王世香 趙艷 尚畫雨 王前進(jìn) 丁孝民 劉紹生 夏志

1 井岡山大學(xué)體育學(xué)院（吉安 343009）

2 溫州大學(xué)體育與健康學(xué)院（溫州 325035）

3 成都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院（成都 610041）

4 溫州醫(yī)科大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院（溫州 325035）

衰老性骨骼肌萎縮（age-related sarcopenia）是65歲及以上老年人群的多發(fā)病癥[1，2]，主要表現(xiàn)為快縮型骨骼肌質(zhì)量與功能的進(jìn)行性衰退，其發(fā)生發(fā)展可致老年人跌倒、殘疾甚至死亡的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，并與住院費(fèi)用的增長(zhǎng)獨(dú)立相關(guān)[3]。隨著人口老齡化速度的加快和平均預(yù)期壽命的提高，衰老性骨骼肌萎縮給家庭與社會(huì)造成的精神或經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)將日趨嚴(yán)重。然而，其臨床治療迄今尚無(wú)公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)與指引，現(xiàn)有藥物及干預(yù)手段亦未能有效應(yīng)對(duì)其進(jìn)展[4，5]。

衰老性骨骼肌萎縮主要表現(xiàn)為快縮型骨骼肌的退行性變化，蛋白質(zhì)平衡紊亂是其根本誘因[5-7]，蛋白質(zhì)合成減少則直接導(dǎo)致其發(fā)生與發(fā)展[8]。運(yùn)動(dòng)是強(qiáng)有力的蛋白質(zhì)合成刺激[9]，抗阻訓(xùn)練可使衰老骨骼肌質(zhì)量增加高達(dá)21%[10]，而肌力增幅則可達(dá)90%[11]；越來(lái)越多的研究指出有氧運(yùn)動(dòng)具有類似作用[12，13]，我們近期的一些研究亦佐證了這一觀點(diǎn)[14-16]。既然抗阻與有氧運(yùn)動(dòng)均能促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，若同時(shí)施加兩種運(yùn)動(dòng)干預(yù)，能否發(fā)揮顯著的衰老性骨骼肌萎縮干預(yù)效應(yīng)？此問(wèn)題尚有待明確。有零星研究提示，同期訓(xùn)練（指一種將力量與耐力素質(zhì)的任務(wù)安排在相同訓(xùn)練時(shí)期的訓(xùn)練模式）可增強(qiáng)骨骼肌響應(yīng)抗阻刺激時(shí)的合成反應(yīng)，產(chǎn)生顯著的蛋白質(zhì)正性平衡、骨骼肌肥大及功能促進(jìn)[6]。由此，我們推測(cè)同期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)亦有防治衰老性骨骼肌萎縮的重要潛力。

基于上述考慮，本研究觀察同期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)對(duì)自然衰老小鼠快縮型骨骼肌蛋白質(zhì)合成水平與功能的影響，考量其防治衰老性骨骼肌萎縮與功能衰退的潛力。通過(guò)觀察骨骼肌蛋白質(zhì)合成調(diào)節(jié)中關(guān)鍵信號(hào)通路蛋白哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）Ser2448 位點(diǎn)、p70 核糖體蛋白S6 激酶（p70 ribosomal protein S6 kinase，p70S6K）Thr389位點(diǎn)與真核翻譯起始因子4E 結(jié)合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4EBP1）Thr37/46 位點(diǎn)的磷酸化表達(dá)及Ⅱb 型肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain Ⅱb，MHCⅡb）蛋白表達(dá)變化進(jìn)行間接評(píng)價(jià)，并探討其潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（川）2015-030。3月齡體成熟青年鼠8只納入青年對(duì)照（young control，YC）組，體重28～29 g）；非退役種鼠16只飼養(yǎng)至16月齡后據(jù)體重隨機(jī)納入衰老對(duì)照（aging control，AC）與運(yùn)動(dòng)干預(yù)（aging with endurance and resistance exercise，AER）組，每組8 只（體重33～36 g）。小鼠自由攝食飲水，室溫22℃± 1.5℃，室內(nèi)照明控制為12小時(shí)光暗循環(huán)周期。研究經(jīng)井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)（2019倫批第5號(hào)）。

