周晨明，薛巖，孟麗，朱艷，徐彥楠

1 河北醫(yī)科大學(xué)大型科研儀器設(shè)備共享服務(wù)平臺(tái)，石家莊050017；2 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；3 河北醫(yī)科大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心

糖尿病是由于胰島素分泌和（或）胰島素作用缺陷引起的代謝紊亂，患者以高血糖、高血脂和負(fù)氮平衡為主要表現(xiàn)［1］。糖尿病周圍神經(jīng)病是糖尿病常見(jiàn)的并發(fā)癥，其發(fā)病與節(jié)段性脫髓鞘、軸索損傷有關(guān)，是引起患者下肢截肢、殘疾和神經(jīng)性疼痛的重要原因［2］。施萬(wàn)細(xì)胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)較為豐富的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，構(gòu)成血液—神經(jīng)界面，不僅是軸突的被動(dòng)絕緣體，還可動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)神經(jīng)纖維的生物學(xué)特性，為軸突提供代謝支持，調(diào)節(jié)外周神經(jīng)功能［3-4］。施萬(wàn)細(xì)胞功能障礙在糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［5］。自噬通過(guò)回收受損的細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊的蛋白，能夠維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞正常的生長(zhǎng)與功能［6］。凋亡信號(hào)通過(guò)多種途徑驅(qū)動(dòng)細(xì)胞死亡，如線粒體控制信號(hào)途徑、死亡受體連接信號(hào)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的信號(hào)通路如JAK-STAT通路、ROS/PI3K/AKT通路等［7］。在高糖誘導(dǎo)的施萬(wàn)細(xì)胞中，抗凋亡因子Bcl-2下調(diào)，促凋亡因子Bax上調(diào)，細(xì)胞色素C釋放［8］，凋亡和自噬增強(qiáng)［9］。細(xì)胞代謝異常導(dǎo)致活性氧（ROS）累積，易引起凋亡相關(guān)基因表達(dá)，激活細(xì)胞凋亡程序。PI3K/AKT信號(hào)通路參與細(xì)胞存活、周期、凋亡和物質(zhì)代謝等生物學(xué)過(guò)程，與多種腫瘤細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)［10］。本課題組對(duì)高糖刺激的大鼠施萬(wàn)細(xì)胞RSC96進(jìn)行轉(zhuǎn)錄測(cè)序，發(fā)現(xiàn)高糖能下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶復(fù)合物缺氧上調(diào)基因1（HYOU1）的表達(dá)。HYOU1屬于HSP70家族，應(yīng)激狀態(tài)如缺氧可導(dǎo)致HYOU1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)大量聚集，參與蛋白質(zhì)的折疊和分泌［11］。有研究發(fā)現(xiàn)，HYOU1可保護(hù)缺氧環(huán)境下的神經(jīng)元細(xì)胞，其機(jī)制與抑制凋亡有關(guān)［12］。2022年5月—2023年6月，本研究觀察了HYOU1對(duì)高糖環(huán)境施萬(wàn)細(xì)胞自噬和凋亡的影響，并基于凋亡相關(guān)通路探討相關(guān)機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實(shí)驗(yàn)材料 原代大鼠施萬(wàn)細(xì)胞株RSC96購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。細(xì)胞復(fù)蘇后置于DMEM培養(yǎng)基中，放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；待細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)，加入0.05%胰蛋白酶消化，完成傳代培養(yǎng)，取第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。兔抗HYOU1抗體購(gòu)自Abcam公司，小鼠抗GAPDH抗體購(gòu)自Proteintech公司，RIPA強(qiáng)效裂解液購(gòu)自上海碧云天公司。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自南京凱基公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo公司，SYBR Green PCR試劑盒購(gòu)自Thermo公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo公司，超凈工作臺(tái)（型號(hào)SW-CJ-1FD）購(gòu)自于蘇州安泰科技有限公司，電泳儀（型號(hào)Mini Protean 3 Cell）購(gòu)自Bio-Rad公司，酶標(biāo)儀（型號(hào)MK3）購(gòu)自Thermo公司。

1.2 HYOU1重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)設(shè)計(jì)的HYOU1擴(kuò)增引物，以人胎腦cDNA文庫(kù)中的cDNA為模板，以PCR方法擴(kuò)增HYOU1全長(zhǎng)基因序列。對(duì)擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，以Lambda DNA EcoRⅠ/Hind Ⅲ標(biāo)記為DNA相對(duì)分子質(zhì)量，預(yù)期獲得大小約為1 785 bp的HYOU1序列全長(zhǎng)。將pEG-FP-C1載體和HYOU1 PCR片段分別采用Bg1Ⅱ和EcoRⅠ雙酶切后，以凝膠回收純化產(chǎn)物。將兩個(gè)片段采用T4 DNA連接酶于16 ℃過(guò)夜連接；取5 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌中，于37 ℃下過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落，接種在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中。將充足質(zhì)粒pEGFP-HYOU1到Invitrogen公司完成序列分析。

