吳傳超,梁瑞雨,張洪濤,高敏杰,朱莉,詹曉北

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

環(huán)β-1,2-葡聚糖(cyclosophoraose, Cys)是由根瘤菌屬和土壤農(nóng)桿菌屬等微生物合成環(huán)狀低聚糖,由β-1,2連接的D-吡喃葡萄糖單元組成[1]。Cys具有良好的水溶性(Cys為250 g/L;環(huán)糊精為18 g/L),且聚合度較環(huán)糊精聚合度大(Cys為17～25;環(huán)糊精為6～8),環(huán)狀空腔直徑更大(Cys為1.30 nm;環(huán)糊精為0.85 nm)[2]。Cys最重要的功能特性是由于其具有適應(yīng)性的疏水三維腔,能夠與廣泛的客體分子形成非共價(jià)包合物。這些主-客體體系的包合物通過氫鍵、范德華相互作用和靜電吸引等各種相互作用發(fā)生[3]。相比于環(huán)糊精,單位體積的Cys可以包合更多的物質(zhì)、攜帶更大的分子[4],使得Cys在食品、藥物遞送系統(tǒng)、醫(yī)學(xué)應(yīng)用中顯示出巨大的應(yīng)用前景[5]。

姜黃素(curcumin, Cur)是一種從干燥的姜黃根莖中提取的傳統(tǒng)多酚,被稱為黃金營(yíng)養(yǎng)品[6]。Cur具有多種促進(jìn)結(jié)腸健康作用的膳食多酚而備受關(guān)注[7]。但其在水溶液中的溶解度較差(0.6 μg/mL)且穩(wěn)定性低,在到達(dá)結(jié)腸之前會(huì)在消化道發(fā)生降解或代謝,限制其商業(yè)應(yīng)用[8]。因此,增加Cur水溶性從而提高其生物利用度顯得尤為重要。Cur結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)芳香環(huán),攜帶多個(gè)羥基,可以與糖形成綴合物[9]。雖然已有報(bào)道環(huán)糊精與Cur形成絡(luò)合物以提高其水溶解度[10],但其強(qiáng)結(jié)合力和較低的水膨脹能力可能會(huì)給環(huán)糊精作為Cur的高效遞送系統(tǒng)帶來內(nèi)在缺陷。因此選擇更合適載體來改善其溶解度,保護(hù)其在胃中的不利條件并保持其在結(jié)腸中的釋放調(diào)節(jié)腸道菌群顯得尤為重要[7]。

研究表明,腸道微生物對(duì)人類健康起著重要作用,包括維持腸道屏障的完整性、增強(qiáng)人體免疫力、抑制腸道病原體和維護(hù)腸道生態(tài)平衡[11]。因此,保持腸道微生物的多樣性和動(dòng)態(tài)平衡對(duì)宿主健康至關(guān)重要。益生元是一些不被宿主消化吸收,能夠選擇性促進(jìn)體內(nèi)有益生菌代謝和增殖,能夠幫助宿主改善機(jī)體健康[12]。一些膳食纖維,特別是抗性低聚糖(低聚果糖)(fructo oligosaccharide, FOS)被公認(rèn)為理想益生元[13]。此外,越來越多的研究[7-8]還證明了酚類物質(zhì)與腸道微生物群之間的相互作用,表明它們是益生元的候選化合物。酚類物質(zhì)通過選擇性地刺激結(jié)腸中有益細(xì)菌的生長(zhǎng)或活性和抑制潛在的致病性細(xì)菌來調(diào)節(jié)微生物多樣性,對(duì)宿主產(chǎn)生有價(jià)值的影響。相反,腸道微生物也可以調(diào)節(jié)酚類化合物的活性。這種相互作用可以調(diào)節(jié)酚類物質(zhì)的代謝和生物利用度,將其轉(zhuǎn)化為有利代謝物[12]。益生元經(jīng)過腸道微生物發(fā)酵后主要代謝物是短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs),主要成分是乙酸、丙酸和丁酸等,它們對(duì)于維持大腸的正常功能和結(jié)腸上皮細(xì)胞的形態(tài)和功能具有重要作用[11]。因此,我們假設(shè)結(jié)合Cur可能是Cys/Cur對(duì)健康益處的關(guān)鍵因素。Cys是腸道遠(yuǎn)端束結(jié)合Cur的載體,在遠(yuǎn)端束發(fā)生潛在的微生物轉(zhuǎn)化。然而,Cys中結(jié)合Cur的釋放及其對(duì)Cys/Cur益生特性的影響尚不清楚。