1.2 主要儀器與試劑

電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，Mini P-4 電泳槽購(gòu)自北京凱元信瑞儀器有限公司，YSL-13A小動(dòng)物抓握力計(jì)購(gòu)自濟(jì)南益延科技有限公司。蛋白提取試劑（T-PER?，78510）、定量試劑盒（Pierce?Coomassie，23200）購(gòu)自美國(guó)Thermo賽默飛世爾科技公司；mTOR（2972S）、P-mTORSer2448（2971S）、p70S6K（9202S）、P- p70S6KThr389（9205S）、4E- BP1（9452S）和P-4E-BP1Thr37/46（9459S）一抗均購(gòu)自美國(guó)CST賽信通生物試劑有限公司，MHCⅡb（20140-1-AP）一抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，Puromycin（嘌呤霉素，EQ0001）一抗購(gòu)自美國(guó)Kerafast凱拉法斯特公司，嘌呤霉素（T2219）購(gòu)自美國(guó)Targetmol陶素生化科技公司。

1.3 運(yùn)動(dòng)方案

運(yùn)動(dòng)方案參照我們前期的報(bào)道進(jìn)行設(shè)置[14，17]，訓(xùn)練組小鼠接受為期8 周的運(yùn)動(dòng)干預(yù)，每周訓(xùn)練6 天，周日休息。根據(jù)Murach 等[13]的研究結(jié)論，有氧與抗阻運(yùn)動(dòng)干預(yù)應(yīng)間隔6～24 小時(shí)，故每周一、三、五進(jìn)行有氧訓(xùn)練，二、四、六進(jìn)行抗阻訓(xùn)練以減少兩種訓(xùn)練手段之間的干擾。為減少應(yīng)激，有氧與抗阻訓(xùn)練均采用水中運(yùn)動(dòng)方式，水溫控制在30°C±2°C。其中，有氧運(yùn)動(dòng)采用3%體重比例負(fù)荷，每日訓(xùn)練45分鐘[14]。我們此前的報(bào)道已表明，以此負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后小鼠血乳酸水平均介于2.9～3.7 mmol/l 范圍內(nèi)，為典型有氧運(yùn)動(dòng)[16]；抗阻運(yùn)動(dòng)采用遞增負(fù)荷方案，訓(xùn)練時(shí)用透明管材將泳池分隔為8個(gè)獨(dú)立泳區(qū)，最初以40%體重負(fù)荷，每周增加2.5%比例至50%后固定不變。每次運(yùn)動(dòng)10組，每組30 s，組間休息1分鐘[17]。因?yàn)樨?fù)重過(guò)大，小鼠難以保持頭部露出水面，因此需后肢用力蹬踏缸底躍出水面以保證呼吸。30秒內(nèi)，小鼠將完成8～10次跳躍，根據(jù)我們前期關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抗阻訓(xùn)練模型的分析結(jié)果，這一方案為典型無(wú)氧、抗阻型運(yùn)動(dòng)[18]。

1.4 取樣

運(yùn)動(dòng)組小鼠末次訓(xùn)練后間隔24 小時(shí)（期間禁食6小時(shí)，以減少小鼠末次進(jìn)食時(shí)間差異對(duì)骨骼肌蛋白質(zhì)代謝水平的混雜影響），各組小鼠稱重后以100 mg/kg體重劑量腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。注射10 分鐘后以40 μmol/kg體重劑量腹腔注射蛋白質(zhì)合成測(cè)試標(biāo)記物嘌呤霉素，待吸收35 分鐘后處死全部小鼠，分離雙側(cè)趾長(zhǎng)伸肌與脛骨前肌。肌樣用生理鹽水沖洗后，濾紙吸干、稱重。鑒于兩種肌樣總量的限制，故切取脛骨前肌部分肌樣置于4%多聚甲醛中固定后用于組織形態(tài)學(xué)分析，趾長(zhǎng)伸肌與剩余脛骨前肌肌樣則經(jīng)液氮速凍后用錫紙包裹并裝入凍存管中，-80℃超低溫冰箱保存待測(cè)。

1.5 測(cè)試指標(biāo)與方法

1.5.1 網(wǎng)屏測(cè)試

采用網(wǎng)屏測(cè)試[19]評(píng)價(jià)小鼠神經(jīng)肌肉力量與協(xié)調(diào)性。在30 cm 高亞克力板材箱上放置一個(gè)50 cm×50 cm的網(wǎng)屏，網(wǎng)格開(kāi)口1.0 cm×1.0 cm，箱底放置海綿墊進(jìn)行小鼠落地緩沖。將各組測(cè)試小鼠置于網(wǎng)格中心后將網(wǎng)屏旋轉(zhuǎn)倒置，記錄小鼠從網(wǎng)屏上松開(kāi)四肢墜落至海綿墊前的懸吊時(shí)間。于運(yùn)動(dòng)干預(yù)前和干預(yù)后每周日進(jìn)行測(cè)試，每只小鼠測(cè)試3 次，測(cè)試間隔30 分鐘，以最長(zhǎng)懸吊時(shí)間為準(zhǔn)。

