HPLC法測定銀黃甘顆粒中甘草有效成分甘草酸的含量*

劉宗新，鄭雪媚，黃欽耿，蔣順進(jìn)

(1 廣東容大生物股份有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 511500；2 清遠(yuǎn)一生自然生物研究院有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 511500)

豬感冒是一種豬類的急性呼吸道器官的疾病，一年四季都可發(fā)生，多發(fā)于氣候多變的早春和深秋，仔豬、小豬更容易發(fā)生。豬感冒等呼吸道疾病對(duì)現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展有較大影響。目前，豬感冒尚無特效藥物，臨床上主要采用抗菌藥物。長期使用和濫用抗生素，易致使病原微生物發(fā)生變異，產(chǎn)生耐藥性，給后期疾病的防控帶來困難，導(dǎo)致一些疾病藥物無法治愈，甚至產(chǎn)生“超級(jí)細(xì)菌”。銀黃甘顆粒由金銀花提取物、黃芩提取物和甘草浸膏組方而成。方中金銀花為君藥，能疏散風(fēng)熱、清熱解毒；黃芩為臣藥，能增強(qiáng)金銀花清熱解毒之功效；甘草為佐使藥，能助金銀花、黃芩清熱解毒，又能祛痰止咳。黃芩過于苦寒，苦寒傷胃，而甘草具有甘緩護(hù)胃功效。三藥合用，共奏清熱、解毒、止咳之功效，主治豬外感發(fā)熱、咳嗽?，F(xiàn)代藥理研究表明，甘草含有甘草酸、甘草次酸等主要活性成分，具有鎮(zhèn)咳祛痰[1-2]、解毒[3-4]、抗炎[5-6]、抗支原體[7]、免疫功能調(diào)節(jié)[8]等藥理作用。

按照中國獸藥典要求[9]，根據(jù)甘草酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，建立測定銀黃甘顆粒中甘草酸含量的HPLC法。該方法具有定量檢測準(zhǔn)確度高、線性范圍廣、重現(xiàn)性好、分析時(shí)間短、樣品處理簡單等特點(diǎn)，為銀黃甘顆粒的質(zhì)量控制提供可靠的依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器和材料

SPD-20A液相色譜儀，日本島津；柱溫箱CTO-20AC；UPR-5T超純水儀；KQ-500DE超聲波清洗器；METTLER MS105DU天平；甘草酸銨對(duì)照品(純度93.1%，每1 mL含甘草酸銨0.2 mg，折合甘草酸為0.195 9 mg)，中國食品藥品檢定研究院；銀黃甘顆粒(水分為1.8%)，廣東容大生物股份有限公司；水為超純水，甲醇為色譜純，磷酸為AR級(jí)別。

1.2 色譜條件

流動(dòng)相：A相：乙腈；B相：0.05%磷酸溶液；按照表1進(jìn)行梯度洗脫。

表1 流動(dòng)相梯度Table 1 Mobile phase gradient

色譜柱：菲羅門 C185 μm，4.6 mm×250 mm；

檢測波長：237 nm；

流速：1.0 mL/min；

柱溫：35 ℃；

進(jìn)樣量：10 μL。

1.3 溶液的配制

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取甘草酸銨對(duì)照品20 mg，置100 mL容量瓶，加70%乙醇溶解，搖勻，過濾，即得。

1.3.2 供試品溶液的制備

取本品適量，研細(xì)，取約3.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.4 陰性干擾測定

圖1 甘草酸對(duì)照Fig.1 Glycyrrhizin control

圖2 甘草浸膏陰性樣品Fig.2 Liquorice extract negative sample

圖3 銀黃甘顆粒樣品Fig.3 Yinhuanggan particle sample

以相同的處方比例，按照銀黃甘顆粒的制備工藝，制得甘草浸膏陰性制劑。取甘草浸膏陰性顆粒適量，按1.3.2項(xiàng)下制成甘草提取物陰性顆粒溶液。進(jìn)樣測試。結(jié)果陰性溶液無干擾。證明本方法用于甘草酸的含量測定具有專屬性。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取甘草酸銨對(duì)照品54.8 mg，置50 mL量瓶中，加70%乙醇使溶解至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液；精密吸取對(duì)照品貯備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5 mL，分別置10 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。精密吸取上述溶液10 μL進(jìn)樣測定，記錄峰面積。測定結(jié)果見表2。

