP（64 mg/（kg·d））灌胃處理，試驗(yàn)總共5 周，每3 d 記錄1 次小鼠體質(zhì)量，直至試驗(yàn)結(jié)束。在灌胃處理的第29 天、30 天，除NC 組，其它各組所有小鼠腹腔注射50 mg/（kg·d）CTX[20]以建立小鼠免疫抑制模型。第35 天完成最后一次給藥后，所有小鼠禁食不禁水12 h，摘眼球取血并離心血液以收集血清，頸椎脫位法處死小鼠，收集胸腺、脾臟、肝臟于無(wú)菌離心管中，并在-80 ℃下保存，備用。

1.3.2 小鼠體質(zhì)量及免疫器官指數(shù)的測(cè)定 在受試物灌胃處理期間，每周測(cè)量并記錄各組小鼠的體重。在注射過(guò)程中每天測(cè)量1 次小鼠的體重。灌胃結(jié)束后，頸椎脫位法處死小鼠，取出小鼠的胸腺、脾臟，稱(chēng)重。免疫器官指數(shù)的計(jì)算公式如下[20]：

1.3.3 組織病理學(xué) 小鼠處死后，取出脾組織，用4%多聚甲醛固定24 h，進(jìn)行石蠟包埋，切片（厚度4 μm），H&E 染色，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察染色并拍照[21]。

1.3.4 碳顆粒清除能力的測(cè)定[22]小鼠末次給藥24 h 后，稱(chēng)重，小鼠尾靜脈注射0.1 mL/10 g 印度墨汁（1∶4），尾靜脈注射后立即計(jì)時(shí)，分別于2 min（T1）和10 min（T2）時(shí)眼靜脈叢各取血20 μL，然后與2 mL 0.1%碳酸鈉溶液混合。在600 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定混合液在T1和T2時(shí)的OD 值，記為A1、A2，取2 mL 0.1% Na2CO3作空白。采血后頸椎脫位法處死小鼠，解剖取出小鼠的肝臟、脾臟并稱(chēng)重。碳顆粒清除能力（α）計(jì)算公式如下：

式中：α——碳顆粒清除能力；T1——采血時(shí)間2 min；T2——采血時(shí)間10 min；A1——T1時(shí)混合液的OD600nm值；A2——T2時(shí)混合液的OD600nm值。

1.3.5 Con A 誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖試驗(yàn)[23]灌胃后處死小鼠，無(wú)菌取出小鼠脾臟，置于5 mL 無(wú)菌PBS 中。用一次性注射器內(nèi)芯，輕微用力將脾臟磨碎，通過(guò)200 目網(wǎng)狀篩生成單細(xì)胞懸液，Hank's液清洗3 次。用紅細(xì)胞裂解緩沖液處理細(xì)胞，離心（1 000 r/min，5 min）去除紅細(xì)胞。將細(xì)胞用RPMI-1640（含10%胎牛血清）完全培養(yǎng)基清洗和重懸。控制脾細(xì)胞濃度至2×106個(gè)/mL。然后，將180 μL脾細(xì)胞懸液和20 μL Con A 接種到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)版中，使Con A 的最終濃度為5 μg/mL，另取200 μL RPMI-1640 完全培養(yǎng)基作空白對(duì)照。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育48 h。在培養(yǎng)結(jié)束前4 h，向每個(gè)孔中加入WST（水溶性四唑鹽）溶液，并繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后，使用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm 處的吸光度。

1.3.6 遲發(fā)型超敏反應(yīng)（Delayed type hypersensitivity，DTH）的測(cè)定 參考魏艷等[24]的研究方法，采用足跖增厚法測(cè)定DTH。每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（體積分?jǐn)?shù)）SRBC（約1×108個(gè)細(xì)胞）進(jìn)行DTH 試驗(yàn)。腹腔免疫4 d 后，使用游標(biāo)卡尺（0.01 mm）測(cè)量左后爪的厚度，然后向小鼠左后爪測(cè)量部位皮下注射含有約1×108個(gè)細(xì)胞的20 μL的20% SRBC（體積分?jǐn)?shù)）。24 h 后，測(cè)量左后爪的厚度（測(cè)量3 次，取平均值），并計(jì)算跖骨腫脹厚度差異，以反映DTH 的程度。