1.5.2 肌力測(cè)試

采用小鼠后肢抓握力評(píng)價(jià)骨骼肌肌力，實(shí)驗(yàn)前測(cè)定小鼠后肢抓握力作為基線值，運(yùn)動(dòng)干預(yù)期每周日進(jìn)行重復(fù)測(cè)量。測(cè)試方法參照我們的前期報(bào)道[20]：用軟管套住小鼠前爪使其不能抓握，提起鼠尾待其后肢抓緊測(cè)力板抓握桿后緩慢、持續(xù)地水平向后拉動(dòng)，當(dāng)雙側(cè)后肢同時(shí)松開(kāi)抓握桿時(shí)記錄顯示數(shù)值。每只小鼠視測(cè)試表現(xiàn)重復(fù)6～10次，以最大值為準(zhǔn)。

1.5.3 力竭游泳測(cè)試

為避免于取樣前進(jìn)行力竭游泳對(duì)其它檢測(cè)指標(biāo)產(chǎn)生混雜影響，故于第7周周日以5%體重比例負(fù)荷進(jìn)行測(cè)試，用于評(píng)價(jià)小鼠體能。測(cè)試時(shí)控制水深在35 cm以上，從而避免小鼠以尾尖支撐缸底進(jìn)行休息。出現(xiàn)漂浮或“集團(tuán)游泳”等消極表現(xiàn)時(shí)立即進(jìn)行驅(qū)趕。當(dāng)小鼠游泳動(dòng)作明顯失調(diào)，不能繼續(xù)堅(jiān)持運(yùn)動(dòng)，或沉入水中3秒仍不能回到水面時(shí)，視為達(dá)到力竭狀態(tài)[21]。

1.5.4 肌原纖維與肌漿蛋白定量

定量方法參照我們的前期報(bào)道[16]，將待測(cè)骨骼肌樣本在預(yù)冷緩沖液內(nèi)勻漿后以600×g 轉(zhuǎn)速離心20 分鐘，分離出富含肌原纖維蛋白的沉降物。上清則繼續(xù)以100000×g 4℃離心60分鐘，分離出肌漿蛋白。Bradford法進(jìn)行蛋白定量。

1.5.5 蛋白質(zhì)合成率

使用嘌呤霉素表面標(biāo)記翻譯法（Surface sensing of translation，SUnSET）測(cè)定體蛋白合成率。肌樣勻漿后的混懸液4℃2000×g離心3分鐘，以20 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行電泳。轉(zhuǎn)膜并封閉后，4℃與抗嘌呤霉素抗體（1∶2000）孵育過(guò)夜。洗膜后，在二抗中孵育1小時(shí)（1∶10000）。其它操作同免疫印跡。

1.5.6 免疫印跡

肌樣剪成碎粒，加入蛋白提取試劑并進(jìn)行勻漿?；鞈乙河?℃12000×g離心20分鐘取上清。蛋白定量后以120 μg 上樣量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分裝，加入PBS 補(bǔ)足20 μl。加入5×蛋白上樣緩沖液變性10分鐘。配置5%濃縮膠與15%分離膠，濃縮膠80 V 恒壓30～40 分鐘，分離膠120 V 恒壓，溴酚藍(lán)至板底后停止。轉(zhuǎn)膜時(shí)恒流300 mA，據(jù)分子量大小而轉(zhuǎn)膜不同時(shí)間，其中MHCⅡb為150分鐘，mTORSer2448蛋白總量與磷酸化表達(dá)均為120分鐘，p70S6KThr389蛋白總量與磷酸化表達(dá)均為60分鐘，4E-BP1Thr37/46總量與磷酸化表達(dá)均為30 分鐘。封閉后分別進(jìn)行一抗（MHCⅡb 1∶1000、mTOR 1∶1000、mTORSer24481∶1000、p70S6K1∶2000、p70S6KThr3891∶500、4E-BP1Thr37/461∶1000、4E-BP1Thr37/461∶1000）和二抗（1∶50000-1∶200000）孵育。讀取灰度值后，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值計(jì)算蛋白表達(dá)量，以磷酸化蛋白表達(dá)量/總蛋白表達(dá)量計(jì)算磷酸化率，組間差異采用對(duì)照組目的蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行校正后再作比較[16]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用Shapiro-Wilk 分析進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，Levene 分析進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)呈嚴(yán)重偏態(tài)時(shí)，進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后再次統(tǒng)計(jì)，若不能轉(zhuǎn)換至近似正態(tài)分布，則采用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。若Levene 檢驗(yàn)結(jié)果P＜0.05，直接采用Tamhane’s T2基于t檢驗(yàn)的保守成對(duì)比較結(jié)果。對(duì)于滿足近似正態(tài)分布和方差齊性條件的數(shù)據(jù)則直接采用方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，組間多重比較采用Bonferroni法。實(shí)驗(yàn)期內(nèi)網(wǎng)屏懸吊時(shí)間與肌肉力量的時(shí)程變化采用重復(fù)測(cè)量方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，未通過(guò)球形檢驗(yàn)時(shí)，Epsilon校正系數(shù)參考Greenhouse-Geisse 的校正結(jié)果，Epsilon 校正系數(shù)小于0.7時(shí)采用Bonferroni法調(diào)節(jié)置信區(qū)間，大于0.7則采用Tukey 法。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較