1.3 細(xì)胞分組及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 取第三代RSC96細(xì)胞，制成單細(xì)胞原液，采用10.0%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，以1×104/mL接種于96培養(yǎng)板中。采用隨機(jī)數(shù)字表法將細(xì)胞分為高糖組、高糖+對(duì)照質(zhì)粒組和高糖+HYOU1質(zhì)粒組。三組均采用高糖培養(yǎng)，其中高糖+對(duì)照質(zhì)粒組和高糖+HYOU1質(zhì)粒組分別轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒和pEGFP-HYOU1質(zhì)粒，根據(jù)Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明進(jìn)行操作。采用免疫熒光法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HYOU1蛋白，高糖組、高糖+對(duì)照質(zhì)粒組只見(jiàn)藍(lán)色熒光的胞核、胞質(zhì)未見(jiàn)紅色熒光，高糖+HYOU1質(zhì)粒組胞質(zhì)中可見(jiàn)紅色熒光，說(shuō)明高糖+HYOU1質(zhì)粒組細(xì)胞中有HYOU1蛋白表達(dá)。見(jiàn)OSID碼圖1。各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h進(jìn)行后續(xù)操作。

1.4 自噬相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、ATG5、ATG12、Beclin1、p62［11］。預(yù)冷PBS并洗滌組織1次，加入200 μL的RIPA裂解液，剝離勻漿器勻漿；于冰上裂解蛋白10 min，4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，將離心后的上清分裝到0.5 mL的離心管中。根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)完成蛋白濃度的測(cè)定。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉后，采用TBST將一抗按比例稀釋，將膜與一抗孵育，于4 ℃下過(guò)夜；采用TBST稀釋HRP標(biāo)記的二抗，將稀釋的二抗與膜孵育45 ～ 60 min；將膜置于凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行發(fā)光等操作，采用凝膠圖像分析軟件測(cè)定各蛋白條帶的灰度值。以β-actin為內(nèi)參。以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞凋亡指標(biāo)檢測(cè) 各組培養(yǎng)48 h后加入胰蛋白酶完成細(xì)胞消化，2 000 r/min離心5 min，預(yù)冷PBS清洗2次，重懸細(xì)胞；避光加入Annexin V-FITC 5 μL，輕輕混合均勻后，孵育15 min，加入PI 5 μL，輕輕混合均勻后，孵育5 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞，計(jì)算總凋亡率。總凋亡率=早期細(xì)胞凋亡率+中晚期細(xì)胞凋亡率。采用RT-PCR法檢測(cè)Bax、Bcl-2 mRNA。

1.6 JAK/STAT通路相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)JAK/STAT通路相關(guān)蛋白JAK1、JAK2、STAT1、STAT3、STAT5、STAT6。

1.7 ROS/PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白檢測(cè) 通過(guò)Western blotting法檢測(cè)PI3K、AKT、mTOR、pPI3K、pAKT、pmTOR蛋白。采用DCFH-DA染色檢測(cè)各組ROS水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較 高糖+HYOU1質(zhì)粒組LC3、ATG5、ATG12、Beclin1蛋白表達(dá)低于高糖組和高糖+對(duì)照質(zhì)粒組，p62蛋白表達(dá)高于高糖組和高糖+對(duì)照質(zhì)粒組（P均＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較（）

表1 各組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)比較（）

注：與高糖組相比，*P＜0.05；與高糖+對(duì)照質(zhì)粒組相比，#P＜0.05。

組別高糖+HYOU1質(zhì)粒組高糖+對(duì)照質(zhì)粒組高糖組p62 2.50 ± 0.59*#2.48 ± 0.57 1.12 ± 0.19 LC3 1.29 ± 0.23*#2.73 ± 0.61 2.75 ± 0.63 ATG5 0.86 ± 0.14*#2.89 ± 0.64 2.90 ± 0.66 ATG12 0.95 ± 0.17*#2.71 ± 0.58 2.73 ± 0.60 Beclin1 0.93 ± 0.16*#2.43 ± 0.54 2.45 ± 0.56

2.2 各組凋亡率、凋亡相關(guān)基因、JAK/STAT通路蛋白表達(dá)比較 高糖+HYOU1質(zhì)粒組凋亡率、Bax mRNA表達(dá)低于高糖組和高糖+對(duì)照質(zhì)粒組，Bcl-2 mRNA表達(dá)高于高糖組和高糖+對(duì)照質(zhì)粒組（P均＜0.05），見(jiàn)表2。高糖+HYOU1質(zhì)粒組JAK1、JAK2、STAT1、STAT3、STAT5、STAT6蛋白表達(dá)高于高糖組和高糖+對(duì)照質(zhì)粒組（P均＜0.05），見(jiàn)表3。