1.3.7 血清半溶血值（Serum half-hemolysis value，HC50）[23]的測(cè)定 在灌胃處理結(jié)束前4 d，每只小鼠腹腔注射0.2 mL 的2%（體積分?jǐn)?shù)）SRBC 懸液。4 d 后，小鼠眼眶采血，測(cè)定半溶血值（HC50）。首先，用1 mL SA 緩沖液稀釋20 μL 血清，取1 mL 稀釋血清樣品，0.5 mL 10%（體積分?jǐn)?shù)）SRBC懸液和1 mL 豚鼠補(bǔ)體（1 ∶10），在37 ℃水浴中孵育30 min。冰浴以終止反應(yīng)，離心（2 000 r/min，10 min），取1 mL 上清，加入3 mL 都氏試劑。陽(yáng)性對(duì)照組分別加入0.25 mL 的10%（體積分?jǐn)?shù)）SRBC懸液、3.75 mL 都氏試劑，徹底混合并孵育10 min。測(cè)量490 nm 下的OD 值。HC50的計(jì)算公式如下：

1.3.8 血清免疫球蛋白（IgG、IgM）的測(cè)定 血清IgG、IgM 分析采用酶聯(lián)免疫吸附分析檢測(cè)試劑盒測(cè)定。按照制造商的說(shuō)明，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量溶液的OD 值，血清IgM、IgG 濃度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 2019b、SPSS 25.0 軟件進(jìn)行處理和分析。每個(gè)試驗(yàn)至少平行重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析，然后采用Tukey HSD 檢驗(yàn)，比較組間差異，顯著性水平設(shè)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 TMWE 和TMWE-CP 對(duì)免疫抑制小鼠體質(zhì)量和免疫器官指數(shù)的影響

胸腺和脾臟是免疫細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、成熟和產(chǎn)生免疫反應(yīng)的重要免疫器官，其免疫調(diào)節(jié)作用與器官指數(shù)的增加密切相關(guān)，各器官指標(biāo)在一定程度上反映了免疫器官的功能狀況[25]。如圖2 所示，MC 組的免疫器官指數(shù)明顯低于NC 組（P<0.05），表明成功建立免疫抑制模型。在建立CTX 誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠模型時(shí)，常使用LMS 作陽(yáng)性模型藥物，經(jīng)LMS 處理的小鼠的免疫器官指數(shù)也高于MC 組（P<0.05）。此外，與MC 組相比，經(jīng)TMWE和TMWE-CP 處理的小鼠的免疫器官指數(shù)均顯著增加（P<0.05），表明TMWE 和TMWE-CP 組分可減輕CTX 引起的免疫器官萎縮，能夠拮抗CTX 所致的免疫器官指數(shù)下降。此外，TMWE 組胸腺指數(shù)顯著（P<0.01）高于TMWE-CP 組。以上結(jié)果表明，TMWE 和TMWE-CP 均可有效的改善CTX 誘導(dǎo)的免疫抑制，具有預(yù)防和治療效果，并且TMWE對(duì)免疫器官損傷的改善效果更為顯著。

圖2 TMWE 和TMWE-CP 對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響Fig.2 The effects on immune organ index of TMWE and TMWE-CP

不同組分處理的小鼠體質(zhì)量變化如圖3 所示。第1 天至第22 天，所有處理組的小鼠的體質(zhì)量，均呈上升趨勢(shì)。第23 天后，NC 組小鼠的體質(zhì)量持續(xù)增加，而其它組小鼠體質(zhì)量顯著下降（P<0.05），表明造模成功。造模期后，TWME-CP組小鼠的體質(zhì)量下降程度最小，MC 組小鼠體質(zhì)量下降程度最大，其它組小鼠體質(zhì)量趨勢(shì)相近，說(shuō)明TWME-CP 組分可顯著抑制CTX 導(dǎo)致的小鼠體質(zhì)量減輕。小鼠體質(zhì)量的變化表明TMWE 和TMWE-CP 均具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力。