與YC 組小鼠毛發(fā)濃密油亮、反應(yīng)敏捷迅速、日常活動(dòng)性強(qiáng)等特點(diǎn)相比，AC 與AER 組小鼠毛發(fā)稀疏暗淡，反應(yīng)遲鈍，體重較重且活動(dòng)性差。

2.2 蛋白質(zhì)合成水平差異比較

2.2.1 蛋白質(zhì)總量及肌原纖維與肌漿蛋白含量

AC 組與AER 組小鼠骨骼肌蛋白質(zhì)總量均顯著低于YC 組（P＜0.01），AER 組小鼠較AC 組高15.2%（P＜0.01）（圖1A）。AC組與AER組小鼠骨骼肌肌原纖維蛋白含量顯著低于YC組（P＜0.01），AER組小鼠肌原纖維蛋白含量較AC 組高15.0%（P＜0.01）（圖1B）。就肌漿蛋白含量而言，除AC 組顯著低于YC 組小鼠外（P＜0.05），其它組間比較差異未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1C）。

圖1 各組小鼠骨骼肌蛋白質(zhì)總量（A）、肌原纖維蛋白含量（B）與肌漿蛋白含量（C）比較

2.2.2 蛋白質(zhì)合成率

使用抗嘌呤霉素抗體進(jìn)行SUnSET 分析的新合成嘌呤霉素標(biāo)記蛋白代表性印跡參見(jiàn)圖2A。如圖2B 所示，AC組與AER組小鼠體外蛋白質(zhì)合成率均顯著低于YC 組（P＜0.01）；AER 組小鼠蛋白質(zhì)合成率較AC 組高12.3%（P＜0.01）。

圖2 各組小鼠骨骼肌新合成嘌呤霉素標(biāo)記蛋白的代表性印跡（A）與蛋白質(zhì)合成率（B）比較

2.3 骨骼肌形態(tài)學(xué)與功能差異比較

2.3.1 肌纖維直徑與橫截面積

AC 組與AER 組小鼠骨骼肌纖維直徑均顯著低于YC組（P＜0.01），AER組小鼠較AC組高12.6%（P＜0.01）（圖3A，3C）。肌纖維橫截面積的組間差異趨勢(shì)與直徑一致，AC組與AER組小鼠骨骼肌肌原纖維蛋白含量顯著低于YC 組（P＜0.01），AER 組小鼠橫截面積則較AC組高27.4%（P＜0.01）（圖3B，3C）。

圖3 各組小鼠骨骼肌纖維直徑（A）、橫截面積（B）及組織形態(tài)學(xué)（C）比較

2.3.2 網(wǎng)屏懸吊時(shí)間

重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示：僅見(jiàn)時(shí)間×分組因素的交互作用均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示時(shí)間因素的作用隨分組不同而不同；分組因素具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示各組小鼠懸吊時(shí)間總體差異顯著。各處理組小鼠實(shí)驗(yàn)期間網(wǎng)屏懸吊時(shí)間變化如圖4 所示。AC與AER組小鼠干預(yù)前懸吊時(shí)間并無(wú)差異，但均顯著低于YC組小鼠（P＜0.01）。8周實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，YC組小鼠懸吊時(shí)間變化未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AC組小鼠懸吊時(shí)間顯著減少，自第1 周即開(kāi)始出現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化（P＜0.05）；AER組則自第3周運(yùn)動(dòng)干預(yù)后出現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增長(zhǎng)（P＜0.05），至第7 周時(shí)已顯著優(yōu)于AC組小鼠（P＜0.05）。