表2 甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度及其峰面積Table 2 Concentration and peak area of glycyrrhizic acid standard solution

圖4 甘草酸的線性曲線圖Fig.4 Linear graph of glycyrrhizic acid

以甘草酸濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖4。計(jì)算回歸方程為y=9 584x-20 215，R2=0.999 9。結(jié)果表明，在此色譜條件下，甘草酸在49.97～499.73 μg/mL范圍內(nèi)，甘草酸濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

1.6 精密度試驗(yàn)

精密稱取甘草酸銨對(duì)照品21.7 mg，按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含197.89 μg甘草酸溶液。連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果見表3。

表3 甘草酸精密度試驗(yàn)Table 3 Glycyrrhizin precision test

結(jié)果表明，甘草酸峰面積RSD值為0.3%，證明本測定方法的精密度良好。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

1.7.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定甘草酸銨對(duì)照品18.5 mg，按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含168.70 μg甘草酸溶液。

1.7.2 供試品溶液的制備

表4 甘草酸含量測定重復(fù)性試驗(yàn)Table 4 Repeatability test for determination of glycyrrhizic acid content

取銀黃甘顆粒適量，研細(xì)，按1.3.2項(xiàng)下制備供試品溶液，平行處理6份，進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計(jì)算甘草酸含量。結(jié)果見表4。

結(jié)果表明，甘草酸含量RSD為0.7%，證明本測定方法的重復(fù)性良好。

1.8 回收率試驗(yàn)

1.8.1 對(duì)照品母液配制

精密稱取甘草酸銨對(duì)照品52.4 mg，置50 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，作為甘草酸對(duì)照品母液。

1.8.2 對(duì)照品溶液配制

精密量取5 mL對(duì)照品母液至25 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，過濾，即得。

取銀黃甘顆粒適量，研細(xì)，取約1.75 g，精密稱定，共計(jì)6份，分別置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇45 mL，精密加入甘草酸銨對(duì)照品母液5 mL，稱定重量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按甘草酸含量測定項(xiàng)下方法操作，記錄峰面積，計(jì)算甘草酸含量。結(jié)果見表5。

結(jié)果表明，甘草酸回收率的平均值為100.3%，RSD為0.8%，本方法回收率較好。

表5 甘草酸含量測定回收率試驗(yàn)Table 5 Glycyrrhizic acid content determination recovery test

1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取銀黃甘顆粒供試品溶液，在室溫條件下放置，分別在0、2、4、6、8、12、24 h，進(jìn)樣測定，記錄峰面積，結(jié)果見表6。

表6 甘草酸含量測定穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 6 Stability test for determination of glycyrrhizic acid content

結(jié)果顯示，不同時(shí)間點(diǎn)甘草酸峰面積RSD為0.4%，表明本品供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定。

1.10 甘草酸測定方法的耐用性研究

本試驗(yàn)考察色譜柱溫度、流動(dòng)相流速、流動(dòng)相比例和波長的微小變化及不同品牌色譜柱對(duì)銀黃甘顆粒中甘草酸含量的影響。

1.10.1 不同的色譜柱溫度

(1)對(duì)照品溶液的制備：精密稱定甘草酸銨對(duì)照品18.4 mg，按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含167.79 μg甘草酸對(duì)照溶液。

(2)供試品溶液的制備：取銀黃甘顆粒，按1.3.2項(xiàng)下制備銀黃甘顆粒供試品溶液。

在其它色譜條件不變的情況下，色譜柱溫度分別設(shè)定為25、30、35 ℃，對(duì)同一樣品進(jìn)行含量測定，記錄峰面積，計(jì)算甘草酸含量，結(jié)果如表7所示。

結(jié)果表明，柱溫的微小變化對(duì)甘草酸含量無明顯影響。

表7 色譜柱溫度對(duì)甘草酸含量測定的影響Table 7 Influence of column temperature on determination of glycyrrhizic acid content

1.10.2 不同的流速

(1)對(duì)照品溶液的制備：精密稱定甘草酸銨對(duì)照品19.6 mg，按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含178.74 μg甘草酸對(duì)照溶液。