表2 各組細(xì)胞凋亡率、凋亡相關(guān)基因表達(dá)比較（）

表2 各組細(xì)胞凋亡率、凋亡相關(guān)基因表達(dá)比較（）

注：與高糖組相比，*P＜0.05；與高糖+對(duì)照質(zhì)粒組相比，#P＜0.05。

Bcl-2 0.78 ± 0.09*#0.51 ± 0.16 0.48 ± 0.17組別高糖+HYOU1質(zhì)粒組高糖+對(duì)照質(zhì)粒組高糖組細(xì)胞凋亡率（%）4.33 ± 0.45*#23.26 ± 2.72 25.39 ± 3.51 Bax 0.34 ± 0.09*#0.58 ± 0.11 0.60 ± 0.12

表3 各組細(xì)胞中JAK/STAT通路蛋白表達(dá)比較（）

表3 各組細(xì)胞中JAK/STAT通路蛋白表達(dá)比較（）

注：與高糖組相比，#P＜0.05；與高糖+對(duì)照質(zhì)粒組相比，*P＜0.05。

組別高糖+HYOU1質(zhì)粒組高糖+對(duì)照質(zhì)粒組高糖組STAT6 1.85 ± 0.36*#0.74 ± 0.12 0.76 ± 0.14 JAK1 2.15 ± 0.52*#0.81 ± 0.16 0.83 ± 0.18 JAK2 1.97 ± 0.27*#0.98 ± 0.21 1.00 ± 0.23 STAT1 2.06 ± 0.54*#1.25 ± 0.36 1.26 ± 0.38 STAT3 2.21 ± 0.56*#1.68 ± 0.42 1.70 ± 0.44 STAT5 2.11 ± 0.48*#1.18 ± 0.25 1.20 ± 0.26

2.3 各組細(xì)胞中ROS/PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 高糖+HYOU1質(zhì)粒組PI3K、AKT、mTOR、pPI3K、pAKT、pmTOR蛋白表達(dá)高于高糖組和高糖+對(duì)照質(zhì)粒組，ROS水平低于高糖組和高糖+對(duì)照質(zhì)粒組（P均＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞中ROS/PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)比較（）

表4 各組細(xì)胞中ROS/PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)比較（）

注：與高糖組相比，*P＜0.05；與高糖+對(duì)照質(zhì)粒組相比，#P＜0.05。

組別高糖+HYOU1質(zhì)粒組高糖+對(duì)照質(zhì)粒組高糖組pmTOR 1.77 ± 0.43*#1.18 ± 0.36 1.17 ± 0.34 ROS 1.55 ± 0.23*#7.24 ± 0.27 6.32 ± 0.42 PI3K 1.58 ± 0.31*#0.79 ± 0.16 0.81 ± 0.18 AKT 1.94 ± 0.46*#0.84 ± 0.19 0.86 ± 0.21 mTOR 0.95 ± 0.14*#0.89 ± 0.24 0.91 ± 0.26 pPI3K 1.43 ± 0.36*#1.01 ± 0.29 1.03 ± 0.31 pAKT 1.82 ± 0.46*#1.14 ± 0.32 1.13 ± 0.31

3 討論

研究表明，糖尿病周圍神經(jīng)病的發(fā)病與長(zhǎng)期高糖狀態(tài)使外周神經(jīng)長(zhǎng)期受到氧化應(yīng)激刺激有關(guān)［13］。施萬(wàn)細(xì)胞作為周圍神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，能直接參與人體周圍神經(jīng)的形成及發(fā)育過(guò)程，在修復(fù)受損神經(jīng)中發(fā)揮了重要的作用。有研究表明，長(zhǎng)期糖尿病狀態(tài)可導(dǎo)致施萬(wàn)細(xì)胞凋亡［14］。此外，高糖刺激下的施萬(wàn)細(xì)胞凋亡隨著炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)而加?。?5］。施萬(wàn)細(xì)胞凋亡是糖尿病周圍神經(jīng)病變的重要病理特征。本課題組對(duì)高糖刺激的大鼠施萬(wàn)細(xì)胞（RSC96）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，差異基因的富集分析顯示，富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶復(fù)合物的差異基因與正常糖組相比均出現(xiàn)下調(diào)，其中包括HYOU1。因此推測(cè)高糖誘導(dǎo)施萬(wàn)細(xì)胞的自噬抑制與調(diào)亡可能與HYOU1下調(diào)有關(guān)。本研究中，高糖+HYOU1質(zhì)粒組自噬相關(guān)蛋白LC3、ATG5、ATG12、Beclin1表達(dá)低于高糖組和高糖+對(duì)照質(zhì)粒組，p62表達(dá)高于高糖組和高糖+對(duì)照質(zhì)粒組，細(xì)胞凋亡率低于高糖組和高糖+對(duì)照質(zhì)粒組，這表明HYOU1施萬(wàn)細(xì)胞高表達(dá)后，能降低高糖狀態(tài)下施萬(wàn)細(xì)胞的自噬水平并抑制細(xì)胞凋亡。分析原因：HYOU1是粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的重要組成成分，主要由分子伴侶、輔助分子和蛋白修飾酶構(gòu)成。越來(lái)越多的研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶復(fù)合物異常與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生有關(guān)。持續(xù)的高糖狀態(tài)能引起HYOU1表達(dá)下調(diào)，而上調(diào)HYOU1表達(dá)能為糖尿病周圍神經(jīng)病治療提供新的思路和方法［16］。