鑒于上述情況,首先探究Cys/Cur對(duì)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬體外發(fā)酵培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),比較FOS、Cys和Cys/Cur對(duì)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬常見腸道益生菌益生活性的影響,評(píng)價(jià)其對(duì)不同雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸能力。在此基礎(chǔ)上,通過體外模擬胃腸道消化和健康人糞便發(fā)酵進(jìn)一步探究Cys/Cur潛在益生特性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

動(dòng)物雙歧桿菌(Bifidobacterium.animals)ZJTZ1M2、短雙歧桿菌(Bifidobacterium.breve)FWX346、青春雙歧桿菌(Bifidobacterium.adolescentis)FHNFQ41M3、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus.acidophilu)LA28、干酪乳桿菌(Lactobacillus.casei)FJSSZ4L6、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus.rhamnosus)FFJLY7L1來自江南大學(xué)(中國(guó)無錫)食品微生物菌種保藏中心。

1.2 試劑與培養(yǎng)基成分

人工胃液和人工腸液,南京新帆生物科技有限公司;薄層色譜板[(thin-layer chromatography, TLC),硅膠60],綠百草科技有限公司;微孔濾膜,南通海之星實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;姜黃素,中國(guó)中大公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。Cys和Cys/Cur參考WU等[14]的方法,由本實(shí)驗(yàn)室合成。

MRS培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10.0、牛肉提取物10.0、酵母提取物5.0、葡萄糖3.0、K2HPO42.0、乙酸鈉5.0、MgSO40.2、MnSO40.2、CaCl20.45、檸檬酸銨2.0、L-半胱氨酸0.5、吐溫80 1 mL,pH 6.5;腸道厭氧基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨2.0、酵母提取物2.0、NaHCO32.0、NaCl 0.1、KH2PO40.04、K2HPO40.04、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5、牛膽鹽0.5、CaCl20.01、MgSO40.01、血紅素0.025、刃天青0.001、維生素K 0.002、吐溫80 2 mL。

1.3 儀器與設(shè)備

HYQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;安捷倫-1260高效液相色譜儀、7890A氣相色譜儀,美國(guó)Agilent公司;SBA-40生物傳感分析儀,山東省科學(xué)院生物研究所。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 體外模擬Cys及Cys/Cur的唾液、胃液和小腸液消化

參考SHI等[15]的方法在體外模擬Cys和Cys/Cur消化。將100 mL人工唾液加入到100 mL 樣品溶液(Cys溶液或超純水溶液)(0.5 mg/mL)和100 mL超純水溶液中。唾液消化在37 ℃(100 r/min)的搖床培養(yǎng)箱中進(jìn)行。分別在0、15、30 min時(shí)取5 mL樣品,然后煮沸10 min使唾液淀粉酶失活。剩余唾液消化液進(jìn)一步用于模擬胃消化。

仿生胃腸反應(yīng)器(biomimetic gastrointestinal reactor,BGR)是本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的一種新型體外消化模型,本研究中只使用了胃和小腸反應(yīng)器[12]。剩余的唾液消化液(Cys或超純水溶液)及Cys/Cur溶液通過蠕動(dòng)泵輸送到BGR胃反應(yīng)器中等量的人工胃液中。模擬胃消化液pH值控制在3.0。分別在0、0.5、1、2 h下取胃消化液5 mL,煮沸10 min。剩余的胃消化液 (Cys、Cys/Cur溶液或超純水溶液)通過蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)移到BGR小腸反應(yīng)器中,然后與等體積的人工小腸液結(jié)合。模擬腸道消化液pH值控制在7.0。隨后,分別在0、1、2、4 h收集小腸消化液(5 mL)煮沸后進(jìn)一步分析。從每個(gè)消化階段提取樣品,用蒽酮-硫酸法和DNS比色法測(cè)定Cys消化液中的總糖和還原糖的含量。

