清熱利膽片HPLC 指紋圖譜建立及多成分含量測定研究*

喬曉莉，曹寧寧，王清果，劉曉軍，張海芳，肖學鳳

（1.天津市南開醫(yī)院，天津 300100；2.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津300250；3.天津中醫(yī)藥大學中藥學院，天津 301617；4.天津中醫(yī)藥大學研究生院，天津 301617）

清熱利膽片是天津市南開醫(yī)院研制的院內(nèi)中藥制劑，由茵陳、金錢草、夏枯草、大黃、黃芩、厚樸6 味藥組成。方中茵陳清利濕熱、利膽退黃，且為黃疸要藥，為君藥；金錢草利濕退黃、利尿通淋，夏枯草清肝瀉火、散結消腫，兩者合用增強組方利膽之功效，共為臣藥；大黃清熱瀉火、瀉下攻積，黃芩清熱燥濕、瀉火解毒，厚樸燥濕消痰、下氣除滿，三者共為佐藥，泄化濕熱。6 味藥共奏清熱利膽之效，臨床用于治療急性單純性和輕度化膿性膽囊炎、膽管炎，急性膽囊胰腺炎，膽道術后綜合征等，療效顯著[1]。清熱利膽片的化學成分復雜，現(xiàn)院內(nèi)制定的制劑質(zhì)量控制標準僅測定大黃素和大黃酚的含量，難以對清熱利膽片進行較為全面的評價，且目前關于清熱利膽片的報道較少，僅1 篇文獻測定了清熱利膽片中10 個成分的含量[2]。為較全面地反映清熱利膽片的內(nèi)在質(zhì)量，提高質(zhì)量評價水平，需建立一套靈敏、穩(wěn)定的清熱利膽片質(zhì)量評價方法。

中藥指紋圖譜作為中藥質(zhì)量評價的重要方法，可反映化學成分的整體組成和特征[3]，但無法在“量”上為制劑提供質(zhì)量保證，而這正是多成分定量分析的優(yōu)勢[4]。中藥指紋圖譜與多成分含量測定相結合，可更好地反映中藥制劑的內(nèi)在質(zhì)量，且近年來中藥指紋圖譜結合多成分含量測定的方法已逐漸應用于中藥制劑的質(zhì)量評價[5]。因此，本研究建立了15 批清熱利膽片的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，同時對其中14 個成分進行多成分含量測定，以期提高清熱利膽片質(zhì)量評價水平。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent1260 高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Eclipse XDB-C18色譜柱（美國Agilent 公司）；SHIMADZUAUW120D 分析天平（日本島津公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵（河南省予華儀器有限公司）；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥品 綠原酸（批號：110753-202119，純度為96.3%），蘆丁（批號：100080-201811，純度為92.4%），金絲桃苷（批號：111521-201809，純度為94.9%），迷迭香酸（批號：111871-202007，純度為98.1%），黃芩苷（批號：110715-202223，純度為97.2%），槲皮素（批號：100081-201610，純度為99.80%），蘆薈大黃素（批號：110795-201710，純度為98.3%），大黃酸（批號：110757-201607，純度為99.30%），大黃素（批號：110756-201512，純度為98.7%），和厚樸酚（批號：110730-201915，純度為99.8%），厚樸酚（批號：110729-202015，純度為99.0%），大黃酚（批號：110796-201922，純度為99.4%），大黃素甲醚（批號：110758-201817，純度為99.2%）均購自中國食品藥品檢定研究院；山奈酚（批號：520-18-3，純度為98.0%）購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈（色譜純，DIKMA 公司）；甲醇（色譜純，天津市康科德科技有限公司）；磷酸（分析純，天津市化學試劑供銷公司）；實驗用水為娃哈哈飲用純凈水，其他試劑均為分析純。15 批清熱利膽片均為天津市南開醫(yī)院研制的院內(nèi)中藥制劑，編號分別為S1～S15，具體信息見表1。

