響應面法優(yōu)化龍須菜多糖快速溶劑萃取提取工藝及其抗炎活性研究

王慧穎，劉燕飛，張敬遠，杜 彬，楊越冬

（河北省天然產(chǎn)物活性成分與功能重點實驗室，河北秦皇島 066004）

龍須菜（Gracilaria lemaneiformis）又名江蘺、海發(fā)菜，屬江蘺科紅藻界天然海洋植物，其藻體直立，線形分支。其廣泛分布在中國沿海地區(qū)，利于維持海洋生態(tài)環(huán)境，作為瓊脂的主要來源，具有很高經(jīng)濟價值[1]。龍須菜富含多糖、膳食纖維、蛋白質(zhì)、氨基酸、礦物質(zhì)、多酚等可供人體吸收和利用的營養(yǎng)物質(zhì)，其中多糖含量超過干重的30%[2]。研究表明，龍須菜多糖具有免疫調(diào)節(jié)[3]、降血糖[4]、抗氧化[5]、抗腫瘤[6]等優(yōu)異活性，在功能食品、化妝品、醫(yī)用材料和生物肥料領域?qū)崿F(xiàn)高值化應用。

目前，多糖提取[7]的傳統(tǒng)方法有微波輔助提取法[8]、溶劑提取法[9]和酶提取法[10]等。此外，快速溶劑萃取技術[11]是一種新興的高壓自動萃取技術，通過改變溫度和壓力影響多糖的提取率。該方法具有工序簡單、自動化提取、效率高、成本低等優(yōu)點，在食品[12]、化工[13]和環(huán)境[14]領域有廣泛的應用。王國明等[15]研究發(fā)現(xiàn)快速溶劑萃取法提取人參粗多糖得率高于傳統(tǒng)水提法；金建華等[16]探究了快速溶劑萃取法提取唐古特白刺果實多糖的最佳工藝為溫度102 ℃、時間10 min、壓力10 MPa、循環(huán)提取2 次；王宇晴等[17]探究了快速溶劑萃取法提取靈芝多糖的最佳工藝參數(shù)為提取溫度110 ℃，提取壓力90 Pa，提取時間20 min，循環(huán)2 次。然而，快速溶劑萃取技術提取龍須菜多糖尚未報道。

本文將探究快速溶劑萃取法提取龍須菜多糖的提取工藝參數(shù)（提取溫度、提取時間、循環(huán)次數(shù)），以獲得龍須菜多糖的最高得率。系統(tǒng)分析提取工藝參數(shù)對龍須菜多糖得率的影響及其相互作用，并對其結(jié)構和抗炎活性進行實驗，有望為龍須菜多糖提取方法和生物活性提供一定參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍須菜 2021 年采自河北省秦皇島海域，經(jīng)除雜、清洗和晾曬后，得到的龍須菜在50 ℃恒溫干燥箱中干燥至恒重，粉碎過40 目篩，得到龍須菜粉末并置于-20 ℃冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆茫?500 Da 透析袋 上海源葉有限公司；RAW264.7（小鼠單核巨噬細胞白血病細胞）武漢普諾賽生命科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基 上海富衡生物科技有限公司；胎牛血清上海源培生物科技股份有限公司；CCK-8 試劑盒上海七純生物科技有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；LPS（0111:B4）美國Sigma 公司；硫酸銨、叔丁醇、無水乙醇等 分析純，天津歐博凱化工有限公司。