1.4.2.檢測(cè)Cys降解和Cys/Cur釋放Cur的方法

薄層色譜法測(cè)定了Cys的模擬消化過程。樣品(2 μL)置于薄層板上,以V(正丁醇)∶V(乙醇)∶V(水)=5∶5∶9為流動(dòng)相,直至展開至適當(dāng)位置。在薄層色譜板上噴上地衣酚試劑(3,5二羥基甲苯900 mg+無水乙醇375 mL+蒸餾水25 mL+濃硫酸50 mL),色譜后在105 ℃下加熱5 min顯色。每個(gè)模擬消化階段的Cys/Cur釋放的Cur檢測(cè)方法參考WU等[14]的方法,Cur的釋放率按照公式(1)計(jì)算:

(1)

1.4.3 雙歧桿菌屬和乳桿菌屬體外靜態(tài)培養(yǎng)方法

體外分批發(fā)酵系統(tǒng)在嚴(yán)格的厭氧條件下進(jìn)行單個(gè)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬菌株的培養(yǎng)。通過在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)來活化細(xì)菌菌株。將FOS、Cys和Cys/Cur分別作為碳源(3 g/L)取代MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖,不含葡萄糖的MRS作為空白組(Blank組)。將種子液以10%的接種比接種于厭氧管中,然后轉(zhuǎn)移到厭氧培養(yǎng)箱中于37 ℃培養(yǎng)24 h,并在0、8、16、24 h分別取樣(5 mL),測(cè)定發(fā)酵液的OD600值、pH值、乙酸和乳酸濃度來評(píng)價(jià)益生活性。

1.4.4 利用人糞便微生物菌群體外發(fā)酵

用無菌糞便收集管采集4名健康志愿者(2男2女,年齡20～25歲)的糞便,將這4份新鮮的糞便在厭氧環(huán)境下等量混合后,用無菌PBS稀釋,得到糞便勻漿10 mg/mL。在無菌條件下通過4層紗布過濾去除殘?jiān)?將糞便勻漿接種到不同組的腸道厭氧基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中。陰性對(duì)照組(Blank組)為腸道厭氧基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(無碳源),實(shí)驗(yàn)組分別以FOS(陽性對(duì)照組)、Cys和Cys/Cur為碳源添加到腸道厭氧基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中,質(zhì)量濃度均為5 mg/mL。37 ℃孵育24 h,在0、8、16、24 h分別采集樣品進(jìn)一步分析。

1.4.5 短鏈脂肪酸和乳酸的測(cè)定

短鏈脂肪酸濃度的測(cè)量采用GAO等[16]的方法。取離心后的發(fā)酵上清液(1 mL),添加終濃度為1 mmol/L的2-甲基丁酸作為內(nèi)標(biāo),再向其中添加250 μL濃鹽酸和1 mL乙醚,振蕩混勻。收集有機(jī)層,使用有機(jī)濾膜過濾后備用。取樣品0.5 μL注入氣相系統(tǒng),采用HP-INOWAX 色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)和火焰離子化檢測(cè)器。乳酸濃度使用生物傳感分析儀測(cè)量。

1.4.6 糞便菌群組成的檢測(cè)方法

用CTAB/SDS法提取基因組DNA,稀釋至1 ng/μL。在稀釋基因組DNA的基礎(chǔ)上選擇特異性引物,用PCR擴(kuò)增16S rRNA基因的V3～V4區(qū)。得到的PCR產(chǎn)物被純化。測(cè)序文庫(kù)使用NEBNext?UltraTMIIDNA Library Prep Kit生成,并用Qubit和Q-PCR進(jìn)行定量。最后,在Illumina NovaSeq平臺(tái)上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序[8]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Origin 2022軟件進(jìn)行制圖,所有實(shí)驗(yàn)在3個(gè)生物重復(fù)中進(jìn)行。采用單因素方差分析和Duncan′s檢驗(yàn)(mean±SD,n=3),用SPSS 19.0軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cys和Cys/Cur體外消化實(shí)驗(yàn)

如附表1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034734),Cys的總糖和還原糖含量在不同的消化時(shí)間沒有顯著變化。因此,消化液不會(huì)降解Cys,也不會(huì)導(dǎo)致還原糖含量的增加(P<0.05)。如附圖1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034734),Cys降解不顯著,說明Cys對(duì)胃腸道的水解條件和消化酶反應(yīng)穩(wěn)定。從而使它們成為有益的結(jié)腸細(xì)菌可用的、更持久的潛在碳源,還可以作為理想的包埋載體材料來承受胃腸道上部的惡劣環(huán)境。