表1 清熱利膽片樣品信息Tab.1 Sample information of Qingre Lidan Tablet

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、迷迭香酸、黃芩苷、槲皮素、山奈酚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、和厚樸酚、厚樸酚、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，加甲醇配制成質(zhì)量濃度為500.33、200.79、101.49、500.52、3005.21、500.62、399.01、350.97、380.28、415.74、898.26、2002.13、967.25、246.92 μg/mL 的混合對照品溶液。測定前用甲醇稀釋0、5、10、20、40 和80 倍，得到系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。

2.1.2 清熱利膽片供試品溶液的制備 取清熱利膽片10 片，研細，取約1 g，精密稱定，置于塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（360 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性供試品及單味藥材溶液的制備 按照清熱利膽片處方制備工藝，制備茵陳、金錢草、夏枯草、大黃、黃芩、厚樸的陰性樣品，再按“2.1.2”項下方法制得各陰性供試品溶液。取各單味藥材，按“2.1.2”項下方法制備單味藥材溶液。

2.2 指紋圖譜研究

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Eclipse XDB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相：0.1%磷酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～22 min，5%～20% B；22～61 min，20%～41% B；61 ～67 min，41%～60% B；67 ～74 min，60%～66% B；74～83 min，66%～85% B；83～83.1 min，85%～5% B；83.1～86 min，5% B；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：294 nm。

2.2.2 方法學考察 1）精密度實驗。取同一份清熱利膽片（S7）按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄圖譜數(shù)據(jù)。選取黃芩苷（28 號峰）作為參照，各共有峰相對保留時間的RSD 值為0.11%～0.25%，相對峰面積的RSD 值為0.20%～0.79%，表明儀器精密度良好。

2）重復性實驗。取6 份清熱利膽片（S7）按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，記錄圖譜數(shù)據(jù)。選取黃芩苷（28 號峰）作為參照，各共有峰相對保留時間的RSD 值為0.29%～0.56%，相對峰面積的RSD 值為1.41%～2.93%，表明該方法重復性良好。

3）穩(wěn)定性實驗。取同一份清熱利膽片（S7）按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、6、8、10、24 h 進樣，記錄圖譜數(shù)據(jù)。選取黃芩苷（28 號峰）作為參照，各共有峰相對保留時間的RSD 值為0.09%～0.23%，相對峰面積的RSD 值為0.96%～1.27%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3 指紋圖譜的建立及相似度分析 取15 批清熱利膽片按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，將圖譜數(shù)據(jù)導入國家藥典委員會開發(fā)的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）進行數(shù)據(jù)匹配，以S7 為參照色譜圖，采用中位數(shù)法，時間窗寬度設為0.1 min，進行多點校正和色譜峰匹配，得到15 批樣品的指紋圖譜和對照指紋圖譜，分別見圖1 和圖2，共標定出62 個共有峰，計算15 批樣品的相似度在0.983～0.996，結果見表2。15 批清熱利膽片的指紋圖譜相似度均大于0.983，表明清熱利膽片批次間一致性良好，整體質(zhì)量穩(wěn)定。

圖1 15 批清熱利膽片HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint chromatogram of 15 batches of Qingre Lidan Tablet

圖2 清熱利膽片對照指紋圖譜Fig.2 Representative fingerprint chromatogram of Qingre Lidan Tablet

圖3 清熱利膽片樣品、混合對照品、各陰性樣品及單味藥的HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of Qingre Lidan Tablet sample，mixed reference substances，negative sample andsingle-flavor medicine

表2 15 批清熱利膽片相似度評價結果Tab.2 Similarity evaluation of 15 batches of Qingre Lidan Tablet

2.2.4 共有峰歸屬與指認 取清熱利膽片供試品溶液、混合對照品溶液、各陰性供試品及單味藥材溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，記錄圖譜數(shù)據(jù)，并對共有峰進行歸屬，其中7、12～14、16、17、32、38～40、49、50 號峰歸屬于茵陳，2、5、7、15、16、22、23、29、30、33、43 號峰歸屬于金錢草，18、20、21、24、25、53～56 號峰歸屬于夏枯草，1、3、4、8～14、34～36、38～41、44～52、58、60～62 號峰歸屬于大黃，19、26～28、32、33、37、42、43、53～56 號峰歸屬于黃芩，13～15、31、32、46、47、49～52、57、59 號峰歸屬于厚樸。經(jīng)對照品比對指認14 個色譜峰，分別為7 號峰綠原酸、16 號峰蘆丁、17 號峰金絲桃苷、25 號峰迷迭香酸、28 號峰黃芩苷、33 號峰槲皮素、43 號峰山奈酚、51 號峰蘆薈大黃素、52 號峰大黃酸、57 號峰厚樸酚、58 號峰大黃素、59 號峰厚樸酚、60 號峰大黃酚、61 號峰大黃素甲醚。