APLE-3000 全自動加壓溶劑萃取儀（配有100 mL萃取池）北京吉天儀器有限公司；ALpha2-4L D plus 冷凍干燥機 德國CHRIST 公司；TENSOR27傅立葉變換紅外光譜儀 德國Bruker 公司；HPLC 1100 高效液相色譜儀 美國Agilent 公司；1300Ⅱ級A2 型生物安全柜、3111 型CO2細胞培養(yǎng)箱、MultifugeX1R 型高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher Scientific 公司；XSZ-D2 普通倒置顯微鏡 德國ZEISS 公司；SPECTRA MAX 190 型酶標儀 美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 龍須菜多糖提取 參照何俊平等[18]的實驗方法，并做修改。精確稱取龍須菜粉末（5.0000±0.0003）g 并與硅藻土（1:1，w/w）混合均勻，裝入100 mL 不銹鋼萃取池中，用硅藻土填滿萃取池剩余空間后放到加壓溶劑萃取儀中，以水為溶劑，固定加載溶劑25 mL；固定10 MPa 壓力，在一定溫度下靜態(tài)萃取一定時間，循環(huán)一定次數(shù)，后將萃取液離心（5000 r/min，10 min），記錄體積，加四倍體積無水乙醇4 ℃條件下醇沉過夜、離心取沉淀，將沉淀復溶；然后加入20%（w/v）硫酸銨和1.5 倍（v/v）叔丁醇，35 ℃反應30 min，過3500 Da 透析膜，透析48 h，濃縮至四分之一，冷凍干燥得龍須菜粗多糖GLP-K。提取工藝流程見圖1。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 提取溫度對多糖得率的影響 以水為溶劑，固定投料量為5 g，提取壓力為10 Mpa，提取時間2 min，循環(huán)次數(shù)1 次，探究提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）對龍須菜多糖得率的影響。每個實驗平行重復三次。

1.2.2.2 提取時間對多糖得率的影響 以水為溶劑，固定投料量為5 g，提取壓力為10 Mpa，提取溫度60 ℃，循環(huán)次數(shù)1 次，探究提取時間（2、4、6、8、10 min）對龍須菜多糖得率的影響。每個實驗平行重復三次。

1.2.2.3 循環(huán)次數(shù)對多糖得率的影響 以水為溶劑，固定投料量為5 g，提取壓力為10 Mpa，提取溫度60 ℃，提取時間2 min，探究循環(huán)次數(shù)（1、2、3、4、5 次）對龍須菜多糖得率的影響。每個實驗平行重復三次。

1.2.3 響應面試驗優(yōu)化龍須菜多糖提取工藝 基于Box-Benhnken 試驗設計原理，綜合單因素實驗結(jié)果，固定提取投料量為5 g，提取壓力為10 MPa，以多糖得率為響應值，選擇提取溫度（A）、提取時間（B）和循環(huán)次數(shù)（C）為自變量，設計三因素三水平響應面優(yōu)化試驗，響應面試驗設計表見下表1。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 The design factors and levels of response surface test

1.2.4 龍須菜多糖得率的測定 參考任鑫等[19]的方法，按公式（1）計算龍須菜多糖得率：

式中：Y 為龍須菜多糖得率，%；M1為龍須菜粗多糖質(zhì)量，g；M2為龍須菜粉的質(zhì)量，g。

選用苯酚硫酸法測定多糖含量。標準曲線：先配制0.1 mg/mL 葡萄糖標準液母液，再配成一系列濃度（0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40 μg/mL）的標準溶液，各取1 mL 于試管中，加1 mL 6%苯酚和5 mL 濃硫酸，靜置20 min，在490 nm 處測定吸光度值，作圖得標準曲線。配制1 mg/mL 的GLP-K溶液，按上述步驟加苯酚和濃硫酸，靜置20 min，在490 nm 處測吸光度值。

1.2.5 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析 將干燥多糖樣品與干燥KBr 于研缽中順時針充分研磨至混勻，置于專用模具內(nèi)手動壓成透明薄片后測試?？鄢齂Br 的空白背景，掃描范圍：500～4000 cm-1，掃描間隔2 cm-1。

1.2.6 分子量分布 采用高效液相色譜法[20]（HPLC）對龍須菜多糖進行測定。將樣品溶解在蒸餾水中，過0.22 μm 的微孔濾膜后上機檢測。色譜條件：Agilent PL aquagel-OH MIXED-H 凝膠色譜柱（300×7.5 mm，8 μm），流動相為蒸餾水，流速為0.8 mL/min，柱溫為35 ℃；配制2 mg/mL 葡聚糖標準品及樣品，測樣體積為20 μL。實驗平行重復三次。

1.2.7 體外RAW264.7 細胞實驗

1.2.7.1 細胞培養(yǎng) 將RAW 264.7 細胞株采用生長培養(yǎng)液（含89% DMEM 培養(yǎng)基、10%胎牛血清和1%的青霉素、鏈霉素雙抗混懸液）于37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將培養(yǎng)皿放在普通倒置顯微鏡下，放大不同倍數(shù)觀察細胞密度和生長情況。