A-B.animals ZJTZ1M2;B-B.breve FWX346;C-B.adolescentis FHNFQ41M3;D-L.acidophilu LA28;E-L.casei FJSSZ4L6;F-L.rhamnosus FFJLY7L1圖1 不同碳源對(duì)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬發(fā)酵生物量的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on biomass of Bifidobacterium and Lactobacillus fermentation注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)。

如附圖2所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034734),在胃腸道消化過程中,Cys/Cur逐漸分解,釋放出Cur,最終的釋放率為(88±1.8)%。說明Cys/Cur成功地保護(hù)了被包裹的Cur免受暴露于胃消化條件下的消化。這一現(xiàn)象歸因于Cys的存在,可以提供界面層和能量屏障,保護(hù)Cur不被胃蛋白酶消化。在通過模擬腸道的過程中,Cys/Cur包合物中的Cur逐漸釋放。此外,在模擬腸液中,包埋材料聚集并形成團(tuán)塊。這種現(xiàn)象的發(fā)生可能是因?yàn)榘衔锉灰让覆糠炙?pH值和離子強(qiáng)度的改變改變了包合材料之間的靜電相互作用[17]。因此,包埋Cur的Cys可以潛在地?cái)y帶和穩(wěn)定Cur,提高其生物利用度。

A-B.animals ZJTZ1M2;B-B.breve FWX346;C-B.adolescentis FHNFQ41M3;D-L.acidophilu LA28;E-L.casei FJSSZ4L6;F-L.rhamnosus FFJLY7L1圖2 不同碳源對(duì)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬發(fā)酵pH值影響Fig.2 Effects of different carbon sources on pH value of Bifidobacterium and Lactobacillus fermentation

2.2 不同碳源對(duì)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬活性的影響

2.2.1 不同碳源對(duì)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬生長(zhǎng)的影響

不同種屬的益生菌對(duì)碳源的吸收利用與酶系及轉(zhuǎn)運(yùn)能力有很大差異,因此對(duì)不同碳源的利用率會(huì)有很大的不同[18]。與Blank組相比,在發(fā)酵24 h后,不同碳源組(FOS、Cys和Cys/Cur)可以不同程度地促進(jìn)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬生長(zhǎng)(圖1)。以Cys/Cur為碳源的雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的生物量在0～8 h期間內(nèi)顯著增加(P<0.05),在8～24 h生物量增速放緩(P>0.05),在發(fā)酵24 h時(shí),Cys/Cur組對(duì)B.animals、B.breve、B.adolescentis、L.acidophilus、L.casei和L.rhamnosus的OD600值分別為1.184±0.018、1.129±0.026、1.152±0.023、0.902±0.024、0.946±0.025和1.042±0.020。在Cys/Cur組中,與雙歧桿菌屬相比,Cys/Cur對(duì)于乳桿菌屬的增殖作用稍弱,這可能是由于利用碳源的能力取決于其底物偏好性和酶對(duì)復(fù)雜碳源的水解催化能力。此外,乳桿菌屬對(duì)多酚更敏感,低濃度的多酚容易起到抑制生長(zhǎng)的作用[19]。發(fā)酵24 h時(shí),Cys組在雙歧桿菌屬上的生物量顯著低于FOS組(P<0.05),可能的原因是隨著寡糖的聚合度和分子質(zhì)量的增加,其發(fā)酵性降低,需要較長(zhǎng)的發(fā)酵周期[20]。但發(fā)酵24 h后,Cys/Cur組在相同益生菌上的生物量顯著高于Cys和FOS組(P<0.05),可能的原因是結(jié)合的多酚可以通過雙歧桿菌屬和乳桿菌屬中的相關(guān)酶促反應(yīng)從包埋基質(zhì)中釋放成游離形式從而被益生菌修飾成比母體Cur更具益生活性的代謝產(chǎn)物[21]。這些結(jié)果證實(shí)了Cys中結(jié)合Cur可以更好的促進(jìn)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬生長(zhǎng)。

2.2.2 不同碳源對(duì)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬培養(yǎng)基pH值的影響

