液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法檢測保健食品中6 種人參皂苷含量的方法研究

黃 南，項(xiàng)睿潔，蘇 敏，陳曉雅，王 輝，楊天明，徐聰玲，孟 奇，陸梅陽

（浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司，浙江杭州 311500）

0 引言

日常檢測中，保健食品中人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1 等6 種化合物的含量較高[1]，檢測頻率較高，目前人參皂苷的測定方法通常只針對某些特定的人參皂苷化合物，以高效液相色譜為主[2]，保健食品成分復(fù)雜，未凈化對檢測結(jié)果影響較大，分離時(shí)間過長[3]。擬采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，以期實(shí)現(xiàn)6 種人參皂苷主要成分的快速分離和準(zhǔn)確定量。

1 方法簡述

1.1 儀器與試劑

AB 3500 液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀，配電噴霧（ESI） 離子源。

DV215CD 型電子分析天平，感量為0.000 01 g；CP1502 型電子天平，感量為0.01 g；渦旋混合器：IKA VORTEX GENI；DH5B 型臺式離心機(jī)；HSCZY400 型氮吹儀；乙腈（CH3CN）：色譜級；甲醇（CH3OH）：色譜純；甲酸（HCOOH）：色譜純；乙酸銨（CH3COONH4）：分析純；人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1 等6 種標(biāo)準(zhǔn)品，均購自壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司（純度≥99.0%）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液

精密稱取上述6 種標(biāo)準(zhǔn)品適量，甲醇溶解，配置成質(zhì)量濃度1 000 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃條件下避光保存。12 個月內(nèi)有效。

1.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液

分別量取人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液各0.500 mL 于50.00 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，配置成質(zhì)量濃度10 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。

1.2.3 混合工作液

吸取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液適量用30%甲醇水配置成5.00～500 ng/mL 不同質(zhì)量濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，臨用新配。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 提取

（1） 固態(tài)試樣。稱取膠囊內(nèi)容物/研磨成粉的片劑0.5 g（精確至0.01 g），于50 mL 塑料離心管中，加入2/5 體積超純水，渦旋30 s 混勻，超聲提取20 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心2 min，將上述上清液移取至50 mL 容量瓶中，殘?jiān)?5 mL 超純水二次提取，合并提取液置容量瓶中，超純水定容到刻度線，混至均勻，等待下一步操作（凈化）。

（2） 液態(tài)試樣。稱取2 g（精確至0.01 g） 試樣，于50 mL 塑料離心管中，加入3/5 體積超純水，30 s渦旋混勻，置于超聲儀中提取15～20 min，超純水定容到刻度線，混至均勻，等待下一步操作（凈化）。

1.3.2 凈化

取活化好的固相萃取柱，準(zhǔn)確移取2.0 mL 樣品提取液上柱，20 mL 水分2 次淋洗去除水溶性雜質(zhì)，待液體流干后，以70%的乙醇水溶液20 mL 進(jìn)行洗脫，收集全部洗脫液，最終30%甲醇- 水定容至25.00 mL，混勻后過0.22 μm 混合濾膜，上機(jī)待測。如果樣品中人參皂苷質(zhì)量濃度超出線性范圍，可稀釋至線性范圍內(nèi)再次進(jìn)樣。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Aglient C18柱（2.0 mm×100 mm，1.9 μm）；流速0.25 mL/min；溫度40 ℃；進(jìn)樣量2 μL；流動相：A：0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸銨溶液B：CH3CN。

液相色譜梯度洗脫條件見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI-）。

負(fù)模式：電離模式ESI；檢測方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）；氣簾氣壓力（CUR） 為10.0 psi；碰撞氣（CAD） 為medium；離子化電壓（IS） 為-5 000.0 V；霧化溫度（TEM） 為500.0 ℃；霧化氣（GS1） 為50.0 psi；輔助氣（GS2） 為50.0 psi；入口電壓（EP） 為-10.0 V；出口電壓（CXP） 為-10.0 V。