1.2.7.2 對RAW 264.7 細胞活力的影響 取生長狀態(tài)良好的RAW 264.7 制備細胞懸液，將細胞按1×104/孔接種到96 孔板中，每孔100 μL 培養(yǎng)基，貼壁培養(yǎng)24 h 后棄培養(yǎng)基，空白組（無細胞）和對照組分別加入100 μL 培養(yǎng)基，實驗組加入100 μL 含有不同濃度（7.8125、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1000 μg/mL）龍須菜多糖的培養(yǎng)基干預24 h后，棄培養(yǎng)基，再將100 μL 含有10% CCK-8 試劑的細胞培養(yǎng)基加入空白組、對照組和實驗組中，37 ℃避光孵育1 h。用酶標儀在450 nm 處測量每個孔的吸光度（A450），計算細胞存活率。每組設三個復孔。存活率計算見公式（2）。

式中：As為實驗組吸光度；Ac為對照組吸光度；Ab為空白組吸光度。

1.2.7.3 細胞中NO 含量檢測 取生長狀態(tài)良好的RAW 264.7 制備細胞懸液，將細胞按2×105/孔接種到48 孔板中，每孔200 mL 培養(yǎng)基，貼壁培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)基，實驗組加入200 μL 含有不同濃度（50、100、200、300、400、500 μg/mL）龍須菜多糖的培養(yǎng)基，LPS 組和對照組加200 μL 新鮮培養(yǎng)基，預處理2 h 后，LPS 組和實驗組加入22.2 μL 含10 μg/mL LPS 的培養(yǎng)基，對照組加入22.2 μL 新鮮培養(yǎng)基，刺激22 h 后，根據(jù)NO 試劑盒說明書步驟檢測培養(yǎng)基上清中NO 含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過Excel 軟件處理三次平行實驗的實驗結(jié)果作平均值和標準差分析，響應面試驗數(shù)據(jù)采用Design-Expert8.0.6.1 軟件進行分析。采用Origin 9軟件進行結(jié)構作圖，GraphPad prism8.0.1 軟件進行活性作圖分析。P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著，P＜0.001 表示差異高度顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 提取溫度對多糖得率的影響 如圖2 所示，隨著反應溫度的升高，多糖的得率隨之提高，當溫度達到70 ℃時，多糖得率達到最大，繼續(xù)升高溫度時，得率略有下降，可能是溫度的上升有利于溶劑與細胞壁的相互作用，使胞內(nèi)物質(zhì)溶出，但在10 MPa 的壓力加持下，高溫導致多糖發(fā)生了熱降解。因此后繼試驗中提取溫度取值范圍為60～80 ℃。

圖2 提取溫度對龍須菜多糖得率的影響Fig.2 Effect of extracting temperature on the yield of GLP-K

2.1.2 提取時間對多糖得率的影響 如圖3 所示，在2～8 min 內(nèi)，龍須菜多糖的得率隨反應時間增加而提高，提取時間為8 min 時得率達到最大值，為5.59%；繼續(xù)延長時間后，得率下降，分析可能是在較短時間范圍內(nèi)，隨著提取時間的延長，細胞組織遭到持續(xù)性破壞，多糖溶出，得率增加；多糖在長時間[21-22]的高壓作用下發(fā)生水解或氧化。因此后繼試驗中提取時間取值范圍為6～10 min。

圖3 提取時間對龍須菜多糖得率的影響Fig.3 Effect of extracting time on the yield of GLP-K

2.1.3 循環(huán)次數(shù)對多糖得率的影響 如圖4 所示，多糖得率隨著循環(huán)次數(shù)的增加而提高，當循環(huán)次數(shù)為4 時得率最高，繼續(xù)增加循環(huán)次數(shù)，得率沒有增加，分析是多糖在水中溶解度是一定的，達到平衡后不再溶出，更換新溶劑后多糖會繼續(xù)溶出至再次達到平衡，但隨著提取次數(shù)的增加，其他水溶性雜質(zhì)會占據(jù)多糖的位置，因此后繼試驗中循環(huán)次數(shù)取值范圍為3～5次。循環(huán)次數(shù)對多糖得率的影響結(jié)果與Du 等[21]在青稞中β-葡聚糖的快速溶劑萃取試驗結(jié)果一致。