圖4 各組小鼠網(wǎng)屏懸吊時(shí)間比較

2.3.3 肌肉力量

重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示：時(shí)間因素以及時(shí)間×分組因素的交互作用均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示小鼠抓握肌力有隨時(shí)間變化的趨勢(shì)，且時(shí)間因素的作用隨分組的不同而不同；分組因素具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示各組小鼠抓握肌力總體差異顯著。各處理組小鼠實(shí)驗(yàn)期間抓握力變化如圖5 所示。AC 與AER 組小鼠初始抓握肌力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均顯著低于YC組小鼠（P＜0.01）。8周實(shí)驗(yàn)期后，YC組小鼠肌力增長(zhǎng)，較初始肌力水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；AC 組小鼠肌力顯著下降，自第4 周開(kāi)始出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化（P＜0.05）；AER 組小鼠肌力變化趨勢(shì)與YC組一致，自第2周同期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后即已出現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增長(zhǎng)（P＜0.05），至第8 周時(shí)與AC 組小鼠肌力差異已具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖5 各組小鼠肌肉力量比較

2.3.4 力竭游泳時(shí)間

如圖6所示，AC組與AER組小鼠力竭游泳時(shí)間顯著短于YC 組（P＜0.01），AER 組較AC 組小鼠力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)272.9%（P＜0.01）。

圖6 各組小鼠力竭游泳時(shí)間比較

2.4 蛋白質(zhì)合成關(guān)鍵信號(hào)通路蛋白表達(dá)量差異

各組小鼠骨骼肌蛋白質(zhì)合成關(guān)鍵信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)見(jiàn)圖7A。如圖7B 所示，與YC 組相比，AC 組與AER 組小鼠mTORSer2448、4E-BP1Thr37/46與p70S6KThr389磷酸化表達(dá)均表現(xiàn)為下調(diào)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；但AER組小鼠較AC組上調(diào)，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。MHC Ⅱb 組間趨勢(shì)與mTORSer2448、4EBP1Thr37/46與p70S6KThr389磷酸化表達(dá)一致。

3 討論

骨骼肌質(zhì)量的維持取決于骨骼肌蛋白質(zhì)合成和降解之間的平衡，兩者的差值體現(xiàn)著凈蛋白質(zhì)平衡狀態(tài)[6，22]。若肌肉蛋白質(zhì)合成的晝夜波動(dòng)與蛋白質(zhì)降解相當(dāng)，則骨骼肌質(zhì)量維持穩(wěn)態(tài)；而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)合成水平超過(guò)降解導(dǎo)致凈蛋白質(zhì)平衡呈正數(shù)時(shí)，骨骼肌蛋白質(zhì)沉積增加并繼發(fā)導(dǎo)致骨骼肌肥大與肌力增長(zhǎng)。反之，若蛋白質(zhì)降解水平超過(guò)合成使凈蛋白質(zhì)平衡呈負(fù)數(shù)，則會(huì)誘發(fā)骨骼肌蛋白質(zhì)含量減少并致萎縮加劇[23，24]。就衰老機(jī)體而言，其骨骼肌質(zhì)量與功能所表現(xiàn)出的退行性變化主要由蛋白質(zhì)合成的減少所致，這一變化被稱為“合成代謝抵抗（anabolic resistance）”，意即在接受促蛋白質(zhì)合成刺激時(shí)，老年人骨骼肌需要更大的刺激劑量方能產(chǎn)生與青年人類似的凈蛋白質(zhì)平衡與蛋白質(zhì)沉積[25]。因此，如何有效刺激衰老骨骼肌蛋白質(zhì)合成，削弱“合成代謝抵抗”的不良影響并誘發(fā)正性凈蛋白質(zhì)平衡，已成為學(xué)界近年來(lái)所關(guān)注的重點(diǎn)研究領(lǐng)域。

3.1 同期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)老年小鼠骨骼肌蛋白質(zhì)合成水平的影響

蛋白質(zhì)合成率與含量是用于評(píng)價(jià)衰老骨骼肌蛋白質(zhì)合成水平的關(guān)鍵指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，衰老導(dǎo)致了骨骼肌蛋白質(zhì)合成水平的顯著下調(diào)，但8 周同期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可顯著改善這一變化，致其蛋白質(zhì)合成率增長(zhǎng)12.3%，總蛋白質(zhì)含量增長(zhǎng)15.2%，肌原纖維蛋白質(zhì)含量增長(zhǎng)15.0%，肌纖維直徑與橫截面積分別增長(zhǎng)了12.6%和27.4%。