圖3 TMWE 和TMWE-CP 對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響Fig.3 The effects on body weight of TMWE and TMWE-CP

2.2 TMWE 和TMWE-CP 對(duì)免疫抑制小鼠脾臟組織形態(tài)學(xué)影響

通過(guò)對(duì)脾臟形態(tài)學(xué)觀察，評(píng)價(jià)TMWE 和TMWE-CP 組分處理對(duì)免疫器官的影響。如圖4所示，HE 染色顯示，NC 對(duì)照組脾囊（100×A）未被破壞，生發(fā)中心融合（100×B、200×），脾紅、白髓結(jié)構(gòu)正常，淋巴細(xì)胞排列緊密（400×）。相比之下，MC組的脾囊（100×A）被破壞，生發(fā)中心（100×B）離散，紅白髓間邊界不清楚且淋巴細(xì)胞數(shù)量減少、稀疏。而通過(guò)TMWE 和TMWE-CP 的持續(xù)干預(yù)，其受損程度相比MC 組較輕，脾囊（100×A）趨于完整，生發(fā)中心趨于融合（100×B），淋巴細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)，排列趨于緊密（400×），組織表現(xiàn)幾乎接近NC組。此外，與TMWE 組相比，TMWE-CP 組淋巴細(xì)胞排列更緊密，數(shù)量顯著恢復(fù)（400×），但生發(fā)中心（100×B）融合度稍低，表明TMWE 對(duì)脾臟損傷的恢復(fù)效果更好。綜上，TMWE 和TMWE-CP 的干預(yù)處理均可改善CTX 誘導(dǎo)的脾臟組織損傷，二者對(duì)脾臟均具有預(yù)防和保護(hù)作用，TMWE 組分改善效果更好。

圖4 TMWE 和TMWE-CP 對(duì)小鼠脾臟組織病理變化的影響Fig.4 Effects of TMWE and TMWE-CP on pathological changes of spleen in mice

2.3 TMWE 和TMWE-CP 對(duì)免疫抑制小鼠碳顆粒清除能力的影響

巨噬細(xì)胞在免疫應(yīng)答和宿主防御中起關(guān)鍵作用，它不僅是一種重要的免疫細(xì)胞，而且也是單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的主要組成部分，可通過(guò)吞噬作用直接清除腫瘤、外部病毒、細(xì)菌甚至癌細(xì)胞，從而介導(dǎo)非特異性免疫反應(yīng)[26]。碳粒廓清試驗(yàn)是檢測(cè)單核-巨噬細(xì)胞吞噬能力的經(jīng)典試驗(yàn)方法。結(jié)果如圖5 所示，MC 組小鼠吞噬細(xì)胞吞噬指數(shù)與NC 組相比顯著下降（P<0.01），這表明注射CTX 可降低小鼠的碳顆粒清除能力。與MC 組相比，TMWE 和TMWE-CP 處理能夠顯著提高免疫抑制小鼠的碳顆粒清除能力，其結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），由此表明，TMWE 和TMWE-CP 處理均能夠預(yù)防并逆轉(zhuǎn)CTX 的免疫抑制作用，以此增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫。另外，與NC 組小鼠相比，口服TMWE可顯著增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬作用，其作用效果顯著優(yōu)于TMWE-CP 給藥處理（P<0.01）。結(jié)果表明TMWE 在機(jī)體非特異性免疫方面具有良好免疫增強(qiáng)效果，且優(yōu)于TMWE-CP。

圖5 TMWE 和TMWE-CP 對(duì)免疫抑制小鼠碳顆粒清除能力的影響Fig.5 Effects of TMWE and TMWE-CP on carbon particle clearance ability in immunosuppressed mice