結(jié)腸的pH值下降程度還可以作為發(fā)酵過程中的產(chǎn)酸能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)[22]。如圖2所示,在發(fā)酵的24 h 期間,Blank組中雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的pH值幾乎沒有變化(P>0.05),始終維持在(6.02±0.02)～(5.78±0.02)。發(fā)酵時(shí)間從0～24 h,FOS、Cys和Cys/Cur組的pH 值均先顯著下降(P<0.05)后趨于穩(wěn)定,變化趨勢(shì)與ΔOD600一致。發(fā)酵結(jié)束時(shí),以Cys/Cur為碳源對(duì)培養(yǎng)基pH的影響最大,各組pH值分別下降至4.72±0.02、4.81±0.02、4.67±0.05、4.89±0.02、4.81±0.04和4.88±0.05,FOS和Cys組的變化相似。以上結(jié)果表明,FOS、Cys和Cys/Cur組可以為雙歧桿菌屬和乳桿菌屬利用發(fā)酵產(chǎn)酸,但同一種益生菌對(duì)不同底物的嗜好性,因而代謝形成酸類物質(zhì)的量不同,致使發(fā)酵的pH值也不同。而隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基本被分解,益生菌的生長(zhǎng)變緩和代謝水平下降,培養(yǎng)基中pH便趨于穩(wěn)定。由于乳桿菌屬在生長(zhǎng)量增加量普遍低于雙歧桿菌屬,導(dǎo)致乳桿菌屬培養(yǎng)基的pH值弱于雙歧桿菌屬,表明乳桿菌屬代謝產(chǎn)酸能力要弱于雙歧桿菌屬。此外,還有一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn),Cys和Cys/Cur在0～4 h時(shí)具有相似的益生元特性,可能是在發(fā)酵初期缺乏足夠的多酚釋放來影響細(xì)菌的益生元特性。

2.2.3 不同碳源對(duì)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬產(chǎn)乙酸和乳酸的影響

如圖3所示,發(fā)酵結(jié)束時(shí),不同底物對(duì)雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的促乙酸及乳酸產(chǎn)生效果的差異顯著。6株益生菌在體外發(fā)酵Cys/Cur過程中產(chǎn)生乙酸濃度分別是(61.11±5.01)、(59.04±2.41)、(57.45±4.46)、(53.63±2.01)、(50.36±4.21)和(52.62±3.01) mmol/L,乳酸質(zhì)量濃度分別是(3.23±0.01)、(3.22±0.03)、(3.30±0.02)、(2.92±0.05)、(3.15±0.03)、(3.48±0.02)mg/mL,顯著高于其他組(P<0.05),此外雙歧桿菌屬產(chǎn)生的乙酸總體略高于乳桿菌屬。

2.3 不同碳源對(duì)健康人腸道菌群的影響

2.3.1 不同碳源對(duì)健康人腸道菌群發(fā)酵pH及SCFAs生成的影響

本研究中,在發(fā)酵0、8、16、24 h后測(cè)定pH和SCFAs濃度(圖4)。益生元可通過降低結(jié)腸的pH值抑制病原體的生長(zhǎng)[22]。圖4-A表明,在無碳源添加(Blank組)的情況下,發(fā)酵液的pH值略微下降,以FOS、Cys和Cys/Cur為碳源進(jìn)行糞菌發(fā)酵,各組發(fā)酵液的pH值均明顯降低,這與單菌發(fā)酵的結(jié)果相一致。其中Cys/Cur組發(fā)酵pH值由7.49±0.11下降至4.32±0.12,顯著低于其他組(P<0.05)。這些結(jié)果表明,FOS、Cys和Cys/Cur發(fā)酵可能產(chǎn)生大量的SCFAs[23]。

A-pH值;B-乙酸;C-丙酸;D-丁酸;E-總短鏈脂肪酸;F-乳酸圖4 不同碳源與糞菌發(fā)酵對(duì)pH和SCFAs濃度的影響Fig.4 Effects of different carbon sources during fecal fermentation on pH and SCFAs concentration in vitro