6 種化合物定性、定量離子和質(zhì)譜分析參數(shù)參考值見表2。

表2 6 種化合物定性、定量離子和質(zhì)譜分析參數(shù)參考值

2 結(jié)果與分析

2.1 提取和凈化條件的優(yōu)化

選擇提取液的重要參考是人參皂苷的溶解性，一般提取人參皂苷的提取液有水飽和的正丁醇溶液、50%甲醇水、無水乙醇和超純水等[4]。選取一個標(biāo)示6 種人參皂苷均有的保健食品，在其余條件不變的情況下用上述4 種提取液分別進(jìn)行提取，每種提取液進(jìn)行3 組平行試驗(yàn)，取其平均值對比4 種經(jīng)典提取液的提取效率。試驗(yàn)結(jié)果表明，4 種不同提取液對6 種人參皂苷的提取效率差距較小?？紤]到經(jīng)濟(jì)實(shí)用及操作方便的情況，最終選擇超純水作為提取溶劑。

不同提取溶液提取率比較見圖1。

圖1 不同提取溶液提取率比較

保健食品天然成分較多，化合物種類相對復(fù)雜，選取合適的凈化方式，可以有效地減少無關(guān)組分對目標(biāo)化合物的干擾，延長色譜柱的使用壽命。因此，前處理的關(guān)鍵步驟之一為對提取液進(jìn)行有效的凈化與富集。SPE 提取凈化方法中，常用的固相萃取柱有C18及HLB 固相萃取柱[5]。試驗(yàn)樣品選取保健品中較為常見的膠囊（內(nèi)容物為粉末） 作為研究對象，考查同一樣品、單一變量（固相萃取方式） 的凈化效果，以樣品的回收率與基質(zhì)效應(yīng)（ME）作為指征，其中ME 以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線各質(zhì)量濃度點(diǎn)的響應(yīng)值與混合標(biāo)準(zhǔn)工作液中相應(yīng)濃度點(diǎn)的響應(yīng)值計(jì)算，ME 值越接近100%，說明基質(zhì)效應(yīng)越低。比較C18、HLB、Alumina-N/XAD-2 3 種不同固相萃取柱的凈化效果。

不同SPE 凈化效果比較見圖2，不同SPE 對回收率的影響見圖3。

圖2 不同SPE 凈化效果比較

圖3 不同SPE 對回收率的影響

由圖2 可知，C18和HLB 柱凈化后6 種目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)遠(yuǎn)高于Alumina-N/XAD-2 型大孔吸附樹脂復(fù)合固相萃取柱，這2 種固相萃取柱的回收率與Alumina-N/XAD-2 型大孔吸附樹脂復(fù)合固相萃取柱相比并沒有明顯的優(yōu)勢（見圖3）。故該試驗(yàn)采用的凈化柱為Alumina-N/XAD-2 型大孔吸附樹脂復(fù)合固相萃取柱。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

6 種人參皂苷的分子結(jié)構(gòu)相類似，其中人參皂苷Rc 與Rb2 互為同分異構(gòu)體，分子結(jié)構(gòu)相同，存在的區(qū)別只在空間結(jié)構(gòu)上，在色譜柱上的保留時(shí)間非常的接近，色譜分離時(shí)，各物質(zhì)色譜峰分離度≥1.2 定量更加準(zhǔn)確[6]。該研究采用Aglient C18柱（2.0 mm×100 mm，1.9 μm），流速0.25 mL/min，對梯度洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化，使人參皂苷Rb2 和Rc 實(shí)現(xiàn)了完全分離，其余4 種目標(biāo)物也較好地得到了分離。試驗(yàn)同時(shí)考查了同等條件下甲醇- 水和乙腈- 水體系流動相對6 種目標(biāo)物質(zhì)的分離效果。結(jié)果表明，甲醇-水體系流動相在洗脫能力方面不及乙腈- 水體系，且在乙腈- 水體系下目標(biāo)物擁有更加對稱的峰形。優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)乙腈- 水流動相中加入甲酸可以有效提高皂苷物質(zhì)的響應(yīng)信號，加入適量的乙酸銨，不僅增強(qiáng)了流動相的洗脫能力，同時(shí)目標(biāo)物的峰形得到了有效改善。試驗(yàn)優(yōu)化了甲酸、乙酸銨的添加量，最終確定濃度為5 mmol/L 的0.1%甲酸- 乙酸銨溶液- 乙睛流動相作為最終流動相，其他試驗(yàn)條件不變，該流動相下目標(biāo)物洗脫的更完全，同時(shí)信號強(qiáng)度在一定程度上也得到了增強(qiáng)。