運(yùn)動(dòng)是促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成的有效刺激，無(wú)論被試處于何種年齡階段，運(yùn)動(dòng)均可誘發(fā)肌原纖維和線粒體蛋白質(zhì)合成率顯著增長(zhǎng)[26，27]。Yarasheski[28，29]研究組的早期報(bào)道表明，抗阻訓(xùn)練可致老年男性與女性被試混合肌蛋白質(zhì)合成率明顯增長(zhǎng)；而B(niǎo)rightwell 等[30]近年研究則提示，24 周中等強(qiáng)度有氧訓(xùn)練可使老年被試混合肌基礎(chǔ)蛋白質(zhì)合成率增長(zhǎng)高達(dá)50.7%，與Short 等[31]及Harber研究組[32，33]此前報(bào)道的結(jié)果一致。但是，聯(lián)合力量與耐力素質(zhì)訓(xùn)練的同期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練是否能夠產(chǎn)生類似的作用效應(yīng)，迄今鮮見(jiàn)報(bào)道。Donges 等[34]以中年被試為研究對(duì)象，分別給予70% 1RM 強(qiáng)度抗阻訓(xùn)練、55% VO2max強(qiáng)度有氧訓(xùn)練及同期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練（以抗阻和有氧訓(xùn)練強(qiáng)度50%比例）干預(yù)，發(fā)現(xiàn)同期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練誘發(fā)了與抗阻訓(xùn)練相近的肌原纖維蛋白質(zhì)合成率，及與有氧訓(xùn)練相近的線粒體蛋白質(zhì)合成率。值得注意的是，該研究的同期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練方案中僅采用了50%的抗阻與有氧訓(xùn)練強(qiáng)度，卻同時(shí)促進(jìn)了肌原纖維與線粒體蛋白質(zhì)合成水平的有效增長(zhǎng)。Colleluori 等[35]的近期研究將120名肥胖老年人隨機(jī)納入有氧、抗阻或同期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組，進(jìn)行為期6個(gè)月的運(yùn)動(dòng)干預(yù)，結(jié)果觀察到抗阻與同期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)組被試股外側(cè)肌蛋白質(zhì)合成率較安靜對(duì)照被試出現(xiàn)了顯著增長(zhǎng)，且抗阻訓(xùn)練組較有氧訓(xùn)練組被試的差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。筆者認(rèn)為，上述研究結(jié)果不僅較好地佐證了同期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)衰老骨骼肌蛋白質(zhì)合成率的改善作用，且其較單獨(dú)有氧或抗阻訓(xùn)練對(duì)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度要求較低的特點(diǎn)可能更加凸顯了其在老年人群中的應(yīng)用潛力。

就運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌蛋白質(zhì)含量的影響而言，目前的研究結(jié)果仍然莫衷一是。Linderman等[36，37]早期的研究表明，抗阻訓(xùn)練可以使后肢懸吊模型大鼠骨骼肌肌原纖維蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)顯著增長(zhǎng)，Willoughby等[38]的人體實(shí)驗(yàn)研究亦觀察到了相同的結(jié)果。而Haus等[39]則觀察到雙側(cè)下肢懸吊和臥床被試在分別接受35 天與90 天抗阻訓(xùn)練后，其股外側(cè)肌混合蛋白質(zhì)含量、肌原纖維蛋白質(zhì)含量與肌漿蛋白質(zhì)含量變化均未見(jiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Roberts 等[40]對(duì)健康青年被試的研究亦報(bào)道了類似的結(jié)果。盡管目前未見(jiàn)同期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)衰老骨骼肌蛋白質(zhì)含量影響的相關(guān)報(bào)道，但本研究及我們此前的報(bào)道[17]均提示，此干預(yù)手段可以促進(jìn)衰老骨骼肌總蛋白質(zhì)含量的提高（即增強(qiáng)蛋白質(zhì)沉積），且此效應(yīng)可能主要來(lái)自于肌原纖維蛋白質(zhì)含量的增長(zhǎng)，而非肌漿蛋白質(zhì)的變化。結(jié)合前述關(guān)于蛋白質(zhì)合成率的評(píng)價(jià)結(jié)果，筆者認(rèn)為其亦可在一定程度上佐證蛋白質(zhì)含量增長(zhǎng)的變化趨勢(shì)。此外，由于衰老性骨骼肌的萎縮性變化主要發(fā)生于快縮型骨骼肌內(nèi)，MHCⅡb在典型快肌中的相對(duì)表達(dá)對(duì)于骨骼肌收縮表型及纖維類型具有至關(guān)重要的意義，因此，MHCⅡb表達(dá)水平的上調(diào)亦在一定程度上佐證了其蛋白質(zhì)合成水平的增強(qiáng)。但是，鑒于目前相關(guān)研究結(jié)果的分歧，在后續(xù)研究中仍需進(jìn)一步排除運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)間隔和干預(yù)周期差異對(duì)研究結(jié)果造成的混雜影響，而在應(yīng)用惡病質(zhì)等其它疾病萎縮性模型所開(kāi)展的相關(guān)研究中還需注意結(jié)合骨骼肌蛋白質(zhì)降解水平的變化進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