由圖4-B可知,發(fā)酵結(jié)束時(shí),各組的乙酸生成量在SCFAs中均占主導(dǎo)地位。乙酸有助于保持腸道環(huán)境穩(wěn)定,并滋養(yǎng)結(jié)腸中的其他有益細(xì)菌[24]。FOS、Cys和Cys/Cur組的乙酸濃度分別為(22.48±1.6)、(24.29±1.6)和(30.13±2.01)mmol/L均顯著高于Blank組[(8.98±2.4)mmol/L]。此外,Cys/Cur組產(chǎn)生的乙酸顯著高于FOS和Cys組(P<0.05)。丙酸具有抑制膽固醇的合成、減少脂肪貯存、抗癌和抗炎癥的特性[25]。由圖4-C所示,FOS、Cys和Cys/Cur組在糞便發(fā)酵24 h后所產(chǎn)生的丙酸濃度分別為(5.21±1.2)、(4.16±1.5)、(6.74±1.3)mmol/L,均顯著高于Blank組[(3.47±0.8)mmol/L],并且Cys/Cur組產(chǎn)生的丙酸顯著高于FOS和Cys組(P<0.05)。而丁酸可以保持結(jié)腸細(xì)胞穩(wěn)定,預(yù)防或抑制癌癥的發(fā)生[23]。由圖4-D可知,在發(fā)酵24 h后,Cys和Cys/Cur組產(chǎn)生的丁酸濃度分別為(1.01±0.2) mmol/L和(1.44±0.2) mmol/L,低于FOS組[(1.77±0.5) mmol/L]。乳酸對(duì)免疫系統(tǒng)也有好處,它可以作為促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)因子。Cys/Cur組產(chǎn)生的乳酸質(zhì)量濃度為(1.61±0.03)mg/mL(圖4-F)。以上研究結(jié)果表明Blank組相比,FOS、Cys和Cys/Cur組能夠增加SCFAs的產(chǎn)生。同時(shí),Cys和Cys/Cur對(duì)腸道菌群產(chǎn)SCFAs的產(chǎn)量和比例不同,因?yàn)镃ys和Cys/Cur在結(jié)構(gòu)上存在差異,所以它們?cè)谀c道菌群中有不同的酵解途徑,進(jìn)而對(duì)腸道菌群的主要代謝產(chǎn)物產(chǎn)生不同的影響。

2.3.2 不同碳源對(duì)健康人腸道微生物菌群的影響

基于細(xì)菌豐富度(Chao1指數(shù))和多樣性(Shannon和Simpson指數(shù))比較,與Cys組相比,Cys/Cur組的Chao1指數(shù)略有下降,但差異不顯著(P>0.05),但是Simpson和Shannon指數(shù)均高于Cys組(圖5-A)。因此,與Cys組相比,Cys/Cur組可顯著增加腸道微生物的多樣性,這可能與多酚的釋放和代謝密切相關(guān)[26]?；诩訖?quán)的UniFrac距離進(jìn)行了主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)(圖5-B),各組的菌群結(jié)構(gòu)各成一簇,有明顯差異。結(jié)果表明腸道微生物菌群對(duì)不同碳源的響應(yīng)機(jī)制不同。但是腸道微生物在代謝中的作用是復(fù)雜的,為了進(jìn)一步研究Cys/Cur釋放的結(jié)合多酚對(duì)微生物組成的可能影響,必須在門和屬水平上進(jìn)行研究。

A-腸道菌群α多樣性;B-PCoA;C-門水平;D-屬水平圖5 不同碳源對(duì)健康人腸道菌群組成的影響Fig.5 Effects of different carbon sources on gut microbiota composition of healthy human

在門水平上,變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)在各組中均占90%以上(圖5-C)。由于這些結(jié)果與人體腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)一致,體外糞便發(fā)酵試驗(yàn)可以很好地模擬人體腸道菌群[9]。與Cys組相比,Cys/Cur組放線菌門和厚壁菌門的相對(duì)豐度增加,變形菌門的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)。放線菌門則以雙歧桿菌為代表;厚壁菌門的大多數(shù)成員都是有益菌,如乳酸桿菌;變形菌門中多數(shù)細(xì)菌對(duì)人體具有致病性,如大腸桿菌、沙門氏菌等。發(fā)酵24 h后,FOS、Cys和Cys/Cur組中擬桿菌門的相對(duì)豐度低于Blank組,這可能與發(fā)酵pH值較低有關(guān)。先前的研究結(jié)果表明[7],酸性條件可以抑制酸敏感擬桿菌的生長(zhǎng),導(dǎo)致發(fā)酵24 h后擬桿菌門豐度降低。在屬的水平上(圖5-D),發(fā)酵24 h后,與FOS和Cys組相比,Cys/Cur組的雙歧桿菌屬和乳桿菌屬等益生菌屬顯著增加(P<0.05),顯著抑制了乳球菌屬、鏈球菌屬和克雷伯桿菌屬等條件致病菌的生長(zhǎng)(P<0.05)。此外,與Blank組相比,Cys組雙歧桿菌屬和乳桿菌屬增殖,克雷伯桿菌屬減少。綜上所述,Cys對(duì)Cur的包封具有互惠互利的作用,Cys不僅可以作為合適的包埋載體,還可以作為益生元影響腸道菌群的豐度和組成。Cys/Cur組中包合的Cur也可以影響腸道微生物群的豐度和組成,同時(shí)也對(duì)腸道屏障功能有積極影響[9]。