圖4 循環(huán)次數(shù)對龍須菜多糖得率的影響Fig.4 Effect of cycle times on the yield of GLP-K

2.2 響應面試驗優(yōu)化分析

2.2.1 響應面多元回歸方程的建立 以龍須菜多糖的得率為響應值，采用三因素三水平的響應面試驗設計得到最佳提取工藝參數(shù)，實驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3，龍須菜多糖得率在7.38%～9.75%之間，對表2 中的響應面試驗數(shù)據(jù)結(jié)果進行多元回歸方程擬合，并獲得以龍須菜多糖為響應值的多元回歸方程：

表2 龍須菜多糖提取工藝條件響應面優(yōu)化方案及結(jié)果Table 2 Response surface optimization scheme and results of extraction process conditions of GLP-K

表3 響應面回歸方程模型方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface regression equation model

Y=9.69+0.32A+0.075B+0.50C-0.14AB+0.074AC-0.015BC-1.11A2-0.65B2-0.38C2

結(jié)合表3 可知，F(xiàn)值越高，P值越低，顯著性則越高[23]?；貧w模型P＜0.01，失擬項P=0.0515，A 和C 對響應值影響極顯著（P＜0.01），B 對響應值影響不顯著（P＞0.05）；交互項AB 對響應值影響顯著（P＜0.05），AC、BC 對響應值影響不顯著（P＞0.05）；二次項對響應值影響均極顯著（P＜0.01）；表明優(yōu)化實驗結(jié)果具有較高的相關性和真實性，三個因素顯著性影響大小分別為循環(huán)次數(shù)＞提取溫度＞提取時間。

2.2.2 響應面及等高線圖分析 圖5 展示了三因素（提取溫度、提取時間和循環(huán)次數(shù)）兩兩交互的響應曲面和等高線圖。如圖所示，相對比較而言，多糖得率在提取溫度較低（60～70 ℃）時隨提取時間的增大呈遞增趨勢，在提取溫度較高時（70～80 ℃），呈遞減趨勢。提取溫度和提取時間的響應面圖的曲面較陡，表明其交互作用顯著（P＜0.05）；多糖得率在提取溫度較低（60～70 ℃）時隨循環(huán)次數(shù)的增大呈遞增趨勢，在提取溫度較高時（70～80 ℃），呈緩慢遞減趨勢（P＞0.05）；多糖得率在提取時間較低（6～8 min）時隨循環(huán)次數(shù)的增大呈遞增趨勢，在提取時間較高時（8～10 min），呈緩慢遞減趨勢（P＞0.05）。綜合分析可得，溫度和時間交互作用最強烈，溫度和循環(huán)次數(shù)交互作用次之，時間和循環(huán)次數(shù)交互作用最弱，和表3 方差分析結(jié)果相符。

圖5 AB、AC、BC 對龍須菜多糖得率影響的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour plots of the effects of AB,AC and BC on the yield of GLP-K

2.2.3 響應面優(yōu)化試驗結(jié)果驗證 通過響應面軟件對最佳提取工藝條件進行預測，得到龍須菜多糖快速溶劑萃取的最佳工藝條件為：蒸餾水為溶劑，萃取壓力10 MPa，提取溫度70.41 ℃，提取時間8.53 min，循環(huán)次數(shù)4.24 次，預測得率為9.82%?；趯嶋H情況，將最優(yōu)條件調(diào)整為溫度70 ℃，時間8.5 min，循環(huán)次數(shù)4 次，在此條件下進行三次平行水平驗證實驗，龍須菜多糖得率為9.58%±0.31%，與多元回歸方程得到的預測值相近，表明該模型的優(yōu)化參數(shù)基本可靠，具有可行性。

2.3 多糖純度測定

通過苯酚-硫酸法對葡萄糖標準溶液作圖，得葡萄糖標準曲線方程：Y=0.006X+0.002，R2=0.998，代入方程計算GLP-K 中總糖含量為75.28%。

2.4 紅外光譜分析

如圖6 所示，在3386 cm-1處的寬而強的吸收峰是-OH 伸縮振動特征吸收峰；在2916 cm-1處有一個-CH 伸縮振動引起的弱而小的吸收峰，表明該樣品類屬于多糖類化合物[24]；在1643 cm-1和1444 cm-1處的吸收峰分別對應C=O 和C-O 的拉伸振動，表明此多糖存在糖醛酸[25]；1239 cm-1處的峰代表S=O 的拉伸振動，表明含有硫酸基；1152 cm-1和1071 cm-1的吸收表示半乳糖和葡萄糖的存在[26]。綜上表明GLP-K 是一種含有硫酸基和糖醛酸的粗多糖。

