高效液相色譜-柱后衍生法測(cè)定白菜中7種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留方法驗(yàn)證

◎ 代升飛，李園莉，王 林，湯茶琴

（江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400）

氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥（carbamates）是20世紀(jì)40年代發(fā)現(xiàn)并發(fā)展起來(lái)的具有殺蟲(chóng)力強(qiáng)、作用迅速和對(duì)人毒性較低等高效、低毒、低殘留特點(diǎn)的農(nóng)藥[1]，是在有機(jī)磷酸酯之后發(fā)展起來(lái)的合成農(nóng)藥，其通式為RO（CO）NRR。氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥一般無(wú)特殊氣味，常用作農(nóng)藥的殺蟲(chóng)劑、除草劑、殺菌劑等，其毒理機(jī)制是抑制昆蟲(chóng)乙酰膽堿酶（Ache）和羧酸酯酶的活性，造成乙酰膽堿（Ach）和羧酸酯的積累，影響昆蟲(chóng)正常的神經(jīng)傳導(dǎo)而致死。氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥是當(dāng)前我國(guó)使用量較大的幾種殺蟲(chóng)劑之一，這類(lèi)農(nóng)藥的優(yōu)點(diǎn)是選擇性強(qiáng)、作用快速、對(duì)哺乳動(dòng)物的毒性相對(duì)較低，因此被廣泛應(yīng)用于蔬菜、水果等作物病蟲(chóng)害的防治[2]。此類(lèi)農(nóng)藥可經(jīng)呼吸道、消化道侵入機(jī)體，也可經(jīng)皮膚黏膜緩慢吸收，其在蔬菜中的殘留問(wèn)題和引發(fā)中毒的情況較為突出[3-5]。在我國(guó)無(wú)公害農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)中，禁止使用高毒的氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥，如涕滅威、克百威、滅多威等。對(duì)于這類(lèi)農(nóng)藥的殘留限量，我國(guó)已經(jīng)出臺(tái)了相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)，例如，《GB 2763—2021 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對(duì)食品中氨基甲酸酯及其衍生物做了限量要求。

伴隨最新《中華人民共和國(guó)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法》2023年1月1日施行以來(lái)，相關(guān)部門(mén)越來(lái)越重視加強(qiáng)從田間到餐桌全過(guò)程監(jiān)管和蔬菜中農(nóng)藥殘留的精準(zhǔn)檢測(cè)，檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[6-7]、液相色譜-柱后衍生法[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜法[10]和液相色譜-質(zhì)譜法[11]。本文基于對(duì)蔬菜中氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥檢測(cè)技術(shù)要求高、試劑消耗和污染大、耗時(shí)長(zhǎng)、儀器設(shè)備現(xiàn)有條件等問(wèn)題，以市場(chǎng)上最常見(jiàn)的蔬菜——白菜為試驗(yàn)樣品，選擇易于操作、效果較好的高效液相色譜-柱后延伸法進(jìn)行方法驗(yàn)證，這種方法對(duì)于氣相色譜法不能分析的高沸點(diǎn)或穩(wěn)定性差的農(nóng)藥可以進(jìn)行有效的分離檢測(cè)，特別適用于檢測(cè)氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥。總之，采用液相色譜柱后衍生技術(shù)，可以使氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥中的甲氨基團(tuán)在堿液作用下生成的甲胺與衍生試劑反應(yīng)生成一種強(qiáng)熒光物質(zhì)，在此基礎(chǔ)上，用高靈敏度的熒光檢測(cè)器可以檢測(cè)該物質(zhì)，是檢測(cè)氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥最有效、最靈敏的方法之一。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1.1 試劑與耗材

乙腈（HPLC級(jí)，德國(guó)默克公司）、甲醇（HPLC級(jí)，德國(guó)默克公司）、水（一級(jí)）、氯化鈉（優(yōu)級(jí)純，上海阿拉丁公司）、氫氧化鈉（優(yōu)級(jí)純，上海阿拉丁公司）、鹽酸（分析純，德國(guó)默克公司）、二氯甲烷（HPLC級(jí)，德國(guó)默克公司）、四硼酸鈉（CAS：1330-43-4，上海阿拉丁公司）、鄰苯二甲醛（98%）（CAS：643-79-8，上海阿拉丁公司）、2-巰基乙醇（99%）（CAS：60-24-2，上海阿拉丁公司）。供試材料為普通白菜，超市購(gòu)買(mǎi)2.5 kg；固相萃取柱：氨基柱（AminopropylR），容積6 mL，填充物500 mg；微孔有機(jī)濾膜（0.22 μm）；7種類(lèi)氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（天津阿爾塔科技有限公司）見(jiàn)表1。