3.2 同期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)老年小鼠骨骼肌形態(tài)與功能的影響

如前所述，抗阻訓(xùn)練可致衰老骨骼肌肌力顯著增強(qiáng)[11，41]，研究提示有氧運(yùn)動(dòng)具有類似效應(yīng)[9，10]，且大量針對(duì)非老年人群開(kāi)展的實(shí)驗(yàn)研究亦表明同期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練均可刺激被試肌力增長(zhǎng)[42，43]。Timmons 等[44]的研究中，將84名老年被試平均納入對(duì)照、有氧訓(xùn)練、抗阻訓(xùn)練與同期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)組內(nèi)，各訓(xùn)練組被試每周訓(xùn)練3次，每周訓(xùn)練時(shí)長(zhǎng)均固定為72 分鐘。經(jīng)過(guò)為期6 周和12 周干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，同期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練僅在12周干預(yù)后使得被試握力出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增長(zhǎng)，但6 周與12 周干預(yù)均可致被試臥推及腿舉的1RM 值明顯增加，且同期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練導(dǎo)致的推舉力量增長(zhǎng)較抗阻訓(xùn)練更為顯著。Kirk等[45]針對(duì)老年被試施加16 周同期抗阻與功能訓(xùn)練干預(yù)，結(jié)果亦觀察到了臥推、腿舉與肱二頭肌彎舉1RM值顯著提高。Alcazar等[46]以老年慢性阻塞性肺病患者為研究對(duì)象的實(shí)驗(yàn)中，12 周同期高強(qiáng)度間歇與爆發(fā)力訓(xùn)練亦產(chǎn)生了類似的影響。就運(yùn)動(dòng)耐力而言，目前鮮見(jiàn)同期有氧與抗阻訓(xùn)練對(duì)衰老人體與動(dòng)物影響的相關(guān)報(bào)道，但Alcazar 等[46]的研究中觀察到了被試最大攝氧量與最大功率等運(yùn)動(dòng)能力指標(biāo)的顯著增長(zhǎng)；且Losa-Reyna[47]近年對(duì)衰弱老年被試進(jìn)行為期6 周的同期爆發(fā)力與高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練干預(yù)，亦觀察到了類似的研究結(jié)果。

協(xié)調(diào)性、肌肉力量與運(yùn)動(dòng)耐力是衰老性骨骼肌萎縮的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究觀察到，衰老使小鼠網(wǎng)屏懸吊時(shí)間、最大抓握肌力與力竭游泳能力均顯著下降，而8 周同期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)可使其有效改善，與前述研究結(jié)果基本一致。盡管存在研究對(duì)象、評(píng)價(jià)指標(biāo)及干預(yù)方案的差異，但筆者認(rèn)為綜合目前可考的研究文獻(xiàn)結(jié)果，仍然提示了其在改善衰老機(jī)體骨骼肌功能方面的重要潛力。在后續(xù)研究中，尚需探明低強(qiáng)度功能訓(xùn)練、中等強(qiáng)度有氧訓(xùn)練、高強(qiáng)度間歇有氧訓(xùn)練聯(lián)合肌肉肥大型抗阻訓(xùn)練與爆發(fā)式抗阻訓(xùn)練進(jìn)行干預(yù)對(duì)被試骨骼肌功能的作用差異，以及改變有氧與抗阻訓(xùn)練的順序及間隔可能導(dǎo)致的不同適應(yīng)性變化。

3.3 同期訓(xùn)練對(duì)老年小鼠骨骼肌蛋白質(zhì)合成水平的間接評(píng)價(jià)