2.3 多成分含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜條件同“2.2.1”。

2.3.2 方法學考察 1）專屬性考察。取空白溶劑、混合對照品溶液、清熱利膽片樣品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，色譜圖如圖4。結果表明，混合對照品溶液與供試品溶液在相同保留時間處均有相應的色譜峰出現(xiàn)，且空白溶劑指標性成分出峰處無干擾，說明方法專屬性良好。

圖4 專屬性考察色譜圖Fig.4 Chromatograms for investigation of specificity

2）線性關系考察。取“2.1.1”項下稀釋后的系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，記錄各對照品的色譜峰面積，以色譜峰面積為縱坐標（y），各對照品濃度為橫坐標（x），繪制標準曲線，計算回歸方程，結果見表3，各對照品線性關系良好。

表3 清熱利膽片中14 個成分的線性關系考察結果Tab.3 Linear relationship of 14 components in Qingre Lidan Tablet

3）精密度實驗。取同一份清熱利膽片（S7）按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次。14 個成分峰面積的RSD 值為0.12%～0.85%，表明儀器精密度良好，符合含量測定的要求。

4）重復性實驗。取同一批清熱利膽片（S7）6 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣。14 個成分峰面積的RSD 值為1.34%～2.10%，表明該方法重復性良好，符合含量測定的要求。

5）穩(wěn)定性實驗。取同一份清熱利膽片（S7）按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、6、8、10、24 h 進樣。14 個成分峰面積的RSD 值為0.49%～1.26%，表明供試品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定，符合含量測定的要求。

6）加樣回收率實驗。取同一批已知含量的清熱利膽片（S7）6 份，每份約0.05 g，分別按樣品：對照品（1∶1）的比例加入各對照品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣。14 個成分的加樣回收率為98.97%～100.89%，RSD 值為0.37%～2.81%。

2.3.3 樣品含量測定 取15 批清熱利膽片按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，記錄14 個成分峰面積，計算其在15 批樣品中的含量，結果見表4。

表4 15 批清熱利膽片中14 種成分含量測定結果（n=3）Tab.4 Results of the 14componentscontent determinationof samples of 15 batches of Qingre Lidan Table（tn=3） mg/片

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化 清熱利膽片中化學成分復雜，主要含有酚酸類[6-7]、蒽醌類[8]、黃酮類[9-10]、酚類[11]等成分。《中國藥典》（2020 年）中，茵陳、金錢草、夏枯草、大黃、黃芩、厚樸含量測定的檢測波長分別為327、360、330、254、280、294 nm[12]，為實現(xiàn)多個成分的同時測定，本研究對檢測波長進行考察，結果發(fā)現(xiàn)在294 nm 波長下，色譜峰數(shù)量較多，且峰強度較為適中，基線相對穩(wěn)定，故選擇294 nm 作為檢測波長。另外，本研究考察了流動相（水-乙腈、水-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.1%磷酸水溶液-乙腈、0.2%磷酸水溶液-乙腈）、柱溫（30、35、40 ℃）、流動相流速（0.3、0.5、1.0 mL/min），最終確定色譜條件為乙腈-0.1%的磷酸溶液梯度洗脫，柱溫35 ℃，流速1.0 mL/min 時，色譜峰峰數(shù)較多，紫外吸收較強，峰形對稱，分離度較好，且基線較為平穩(wěn)。