表1 7種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品表

1.1.2 儀器設(shè)備

超高液相色譜儀（配有熒光檢測(cè)器和柱后衍生反應(yīng)裝置，Waters ACQUITY Arc 美國(guó)沃特世公司）、均質(zhì)器QHS-66（Labtech）、全自動(dòng)平行濃縮儀AutoEVA-60、電子天平（1%）Scout SE-SE602F［奧豪斯儀器（常州）有限公司］、渦旋混合器Mixplus（艾本森）、超聲波清洗機(jī)SB25-12DTD（寧波新芝）、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)sigma G-26C 最大轉(zhuǎn)速，26 000轉(zhuǎn)/min（賽多利斯）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters沃特世Carbamate色譜柱（3.9×150 mm）；柱流量：1.50 mL·min-1；柱溫：40 ℃；熒光檢測(cè)器（2475 FLR）：λex339 nm，λem445 nm；柱后衍生：反應(yīng)器溫度TCM：80.0 ℃；0.05 mol·L-1氫氧化鈉溶液，流速0.5 mL·min-1；OPA試劑，流速0.5 mL·min-1；溶劑梯度與流速見(jiàn)表2。

表2 溶劑梯度與流速表

1.2.2 樣品制備和提取

取白菜樣品，將其切碎，充分混勻放入食品加工器粉碎，制成待測(cè)樣。準(zhǔn)確稱(chēng)取25.0 g 試樣放入勻漿機(jī)中，加入50.0 mL 乙腈，在勻漿機(jī)中高速勻漿2 min 后用濾紙過(guò)濾，濾液收集到裝有5～7 g 氯化鈉的100 mL 具塞量筒中，收集濾液40～50 mL ，蓋上塞子，劇烈震蕩1 min，在室溫下靜置30 min，使乙腈相和水相分層。

1.2.3 試樣凈化

從100 mL具塞量筒中準(zhǔn)確吸取10.00 mL 乙腈相溶液，放入150 mL 燒杯中，將燒杯放在80 ℃水浴鍋上加熱，杯內(nèi)緩緩?fù)ㄈ氲獨(dú)?，將乙腈蒸發(fā)近干；加入2.0 mL甲醇+二氯甲燒（1+99） 溶解殘?jiān)?，蓋上鋁箔，待凈化。

將氨基柱用4.0 mL 甲醇十二氯甲燒（1+99）預(yù)洗條件化，當(dāng)溶劑液面到達(dá)柱吸附層表面時(shí)，立即加入上述待凈化溶液，用15 mL 離心管收集洗脫液，用2 mL甲醇十二氯甲燒（1+99） 洗燒杯后過(guò)柱，并重復(fù)一次。將離心管置于氮吹儀上，水浴溫度50 ℃ ，氮吹蒸發(fā)至近干，用甲醇準(zhǔn)確定容至2.5 mL。在混合器上混勻后，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

將氨基甲酸酯類(lèi)（混標(biāo)）標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解配制成10 μg·mL-1和1μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，再將儲(chǔ)備液用鹽酸調(diào)節(jié)好的酸化水（pH=3）配制成10、20 、50、100、200 μg·L-1和500 μg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)0.22 μm微孔有機(jī)濾膜過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)通過(guò)Empower軟件處理得到峰面積對(duì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 檢出限和定量測(cè)定

將配置好的7種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級(jí)稀釋后進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，通過(guò)信噪比（S∶N=3）得出本方法中7種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的最低檢出限（limit of detection，LOD），并通過(guò)信噪比（S∶N=10）得出其定量限（limit of quantitation，LOQ）[12]。

1.2.6 回收率及精密度測(cè)定

采用空白白菜基質(zhì)加標(biāo)試驗(yàn)，取不含本底的白菜樣品共18份，進(jìn)行0.01、0.05和0.10 mg·kg-13檔濃度添加回收試驗(yàn)，按試驗(yàn)方法先測(cè)定出7種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的含量，以峰面積計(jì)算7種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥在不同添加水平的回收率，計(jì)算平均添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.2.7 樣品檢測(cè)