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mTORC1）信號(hào)的胞內(nèi)誘導(dǎo)與傳遞功能障礙是誘發(fā)骨骼肌蛋白質(zhì)合成減少的關(guān)鍵機(jī)制。mTORC1由mTOR、Raptor、mLST8及幾個(gè)非核心亞基構(gòu)成，活化的mTOR 可刺激骨骼肌蛋白質(zhì)合成與適應(yīng)性肥大，特異性阻斷mTOR 功能表達(dá)可抑制骨骼肌適應(yīng)性肥大變化高達(dá)95%，因此其活化水平直接影響衰老性骨骼肌萎縮的干預(yù)效應(yīng)[48]。作為mTOR下游靶蛋白，p70S6K與4E-BP1在調(diào)控骨骼肌蛋白質(zhì)合成過(guò)程中亦有重要貢獻(xiàn)：活化的p70S6K可磷酸化核糖體S6蛋白，進(jìn)而控制著5’端含有末端寡聚嘧啶的一類信使RNAs 的翻譯效率；而4E-BP1 活化后則可從eIF4E 復(fù)合物中解離，并與eIF4G 與eIF4A 這兩種蛋白質(zhì)結(jié)合形成eIF4F復(fù)合物，從而對(duì)帽依賴性翻譯的起始產(chǎn)生重要影響。因此，骨骼肌mTOR/p70S6K/4EBP1通路的活化亦可被視為蛋白質(zhì)合成水平升高的間接評(píng)價(jià)指標(biāo)[16，49]。

同期有氧與抗阻訓(xùn)練對(duì)衰老骨骼肌mTOR信號(hào)通路的影響迄今未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。Camera等[50]對(duì)青年被試進(jìn)行的急性同期運(yùn)動(dòng)干預(yù)研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)結(jié)束后1 小時(shí)mTORSer2448磷酸化水平出現(xiàn)了顯著上調(diào)，但在4 小時(shí)后即已恢復(fù)至安靜水平，且p70S6KThr389磷酸化水平無(wú)變化。而Fernandez-Gonzalo 等[51]的研究中，青年被試經(jīng)過(guò)5 周同期有氧與抗阻訓(xùn)練后，給予一次急性有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)并在6 小時(shí)后進(jìn)行抗阻運(yùn)動(dòng)，在抗阻運(yùn)動(dòng)前和運(yùn)動(dòng)后3 小時(shí)進(jìn)行股外側(cè)肌活檢，結(jié)果僅見(jiàn)p70S6KThr389磷酸化水平顯著上調(diào)。本研究則發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)為期8 周同期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后24 小時(shí)，骨骼肌mTORSer2448、p70S6KThr389與4E-BP1Thr37/46磷酸化表達(dá)較安靜對(duì)照組均顯著增強(qiáng)，與Ogasawara 等[52]此前報(bào)道的研究結(jié)果一致。筆者認(rèn)為，前人研究結(jié)果的差異主要在于干預(yù)方案以及研究設(shè)計(jì)的區(qū)別，而本研究所觀察到的結(jié)果間接佐證了衰老小鼠骨骼肌蛋白質(zhì)合成水平增強(qiáng)，同時(shí)亦提示該通路在骨骼肌蛋白質(zhì)合成代謝響應(yīng)同期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練刺激過(guò)程中具有重要調(diào)控作用。但是，該過(guò)程中mTOR的上游調(diào)控蛋白仍有待進(jìn)一步研究探明。

4 結(jié)論

同期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠刺激衰老小鼠快縮型骨骼肌蛋白質(zhì)合成率上調(diào)并促進(jìn)蛋白質(zhì)沉積，同時(shí)增強(qiáng)其協(xié)調(diào)性、最大抓握肌力與運(yùn)動(dòng)能力，具有改善衰老性骨骼肌萎縮的重要潛力。就其作用機(jī)制而言，可能涉及快縮型骨骼肌內(nèi)mTOR/p70S6K/4E-BP1 信號(hào)通路的活化。在后續(xù)研究中，首先，需厘清不同的同期訓(xùn)練方案（含不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、運(yùn)動(dòng)量、有氧與抗阻訓(xùn)練順序及間隔）對(duì)蛋白質(zhì)合成水平可能產(chǎn)生的不同影響。其次，需要借助生物信息學(xué)分析或基因芯片分析等手段，鑒定出mTOR/p70S6K/4E-BP1 信號(hào)通路響應(yīng)同期有氧與抗阻訓(xùn)練刺激的關(guān)鍵上游調(diào)節(jié)通路與蛋白，并通過(guò)完全性/條件性基因敲除動(dòng)物模型或阻斷劑的使用予以驗(yàn)證。最后，亦需進(jìn)一步探明此類適應(yīng)性變化是否能夠轉(zhuǎn)化為對(duì)人體被試的有益促進(jìn)，從而為相關(guān)靶點(diǎn)與機(jī)制在臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論與實(shí)驗(yàn)線索。