2.4 TMWE 和TMWE-CP 對(duì)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖率的影響

如圖6 所示，經(jīng)Con A 誘導(dǎo)后，MC 組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率顯著降低（P<0.05），表明CTX 能夠嚴(yán)重?fù)p害脾淋巴細(xì)胞的增殖。經(jīng)給藥干預(yù)后，TMWE 和TMWE-CP 組脾淋巴細(xì)胞增殖率顯著高于MC 組，由此表明TTMWE 和TMWE-CP 均可以顯著改善由CTX 處理引起的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率降低作用。與TMWE 組相比，TMWE-CP 組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率顯著提高。以上結(jié)果表明，TMWE 和TMWE-CP 組分對(duì)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖具有顯著改善作用，TMWE-CP 組分在脾淋巴細(xì)胞增殖的細(xì)胞免疫水平上更加顯著。

圖6 TMWE 和TMWE-CP 對(duì)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響Fig.6 Effect of TMWE and TMWE-CP on splenic lymphocyte proliferation activity in immunosuppressed mice

2.5 TMWE 和TMWE-CP 對(duì)免疫抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)（DTH）的影響

免疫抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)結(jié)果如圖7 所示，經(jīng)SRBC 致敏后，MC 組與NC 組小鼠的DTH水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明模型建立良好。PC 組及各受試組與MC 組小鼠的DTH水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明TMWE和TMWE-CP 均能夠顯著增強(qiáng)特異性增敏效應(yīng)T細(xì)胞介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)。此外，與TMWE組相比，TMWE-CP 組小鼠的DTH 水平顯著提高（P<0.05），與免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力的試驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)一致。以上結(jié)果表明，TMWE及TMWE-CP 組分可顯著增強(qiáng)T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答能力，增強(qiáng)免疫抑制小鼠細(xì)胞免疫功能，且TMWE-CP 組分作用效果更加顯著。

圖7 TMWE 和TMWE-CP 對(duì)免疫抑制小鼠DTH 的影響Fig.7 Effects of TMWE and TMWE-CP on DTH in immunosuppressed mice

2.6 TMWE 和TMWE-CP 對(duì)免疫抑制小鼠血清半溶血值（HC50）的影響

通過(guò)測(cè)定HC50值來(lái)評(píng)價(jià)TMWE 及其不同組分對(duì)免疫抑制小鼠體液反應(yīng)的影響。如圖8 所示，MC 組的溶血素產(chǎn)生水平明顯低于NC 組（P<0.05），說(shuō)明CTX 顯著抑制了小鼠血清總補(bǔ)體溶血活性。與MC 組相比，TMWE 和TMWE-CP 組HC50水平顯著提升（P<0.05）。另一方面，與NC 組相比，TMWE 和TMWE-CP 組HC50水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），但TMWE 與TMWE-CP 組之間HC50水平不顯著（P>0.05）。以上結(jié)果表明，TMWE和TMWE-CP 組分的灌胃干預(yù)可較好的拮抗CTX的免疫抑制作用，增強(qiáng)免疫抑制小鼠的體液免疫功能。

2.7 TMWE 和TMWE-CP 對(duì)免疫抑制小鼠血清免疫球蛋白（IgG、IgM）的影響

小鼠血清中IgG、IgM 含量如圖9 所示，MC 組與NC 組相比，在注射CTX 后，IgG、IgM 的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。與MC 組相比，灌胃TMWE和TMWE-CP 能夠顯著增強(qiáng)CTX 免疫抑制小鼠的IgG、IgM 的表達(dá)水平（P<0.05）。其中，TMWECP 的小鼠IgG 表達(dá)水平顯著高于TMWE 組（P<0.05），IgM 表達(dá)水平未見(jiàn)顯著性差異（P>0.05）。由此表明，TMWE 和TMWE-CP 組分的灌胃干預(yù)均可恢復(fù)免疫抑制小鼠的IgG 和IgM 水平，可改善免疫抑制小鼠的體液免疫功能，且以TMWE-CP組分作用效果較優(yōu)。