3.2 指紋圖譜結果分析 15 批清熱利膽片的HPLC 指紋圖譜共確定62 個共有峰，并指認出其中14 個成分。以峰形、分離度較好的黃芩苷為參照峰，15 批清熱利膽片樣品相似度較高，各成分保留時間穩(wěn)定，表明所建立的指紋圖譜方法穩(wěn)定可靠。相似度評價結果顯示，15 批清熱利膽片的指紋圖譜相似度均大于0.983，表明清熱利膽片批次間一致性良好，化學成分基本一致，整體質(zhì)量穩(wěn)定。

3.3 指標成分的選擇 清熱利膽片由茵陳、金錢草、夏枯草、大黃、黃芩、厚樸6 味藥組成，綠原酸、槲皮素、山奈酚、迷迭香酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、黃芩苷、厚樸酚和厚樸酚分別為《中國藥典》（2020 年版）規(guī)定的6 味中藥含量測定指標成分[12]。且現(xiàn)代研究表明，以上成分具有保肝、抑制肝纖維化、促進膽汁分泌等藥理作用，如綠原酸、厚樸酚和和厚樸酚對四氯化碳（CCl4）所致肝損傷小鼠具有肝保護作用[13-14]，其中綠原酸還可通過抑制TLR4（Toll 樣受體4）/NF-κB（核因子-κB）信號通路來預防刀豆蛋白（Con A）誘導的小鼠肝炎[15]；金絲桃苷可減輕急性酒精性肝損傷小鼠的肝纖維化和損傷[16]；山奈酚可下調(diào)脂多糖誘導的Kupffer 細胞活化及HIF-1α/HK2 表達，抑制糖酵解和乳酸生成，顯著減少炎性反應和氧化應激，進而發(fā)揮肝細胞保護作用[17]；槲皮素可降低肝臟中總膽汁酸水平，同時升高血清中總膽汁酸水平[18]；蘆丁為槲皮素的一種糖苷，能夠有效改善經(jīng)前煩躁障礙肝氣逆證的情緒和軀體癥狀[19]；迷迭香酸和黃芩苷可以抑制肝星狀細胞中典型Wnt 信號介導的過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）表達，從而抑制膽汁淤積性肝纖維化[20]。研究發(fā)現(xiàn)大黃總蒽醌能夠減輕肝損傷，有效改善肝纖維化[21-22]，其中大黃素可通過調(diào)節(jié)氧化應激、減輕肝細胞凋亡從而減輕脂多糖誘導的急性肝損傷[23]；大黃酚和大黃素甲醚可減輕非酒精性肝損傷和酒精性肝損傷的肝脂肪變性[24-25]；蘆薈大黃素可減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的肝細胞脂質(zhì)代謝紊亂[26]；大黃酸抑制肝星形細胞激活，來降低膽汁淤積性肝纖維化程度[27]。因此，以上成分為清熱利膽片的保肝利膽藥效相關成分。

本研究共選擇14 個成分作為質(zhì)量控制的成分，其中綠原酸為君藥茵陳的指標成分，迷迭香酸為臣藥夏枯草的指標成分，黃芩苷為黃芩的指標成分，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚均為佐藥大黃的指標成分，厚樸酚和厚樸酚為佐藥厚樸的指標成分；槲皮素、山奈酚和蘆丁為茵陳、金錢草和夏枯草的共有成分，金絲桃苷為茵陳和夏枯草的共有成分。這14 個成分的選擇，既考慮到君臣佐的配伍意義，又兼顧保肝利膽藥效作用，提高了清熱利膽片質(zhì)量評價的水平。

3.4 含量測定結果分析 本研究通過混合對照品比對指認了14 個共有峰，分別為綠原酸、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚、蘆丁、迷迭香酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、黃芩苷、厚樸酚、和厚樸酚。在此基礎上，對指認出的成分進行含量測定，測得其平均含量分別為（0.31±0.04）（0.04±0.01）（0.25±0.02）（0.20±0.06）（0.10±0.02）（0.23±0.05）（0.17±0.01）（0.19±0.02）（0.18±0.03）（0.56±0.08）（0.14±0.02）（1.98±0.17）（1.03±0.12）（0.65±0.04）mg/片。

本研究建立的清熱利膽片HPLC 指紋圖譜及14 個成分含量測定方法穩(wěn)定可靠、操作簡便，可為清熱利膽片的質(zhì)量評價提供參考。