圖6 龍須菜多糖紅外光譜圖Fig.6 FT-IR of GLP-K

2.5 分子量分析

在最佳工藝參數(shù)下得到龍須菜多糖。圖7 給出了龍須菜多糖的HPLC 洗脫曲線以及葡聚糖標準品[27]（重均分子量Mw分別為180、667、47100、344000、708000 Da）的標準矯正曲線。得到標準曲線的線性方程lgMw=-0.9822t+14.9794，其中R2=0.994，呈良好的線性關系[28]。由表4 可知，此方法得到的多糖分子量范圍較寬，在4.4～747.1 kDa，響應信號最大值對應的Mw為29787 Da。

表4 保留峰時間和分子量Table 4 Retention peak time and molecular weight

圖7 HPLC 的標準矯正曲線和龍須菜多糖的HPLC洗脫曲線Fig.7 Standard calibrationcurve of HPLC and the HPLC elution profile of GLP-K

2.6 體外抗炎活性研究

2.6.1 GLP-K 對RAW 264.7 細胞活性的影響 如圖8 所示，本實驗探究在7.8125～1000 μg/mL 濃度的GLP-K 的細胞存活率[29-31]。結(jié)果顯示，與對照組相比，7.8125～1000 μg/mL 濃度范圍內(nèi)的GLP-K 組對巨噬細胞的活力分別增加了10.3%～46.7%，表明快速溶劑法萃取龍須菜多糖對細胞沒有毒性作用。

圖8 GLP-K 對細胞活力的影響Fig.8 Effects of GLP-K on cells viability

2.6.2 GLP-K 對 LPS 誘導的 RAW264.7 釋放 NO 的影響 NO 作為一種有毒氣體存在于空氣中，但它在生物生理方面充當重要的信號分子作用，參與生物體免疫調(diào)節(jié)或抗炎活動。在炎癥細胞模型中，可以通過NO 釋放量減少來判斷炎癥反應是否得到改善[32-34]。由圖9 可知，與對照組相比，LPS 組NO 產(chǎn)生量有提升了4 倍（P＜0.001），證明炎癥模型誘導成功；與模型組相比，不同濃度的實驗組NO 釋放量降低，出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.001），隨著GLP-K 實驗組濃度的升高，NO 抑制率呈正相關。在50 μg/mL 時NO 抑制率為43.76%，500 μg/mL 時NO 抑制率為69.47%。結(jié)果表明，GLP-K 可以改善炎癥反應。朱彥彬等[31]采用體外細胞實驗，研究了樺褐孔菌醇抑制LPS 誘導RAW264.7 細胞炎癥反應，結(jié)果表明，該提取物能有效抑制LPS 誘導RAW264.7 細胞中促炎因子和過氧化物的產(chǎn)生，提高細胞抗炎和抗氧化能力，從而保護細胞免受損傷。

圖9 不同濃度GLP-K 對 RAW264.7 細胞NO 分泌水平的影響Fig.9 Effect of different concentrations of GLP-K on the NO secretion of RAW264.7 cells

3 結(jié)論

本研究使用快速溶劑萃取法提取龍須菜多糖，首先利用單因素實驗獲得提取溫度、提取時間和循環(huán)次數(shù)對龍須菜多糖得率影響的最佳條件，再利用響應面法對快速溶劑法龍須菜多糖提取工藝進行優(yōu)化，得到最佳提取工藝參數(shù)：溫度70 ℃，時間8.5 min，循環(huán)次數(shù)4 次，龍須菜多糖得率為9.58%±0.31%，與多元回歸方程得到的預測值相近，表明該模型的優(yōu)化參數(shù)基本可靠，具有可行性。紅外光譜證實該多糖含有糖醛酸，重均分子量在4.4～747.1 kDa 之間；GLP-K在濃度1000 μg/mL 及以下時對RAW264.7 細胞增殖也無影響（P＜0.001）；與模型組相比，GLP-K 給藥組（50、100、200、300、400、500 μg/mL）NO 的釋放量顯著降低43.76%～69.47%（P＜0.001）。本文首次快速溶劑萃取法應用于龍須菜多糖的提取，并初步證實其抗炎活性，其抗炎機理還需進一步研究。