2.3 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

質(zhì)譜條件的優(yōu)化用直接接二通方式進(jìn)行，用0.25 mL/min 的流速將人參皂苷6 種化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液注入電噴霧離子源，根據(jù)總離子流響應(yīng)值和分子離子峰響應(yīng)值的強(qiáng)度確定最佳質(zhì)譜參數(shù)，主要優(yōu)化參數(shù)為DP 與CE，該試驗(yàn)首先對目標(biāo)物進(jìn)行Q1 掃描，得到母離子質(zhì)量數(shù)，優(yōu)化DP，保證母離子的傳輸效率；對母離子碰撞后，進(jìn)行Q3 掃描，得到子離子質(zhì)譜圖[7]，優(yōu)化碰撞能，然后在MRM 模式下使用優(yōu)化好的DP 和CE 進(jìn)行測試，再進(jìn)一步優(yōu)化毛細(xì)管電壓，霧化器壓力，干燥器溫度和流速等質(zhì)譜參數(shù)使離子化效率達(dá)到最佳。

6 種人參皂苷化合物多反應(yīng)監(jiān)測（MRM） 模式下色譜圖見圖4。

圖4 6 種人參皂苷化合物多反應(yīng)監(jiān)測（MRM） 模式下色譜圖

2.4 線性關(guān)系與定量限

將空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液由低到高濃度進(jìn)樣，在該試驗(yàn)所確定的儀器條件下對6 種人參皂苷進(jìn)行測定，目標(biāo)物濃度為橫坐標(biāo)，目標(biāo)物峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到線性方程。通過向陰性樣品中添加目標(biāo)物來考查方法的檢出限。

6 種人參皂苷的線性方程與線性關(guān)系見表3。

表3 6 種人參皂苷的線性方程與線性關(guān)系

2.5 方法精密度和回收率驗(yàn)證

按上述試驗(yàn)方法操作，選擇不含該試驗(yàn)所測的6 種人參皂苷的固體保健品分別進(jìn)行3 個質(zhì)量濃度6 次平行的加標(biāo)回收試驗(yàn)，選擇10，20，40 mg/kg 3 個質(zhì)量濃度進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，方法平均回收率在81.4%～105.6%，表明該方法準(zhǔn)確度較高。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～7.8%，說明該方法精密度較好。

6 種人參皂苷的加標(biāo)回收和重現(xiàn)性（n=6） 見表4。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

試驗(yàn)分別考查了6 種人參皂苷在提取后，在樣品瓶中放置不同時(shí)間（2，6，12，24，48 h） 的穩(wěn)定性。通過檢測，6 種人參皂苷含量的RSD＜7.50%，說明該試驗(yàn)條件下樣品穩(wěn)定性良好，可以滿足日常測定的要求。

2.7 市售樣品的測定

對市售9 批保健食品采用1.2 的前處理方法進(jìn)行分析比對，其中原材料標(biāo)識含有人參、三七等五加科植物成分的有4 批，未標(biāo)識含有的有5 批，分別按照該試驗(yàn)確定的最終條件進(jìn)行處理與檢測，結(jié)果表明，標(biāo)識含有五加科植物配料的4 批保健食品均檢出人參皂苷成分，6 種人參皂苷含量占0.40%～1.37%，與樣品標(biāo)簽所標(biāo)總皂苷含量基本一致；而剩余5 批未標(biāo)識含有五加科植物成分的樣品6 種人參皂苷均為未檢出。

保健食品樣品中6 種人生皂苷成分的測定結(jié)果見表5。

表5 保健食品樣品中6 種人生皂苷成分的測定結(jié)果

3 結(jié)論

建立高效液相色譜- 液質(zhì)聯(lián)用法測定保健食品中6 種人參皂苷的檢測方法。優(yōu)化了前處理提取、凈化、色譜和質(zhì)譜條件，與其他干擾物有良好的分離。該方法簡單、靈敏度高、專屬性強(qiáng)，具有良好的線性和精密度和回收率。