對(duì)本次采購(gòu)的白菜樣品進(jìn)行7種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 7種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線

將配置好的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后裝瓶進(jìn)樣，上機(jī)檢測(cè)后得到色譜圖（如圖1）。運(yùn)用Empower軟件選取不同濃度的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液建立回歸方程，以標(biāo)樣濃度為橫坐標(biāo)（x），熒光響應(yīng)信號(hào)峰面積為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線性回歸分析，7種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的相關(guān)系數(shù)R2為0.999 926～0.999 977，線性良好（如表3）。

表3 7種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍表

2.2 檢出限和定量限

檢出限：添加濃度為0.01 mg·kg-1的樣品經(jīng)檢測(cè)分析后，信噪比S/N＞3，表明試驗(yàn)室檢出限可滿足實(shí)際樣品的測(cè)定。定量限：添加濃度為0.01 mg·kg-1的樣品的信噪比和定量限見(jiàn)表4，可滿足實(shí)際樣品的測(cè)定。

表4 方法檢出限和方法定量限表

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《NYT 761—2008 蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲(chóng)菊酯和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥多殘留的測(cè)定》，當(dāng)添加濃度為標(biāo)準(zhǔn)檢出限0.01 mg·kg-1時(shí)，7種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥在該儀器上的信噪比S/N大于3，可以達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限量的要求。綜合上述試驗(yàn)過(guò)程、儀器條件、試驗(yàn)結(jié)果等，該試驗(yàn)方法完全滿足7種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥日常檢測(cè)要求（如表4）。

2.3 回收率及精密度

通過(guò)0.01、0.05 mg·kg-1和0.10 mg·kg-13檔濃度添加回收試驗(yàn)，得到白菜空白基質(zhì)加標(biāo)色譜圖 （如圖2、圖3、圖4），按試驗(yàn)方法先測(cè)定出7種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的含量，以峰面積計(jì)算7種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥在不同添加水平的回收率，計(jì)算平均添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（見(jiàn)表5、表6、表7）。樣品中各組分的加標(biāo)回收率平均值范圍為75.9%～89.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為1.31%～8.72%，符合標(biāo)準(zhǔn)要求[13]。

圖2 白菜空白基質(zhì)加標(biāo)色譜圖（0.01 mg·kg-1）

圖3 白菜空白基質(zhì)加標(biāo)色譜圖（0.05 mg·kg-1）

圖4 白菜空白基質(zhì)加標(biāo)色譜圖（0.10 mg·kg-1）

表5 不含本底樣品中氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的添加回收率和精密度表（0.01 mg·kg-1）

表6 不含本底樣品中氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的添加回收率和精密度表（0.05 mg·kg-1）

表7 不含本底樣品中氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的添加回收率和精密度表（0.10 mg·kg-1）

2.4 白菜樣品檢測(cè)

由圖5、圖6、圖7可知，運(yùn)用該方法對(duì)本次采購(gòu)的3批白菜樣品進(jìn)行檢測(cè)，7種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥組分均未檢出，說(shuō)明本次采購(gòu)的白菜樣品中不含7種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥，質(zhì)量良好。

圖5 白菜樣品色譜圖（批次1）

圖6 白菜樣品色譜圖（批次2）

圖7 白菜樣品色譜圖（批次3）

3 結(jié)論

隨著人民群眾對(duì)美好生活的向往和需求的日益增長(zhǎng)，健康、安全、無(wú)農(nóng)藥殘留的放心蔬菜成為人們的飲食首選。因此，對(duì)于農(nóng)藥殘留檢驗(yàn)檢測(cè)方法的驗(yàn)證，顯得尤為重要?？偟膩?lái)說(shuō)，對(duì)于含氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的食品，需要嚴(yán)格按照我國(guó)的相關(guān)法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)來(lái)控制其使用和殘留限量，以確保食品安全。本試驗(yàn)通過(guò)高效液相色譜-柱后衍生法，分析測(cè)定了白菜中7種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥，通過(guò)白菜樣品空白加標(biāo)后對(duì)回收率進(jìn)行測(cè)定以及精密度計(jì)算來(lái)進(jìn)行方法驗(yàn)證。結(jié)果表明：7種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥加標(biāo)回收率為75.9%～89.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）范圍為1.31%～8.72%，均能滿足氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的定量檢測(cè)要求。因此，該檢測(cè)方法適用于檢測(cè)蔬菜中的氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留，可以為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全保駕護(hù)航。