圖9 TMWE 和TMWE-CP 對(duì)免疫抑制小鼠血清免疫球蛋白的影響Fig.9 Effects of TMWE and TMWE-CP on IgG（a）and IgM（b）in serum of immunosuppressed mice

3 討論

環(huán)磷酰胺（CTX）是一種應(yīng)用十分廣泛的抗腫瘤藥物之一，但同時(shí)它也是一種高效的免疫抑制藥物，故本研究以CTX 作為動(dòng)物免疫抑制模型的制備藥物[25]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，腹腔注射CTX 后，MC組及各試驗(yàn)組小鼠均表現(xiàn)出不同程度的精神萎靡不振，伴隨小鼠體重明顯下降，這與衣偉萌等[27]對(duì)太子參參須提取物免疫抑制改善研究中的免疫抑制小鼠表現(xiàn)特征相近。此外，MC 組的免疫器官指數(shù)、碳顆粒清除能力、脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化活性、DTH、HC50、IgG 與IgM 水平較NC 組小鼠相比均顯著降低，表明CTX 使小鼠免疫功能受到抑制，免疫抑制模型成功建立。

脾臟和胸腺是動(dòng)物體內(nèi)主要的免疫器官，含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，在細(xì)胞免疫和體液免疫中發(fā)揮重要作用，而CTX 可抑制巨噬細(xì)胞分化，并減少免疫器官中的淋巴細(xì)胞數(shù)量，從而使體重、脾臟和胸腺質(zhì)量下降[28]。因此，小鼠體重、脾臟病理學(xué)特征以及免疫器官指數(shù)能夠反映機(jī)體非特異性免疫水平。在本研究中，MC 組的體重和免疫器官指數(shù)較NC 組顯著降低，小鼠脾臟的脾囊被破壞，生發(fā)中心離散，淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，紅、白髓邊界不清晰，組織表現(xiàn)較差，脾臟病理學(xué)特征提示存在脾臟損傷的情況。當(dāng)小鼠經(jīng)TMWE 和TMWE-CP 的持續(xù)干預(yù)，免疫器官指數(shù)均出現(xiàn)了不同程度的改善，經(jīng)TMWE 干預(yù)的小鼠胸腺指數(shù)顯著（P<0.01）高于TMWE-CP 組，所有受試組小鼠體重呈逐漸恢復(fù)趨勢(shì)，特別是TMWE-CP 組。此外，組織病理學(xué)觀察也表明，TMWE 和TMWE-CP處理可改善CTX 誘導(dǎo)的脾臟損傷，保護(hù)脾囊，促進(jìn)生發(fā)中心融合，恢復(fù)淋巴細(xì)胞數(shù)量，小鼠的脾臟組織結(jié)構(gòu)逐漸改善。另一方面，巨噬細(xì)胞是單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的重要組成部分，其通過(guò)吞噬作用吞噬病原體，并參與先天和后天免疫，而巨噬細(xì)胞吞噬能力則是評(píng)價(jià)機(jī)體的非特異性免疫功能重要檢測(cè)指標(biāo)[5]。碳廓清試驗(yàn)是檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬能力的經(jīng)典試驗(yàn)方法，它通過(guò)測(cè)定血液中碳粒的消失速率反映巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬異物的能力[24]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，灌胃TMWE 和TMWE-CP 組分均能夠預(yù)防并逆轉(zhuǎn)CTX 的免疫抑制作用，且TMWE 作用效果明顯高于TMWE-CP 組分給藥處理。綜合以上結(jié)果表明，TMWE 和TMWE-CP 的干預(yù)處理能拮抗CTX 對(duì)免疫器官的抑制作用，改善脾臟組織結(jié)構(gòu)，恢復(fù)并提升小鼠碳顆粒清除能力，增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫功能，從而提高機(jī)體的免疫力。另外，與TMWE-CP 相比，TMWE 受試干預(yù)在機(jī)體非特異性免疫方面表現(xiàn)出較優(yōu)的免疫改善效果。