施萬(wàn)細(xì)胞的自噬及凋亡的發(fā)生常伴有相關(guān)信號(hào)通路的共同參與，如JAK/STAT通路。細(xì)胞內(nèi)一類分子JAK在接受上游受體分子信號(hào)后，能迅速募集于受體上并發(fā)生活化，而活化JAK催化受體后能發(fā)生酪氨酸磷酸化，并激活STAT3，被激活的兩個(gè)STAT分子形成二聚體并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并與細(xì)胞核中靶基因啟動(dòng)子中的DNA特異性結(jié)合，進(jìn)而對(duì)其下游靶基因進(jìn)行調(diào)控［17］。有研究發(fā)現(xiàn)，在1型糖尿病大鼠模型的背根神經(jīng)節(jié)，失調(diào)的JAK/STAT通路傳導(dǎo)可導(dǎo)致感覺(jué)神經(jīng)元中線粒體功能障礙，引起大鼠坐骨神經(jīng)的沃勒變性［13］。也有研究表明，睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可通過(guò)JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)使受損的線粒體生物能量正?；鰪?qiáng)軸突再生和防止糖尿病纖維變性的能力［16］。Bax和Bcl-2是調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程中的重要因子。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被激活，能促進(jìn)凋亡蛋白Bax的活性，使線粒體膜的通透性增加，大量細(xì)胞色素C穿過(guò)膜組織進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，激活細(xì)胞的凋亡途徑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究中，高糖+HYOU1質(zhì)粒組JAK/STAT通路相關(guān)蛋白JAK1、JAK2、STAT1、STAT3、STAT5、STAT6表達(dá)高于高糖組和高糖+對(duì)照質(zhì)粒組；高糖+HYOU1質(zhì)粒組與高糖組和高糖+對(duì)照質(zhì)粒組相比，Bax mRNA表達(dá)降低、Bcl-2 mRNA表達(dá)升高，進(jìn)一步驗(yàn)證了HYOU1高表達(dá)能夠抑制高糖狀態(tài)下施萬(wàn)細(xì)胞的自噬和凋亡。

ROS是機(jī)體受到刺激時(shí)產(chǎn)生的一組不穩(wěn)定、含氧的活性分子化合物的統(tǒng)稱，具有較高的化學(xué)活性，對(duì)生物體及細(xì)胞的生理活動(dòng)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)機(jī)體處于生理狀態(tài)下且無(wú)外界刺激時(shí)，ROS生成量較少，當(dāng)細(xì)胞代謝異常產(chǎn)生大量活性氧超過(guò)抗氧化系統(tǒng)的還原能力時(shí)，細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，易引起凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，繼而激活細(xì)胞凋亡程序［18］。ROS/PI3K/AKT通路可以調(diào)控炎癥因子的釋放、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和自噬，在糖尿病的發(fā)生展過(guò)程中起重要作用。有研究表明糖尿病周圍神經(jīng)病中施萬(wàn)細(xì)胞的PI3K/AKT通路被明顯抑制［19］，在高糖環(huán)境下，施萬(wàn)細(xì)胞中磷酸化AKT表達(dá)顯著降低，AKT活化抑制［20］。本研究結(jié)果顯示，高糖+HYOU1質(zhì)粒組ROS水平低于高糖組和高糖+對(duì)照質(zhì)粒組，而PI3K、AKT、mTOR、pPI3K、pAKT、pmTOR蛋白表達(dá)高于高糖組和高糖+對(duì)照質(zhì)粒組，提示HYOU1過(guò)表達(dá)后，能激活糖尿病施萬(wàn)細(xì)胞中的ROS/PI3K/AKT通路，影響相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的自噬和凋亡。

綜上所述，HYOU1過(guò)表達(dá)可下調(diào)高糖環(huán)境施萬(wàn)細(xì)胞的自噬和凋亡，可能與調(diào)控ROS/PI3K/AKT通路有關(guān)，以上結(jié)果為糖尿病周圍神經(jīng)病的防治提供了一定理論基礎(chǔ)。