通過線性判別分析,以確定各組腸道菌群中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生物標(biāo)志物?；诰€性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)評(píng)分大于4分,得到的直方圖和分支圖如圖6所示。總體水平分析顯示,Cys/Cur與Blank組間有18個(gè)分類操作單元(operational taxonomic units, OTUs)顯著差異,Cys/Cur與FOS組間有22個(gè)OTUs顯著差異,Cys/Cur與Cys組間共有15個(gè)OTUs顯著差異(圖6-A)。結(jié)果表明,在Cys組中,富集了多種致病菌,如大腸桿菌志賀菌。但是在Cys/Cur組顯著富集很多益生菌,如雙歧桿菌屬、乳桿菌屬。雙歧桿菌屬負(fù)責(zé)將Cys/Cur中的Cur生物轉(zhuǎn)化為具有生物活性的酚類代謝產(chǎn)物[9],同時(shí)Cur及其位于腸道的生物活性代謝產(chǎn)物影響腸道微生物群的豐度和組成。因此,從致病腸道菌群到有益腸道菌群的改變可能有助于改善腸道健康和相關(guān)疾病。綜上所述,Cys/Cur調(diào)控改變了腸道菌群組成,促進(jìn)了有益菌群的增殖和抑制了有害菌的生長(zhǎng),具有一定的益生功能。

A-不同碳源組的線性判別分析得分分布直方圖; B-不同碳源組的線性判別分析得分分布分支圖圖6 不同碳源糞便體外發(fā)酵24 h微生物群落的線性判別分析Fig.6 The LEfSe analysis of gut microbiota communities after in vitro 24 h fecal fermentation with different carbon sources

3 結(jié)論

本研究通過體外模擬消化實(shí)驗(yàn)表明Cys對(duì)模擬唾液、胃液和小腸液具有抗消化性,可以順利到達(dá)結(jié)腸。在模擬胃腸道消化的過程中,Cys/Cur包合物中的Cur逐漸釋放,最終釋放率達(dá)到(88±1.8)%。在消化的基礎(chǔ)上研究Blank、FOS、Cys和Cys/Cur組與特定腸道益生菌株的增殖效果及乙酸和乳酸濃度進(jìn)行分析,結(jié)果表明,不同底物對(duì)模式益生菌表現(xiàn)為不同程度的益生元效應(yīng),其中以Cys/Cur組益生效果最好。其次通過健康人糞便的體外發(fā)酵進(jìn)一步驗(yàn)證了不同碳源的益生特性,與Cys和FOS組相比,Cys/Cur在24 h顯著增強(qiáng)了乙酸、丙酸和乳酸的產(chǎn)量,其濃度分別達(dá)到(30.13±2.01)、(6.74±1.3)mmol/L和(1.61±0.03) mg/mL。與Cys和FOS組相比,Cys/Cur組的雙歧桿菌屬和乳桿菌屬等有益菌增殖,乳球菌、鏈球菌屬和克雷伯桿菌屬等潛在致病菌的相對(duì)豐度顯著減少。與Blank組相比,Cys組的乙酸濃度顯著提高,達(dá)到(24.29±1.6) mmol/L,Cys組的雙歧桿菌屬和乳桿菌屬等關(guān)鍵細(xì)菌種類豐度增加,克雷伯桿菌屬等致病菌的相對(duì)豐度顯著減少。綜上,Cys/Cur調(diào)控改變了腸道菌群組成,促進(jìn)了有益菌群的增殖和抑制了有害菌的生長(zhǎng),具有雙重的益生功能。但離真正推廣到食品領(lǐng)域中還有很長(zhǎng)距離,接下來應(yīng)從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)入手,為Cys/Cur在食品中應(yīng)用提供更加充分?jǐn)?shù)據(jù)和理論支持。