DTH 和脾淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力是評(píng)價(jià)動(dòng)物體內(nèi)和體外細(xì)胞免疫的兩個(gè)重要參數(shù)。本研究采用跖骨增厚法檢測(cè)免疫抑制小鼠DTH 的程度，通過(guò)注射SRBC 致敏并激活T 淋巴細(xì)胞，使局部組織發(fā)生膨脹，以反映動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞免疫功能[29]。本研究結(jié)果表明，SRBC 致敏后，與MC 組相比，TMWE 和TMWE-CP 持續(xù)干預(yù)處理可明顯增強(qiáng)免疫抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)，且TMWE-CP 組分比TMWE 組分DTH 效果更加顯著。通常DTH 的發(fā)生與效應(yīng)T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子或細(xì)胞毒性介質(zhì)有關(guān)，由此推測(cè)，TMWE 和TMWE-CP 組分對(duì)免疫抑制小鼠DTH 的促進(jìn)作用，可能是通過(guò)促進(jìn)T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為效應(yīng)細(xì)胞及增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Con A 常作為一種非特異性促有絲分裂調(diào)節(jié)劑使用，而CTX 是一種非特異性抗有絲分裂免疫抑制劑，前者單獨(dú)作用于淋巴細(xì)胞時(shí)，可促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化，后者對(duì)T、B 淋巴細(xì)胞增殖和分化具有抑制作用，導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)和器官的損傷[22，30]，因此，本研究采用Con A 誘導(dǎo)活化免疫抑制小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，通過(guò)CCK-8 試劑盒檢測(cè)T 淋巴細(xì)胞增殖活性，結(jié)果表明TMWE 和TMWE-CP 組分均顯著增加Con A 誘導(dǎo)的T 淋巴細(xì)胞的增殖活性，與TMWE 相比，TMWE-CP 的作用效果更加顯著（P<0.05）。綜上，在細(xì)胞免疫方面，TMWE 和TMWE-CP 組分的持續(xù)干預(yù)可使細(xì)胞免疫功能顯著增強(qiáng)，且TMWECP 的DTH 和脾淋巴細(xì)胞增殖活性作用效果均顯著優(yōu)于TMWE 組分，即TMWE-CP 組分在細(xì)胞免疫方面作用效果更顯著。

免疫球蛋白是指B 細(xì)胞響應(yīng)特定抗原后增殖和分化而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，它廣泛存在于所有脊椎動(dòng)物的血液、淋巴和體液中[7]。當(dāng)受到抗原性刺激后，IgM 首先被合成并誘導(dǎo)其它免疫細(xì)胞破壞外源刺激物，其在初次免疫中占據(jù)重要地位，IgG 是免疫球蛋白中分子質(zhì)量最小和最常見(jiàn)的抗體類(lèi)型，IgG 在脾臟和淋巴結(jié)中產(chǎn)生，在激活補(bǔ)體系統(tǒng)、中和免疫反應(yīng)中的毒素方面發(fā)揮重要作用[31-32]。它們都與體液免疫密切相關(guān)。ELISA 法測(cè)定小鼠血清IgG、IgM 水平的結(jié)果表明，注射CTX 使正常小鼠的IgG、IgM 表達(dá)量下降，而TMWE 和TMWECP 組分持續(xù)干預(yù)能夠顯著增強(qiáng)CTX 免疫抑制小鼠的IgG、IgM 的表達(dá)水平，與TMWE 組分相比，TMWE-CP 能夠顯著增強(qiáng)血清IgG 的表達(dá)水平，而二者在IgM 的表達(dá)水平上作用效果無(wú)顯著性差異（P>0.05）。此外，B 淋巴細(xì)胞在受到SRBC 刺激后，在免疫抑制小鼠的體液免疫反應(yīng)中產(chǎn)生溶血素特異性抗體，且溶血素特異性抗體與體液免疫呈正相關(guān)，血清中溶血素特異性抗體的水平可以通過(guò)測(cè)定體外溶血過(guò)程中釋放的血紅蛋白量來(lái)反映出來(lái)[33]。HC50測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)TMWE 與TMWE-CP 組分持續(xù)干預(yù)顯著增加了免疫抑制小鼠的血清溶血素特異性抗體水平，二者作用效果相近（P>0.05）。綜上，TMWE 和TMWE-CP 均可有效改善CTX 處理小鼠的體液免疫功能，且以TMWE-CP 組分體液免疫改善效果較優(yōu)。