(2)供試品溶液的制備：取銀黃甘顆粒，按1.3.2項(xiàng)下制備銀黃甘顆粒供試品溶液。

在其它色譜條件不變的情況下，流動(dòng)相流速分別設(shè)定為0.8、1.0、1.2 mL/min，對(duì)同一樣品進(jìn)行含量測定，記錄峰面積，計(jì)算甘草酸含量，結(jié)果如表8所示。

表8 流動(dòng)相速度對(duì)甘草酸含量測定的影響Table 8 Effect of mobile phase velocity on determination of glycyrrhizic acid content

結(jié)果表明，流動(dòng)相速度的微小變化對(duì)甘草酸含量無明顯影響。

1.10.3 不同的流動(dòng)相比例

(1)對(duì)照品溶液的制備：取甘草酸銨對(duì)照品19.6 mg，按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含178.74 μg甘草酸對(duì)照溶液。

(2)供試品溶液的制備：取銀黃甘顆粒，按1.3.2項(xiàng)下制備銀黃甘顆粒供試品溶液。

在其它色譜條件不變的情況下，分別以原流動(dòng)相比例、表9、表10改變流動(dòng)相比例，對(duì)同一樣品進(jìn)行含量測定，記錄峰面積，計(jì)算甘草酸含量，結(jié)果如表9～表11所示。

表9 甘草測試流動(dòng)相向左平移-5%(有機(jī)相減小)Table 9 Liquorice test mobile phase shift to the left -5% (organic phase reduction)

表11 不同色譜流動(dòng)相比例對(duì)甘草酸含量測定的影響Table 11 Influence of different proportion of mobile phase on determination of glycyrrhizic acid

以乙腈為流動(dòng)相A，0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相B；分別按照原組成及下表進(jìn)行梯度洗脫。

結(jié)果表明，流動(dòng)相比例的微小變化對(duì)甘草酸含量無明顯影響。

1.10.4 不同品牌的色譜柱

(1)對(duì)照品溶液的制備：取甘草酸銨對(duì)照品19.4 mg，精密稱定，按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含176.91 μg甘草酸對(duì)照溶液。

(2)供試品溶液的制備：取銀黃甘顆粒，按1.3.2項(xiàng)下制備銀黃甘顆粒供試品溶液。

在其它色譜條件不變的情況下，分別以WR、superb、Boston色譜柱，對(duì)同一樣品進(jìn)行含量測定，記錄峰面積，計(jì)算甘草酸含量，結(jié)果如表12所示。

表12 不同色譜柱對(duì)甘草酸含量測定的影響Table 12 Influence of different chromatographic columns on determination of glycyrrhizic acid content

結(jié)果表明，不同品牌色譜柱對(duì)甘草酸含量無明顯影響。

1.10.5 不同的測定波長

(1)對(duì)照品溶液的制備：取甘草酸銨對(duì)照品19.4 mg，按1.3.1項(xiàng)下制成每1 mL含176.91 μg甘草酸對(duì)照溶液。

(2)供試品溶液的制備：取銀黃甘顆粒，按1.3.2項(xiàng)下制備銀黃甘顆粒供試品溶液。

在其它色譜條件不變的情況下，測定波長分別設(shè)定為234、235、236、237、238、239 nm，對(duì)同一樣品進(jìn)行含量測定，記錄峰面積，計(jì)算甘草酸含量，結(jié)果如表13所示。

表13 測定波長對(duì)甘草酸含量測定的影響Table 13 Influence of wavelength on determination of glycyrrhizin content

結(jié)果表明，測定波長的微小變化對(duì)甘草酸含量無明顯影響。

2 結(jié) 論

采用本方法能準(zhǔn)確測定銀黃甘顆粒中甘草酸含量，方法耐用性良好。本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法測銀黃甘顆粒中甘草有效成分甘草酸的含量。測定色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動(dòng)相A，0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相B；按照梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為237 nm。該方法定量檢測準(zhǔn)確度高、線性范圍廣、重現(xiàn)性好、分析時(shí)間短、樣品處理簡單，為銀黃甘顆粒質(zhì)量控制提供了依據(jù)。