大量研究表明，食用菌多糖在一定程度上具有良好的增強(qiáng)免疫作用[14]。在本研究中，TMWE 和TMWE-CP 主要成分測(cè)定結(jié)果表明，TMWE 含有更豐富的粗多糖，但試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)TMWE-CP 特異性免疫調(diào)節(jié)作用（體液免疫和細(xì)胞免疫）優(yōu)于TMWE 組分。這可能是因?yàn)?，TMWE 組分中雖存在較多比例的粗多糖，但其生物活性與其中多糖分子的糖單元組成、糖苷鍵類(lèi)型及支鏈的長(zhǎng)度、取代度等有關(guān)[34]。另外，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和多糖在同一體系共存時(shí)，其分子間具有共價(jià)鍵與非共價(jià)鍵的相互作用，相互作用導(dǎo)致體系內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)的變化，進(jìn)而影響體系的物理化學(xué)性質(zhì)[35]。此外，提取物中蛋白質(zhì)經(jīng)人體攝入后，大多于消化道內(nèi)被酶解為小肽的形式，通過(guò)腸壁轉(zhuǎn)運(yùn)消化吸收，而氨基酸的物理化學(xué)特性（正電荷數(shù)量、疏水性和鏈長(zhǎng)等）可影響免疫效應(yīng)，如帶正電荷的肽類(lèi)似于趨化因子，與免疫細(xì)胞上的受體結(jié)合，激活免疫反應(yīng)[36-37]。所以，TMWE 與TMWE-CP 的免疫調(diào)節(jié)作用的差異可能與受試物提取分離工藝，受試物體內(nèi)消化吸收特性以及受試物所在體系中的不同成分間相互作用相關(guān)，其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究論證。

4 結(jié)論

本研究基于CTX 誘導(dǎo)免疫抑制BALB/C 小鼠模型，從非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫3 個(gè)角度評(píng)價(jià)松茸低溫水提物（TMWE）及其粗蛋白組分（TMWE-CP）的免疫調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果表明，TMWE 和TMWE-CP 組分可恢復(fù)和增強(qiáng)免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)能力，其作用表現(xiàn)在增強(qiáng)免疫抑制小鼠的免疫器官指數(shù)、碳顆粒清除能力、遲發(fā)型超敏反應(yīng)、脾淋巴細(xì)胞增殖能力及改善免疫抑制小鼠脾臟組織形態(tài)和血清免疫指標(biāo)。此外，TMWE在非特異性免疫方面具有較好的免疫調(diào)節(jié)效果，TMWE-CP 在細(xì)胞免疫和體液免疫方面的免疫調(diào)節(jié)作用較顯著，這可能與其提取分離純化工藝、體內(nèi)消化吸收特性以及其所在體系中相互作用有關(guān)。因此，關(guān)于TMWE 和TMWE-CP 組分的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，以及TMWE 和TMWE-CP 組分中主要免疫活性成分的篩選仍需進(jìn)一步的研究。本研究表明TMWE 和TMWE-CP 組分是一種具有良好開(kāi)發(fā)前景的免疫調(diào)節(jié)劑。本研究可為松茸保健食品的研發(fā)提供理論依據(jù)。