辛凌翔，王豪杰，劉燕，姚文生，胡云皓，張一幟，趙浩然，鑫婷，朱良全*

(1. 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100081)

結(jié)核病主要是由分枝桿菌感染引起的一種嚴(yán)重危害人類和動(dòng)物健康的慢性傳染病，是全球傳播范圍最廣、持續(xù)時(shí)間最久、危害最為嚴(yán)重的人獸共患傳染病之一。分枝桿菌種類繁多，現(xiàn)已超過190種[1]，包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌、牛分枝桿菌等)[2]、麻風(fēng)分枝桿菌及其他非結(jié)核分枝桿菌(NTM)[3]。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中的結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌是主要的人獸共患病病原菌[4]，二者基因組同源性達(dá)到99.95%，而禽分枝桿菌雖對牛無顯著致病性，但牛感染禽分枝桿菌后可干擾牛結(jié)核病的檢疫[5]。

目前，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(WOAH)推薦結(jié)核菌素(PPD)皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)檢測牛結(jié)核病，但該方法檢驗(yàn)時(shí)間長，主觀判斷性強(qiáng)，環(huán)境分枝桿菌以及副結(jié)核分枝桿菌的感染易造成非特異性反應(yīng)，干擾檢測結(jié)果[6-7]。病料、奶樣和鼻分泌物可以用PCR方法進(jìn)行疫病診斷并可對感染菌株進(jìn)行分群鑒定。目前多種基因可作為病原學(xué)的檢測靶標(biāo)，其中Mpb64基因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌群的特有基因[8-9]；IS6110屬于插入序列 IS3 家族的一個(gè)成員，只存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中[9]，可作為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的分子檢測靶標(biāo)[10]；IS1081是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群共有的插入序列，為功能性轉(zhuǎn)座子，結(jié)核分枝桿菌有10～20個(gè)拷貝數(shù)[11-12]，牛分枝桿菌僅有1～6個(gè)拷貝數(shù)，該基因可用于鑒別結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌。此外，16S rRNA也常作為分枝桿菌屬的鑒定基因，因其在細(xì)菌基因組中的豐度較高且序列較為保守，是進(jìn)行細(xì)菌系統(tǒng)進(jìn)化和分類的經(jīng)典方法之一。因此，可以通過檢測IS6110[9，13]、IS1081[11，14]、Mpb64[8，15]，快速區(qū)分非結(jié)核分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，將16S rRNA作為分枝桿菌群的鑒定基因。然而，針對不同靶基因所建立的PCR檢測方法，其敏感性與特異性存在差異，檢測效果存在差異。因此，本研究對牛分枝桿菌4種常見的特異性基因設(shè)計(jì)檢測體系，采用PCR論證了體系的特異性和敏感性，并利用人工模擬牛分枝桿菌感染組織樣本(肺臟、淋巴結(jié)、奶樣)比較不同PCR方法檢測樣品的可適性，研究數(shù)據(jù)對于開展牧場結(jié)核病的檢測和凈化具有一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 參考菌株及試劑

牛分枝桿菌C68001、牛分枝桿菌AN5、禽分枝桿菌C68202、胞內(nèi)分枝桿菌C68226、副結(jié)核分枝桿菌 C68681、牛種布魯菌2308株、羊種布魯菌Rev.1株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所供應(yīng)；2×TaqPCR Master Mix、細(xì)菌基因組核酸提取試劑盒購自TaKaRa公司；7H10固體培養(yǎng)基、7H9液體培養(yǎng)基、OADC增菌液購自BD公司；分枝桿菌陰性的健康牛組織樣本由本實(shí)驗(yàn)采集并保存；全脂牛奶(蒙牛)，購自超市。

A. 1號引物；B. 2號引物；C. 3號引物；D. 4號引物；M. DNA Marker(DL2000)；N. 陰性對照；1～11. 退火溫度依次為53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63 ℃。

A. 1號引物；B. 2號引物；C. 3號引物；D. 4號引物；M. DNA Marker(DL2000)；1. 牛種布魯菌2308；2. 羊種布魯菌Rev.1；3. 牛分枝桿菌C68001；4. 牛分枝桿菌AN5；5. 禽分枝桿菌C68202；6. 副結(jié)核分枝桿菌C68681；7. 胞內(nèi)分枝桿菌C68226；8. 陰性對照。

A. 1號引物；B. 2號引物；C. 3號引物；D.4號引物；M. DNA Marker(DL2000)；1～8. DNA濃度依次為10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10 ng/μL。

1.2 引物合成

所有引物由Invitrogen公司合成，引物序列見表1。

1.3 測定最適宜退火溫度(Tm)

采用生物信息學(xué)軟件Primer 5評價(jià)4對引物的Tm，確定其退火溫度范圍。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2×TaqPCR Master Mix 10 μL；模板、上游引物、下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s，退火溫度為53～63 ℃ (退火溫度按照1 ℃梯度遞增)，30 s，72 ℃，1 min，循環(huán)30 次；最后，72 ℃，延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 敏感性試驗(yàn)

1.4.1 菌液培養(yǎng)及核酸提取

將牛分枝桿菌AN5株凍干菌株用0.2 mL 7H9液體培養(yǎng)基溶解(含10% OADC)，劃線接種2支7H10固體培養(yǎng)基斜面，37 ℃靜置培養(yǎng)21～30 d，挑取單個(gè)干燥顆粒狀菌落接種于10 mL 7H9液體培養(yǎng)基，于37 ℃靜置培養(yǎng)14 d。菌液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，6 000 r/min離心10 min，棄去上清液；沉淀再用1 mL無菌PBS重懸，轉(zhuǎn)入1.5 mL無菌EP管，于80 ℃水浴滅活2 h，6 000 r/min離心10 min，棄去上清液；按照細(xì)菌基因組提取試劑盒革蘭陽性菌基因組提取步驟，提取沉淀物的細(xì)菌核酸，并用NanoDrop測定其濃度。

1.4.2 最低檢測限確定

用TE溶液將核酸濃度10倍倍比稀釋(10-3～10-10ng/μL)，并設(shè)置陰性對照，然后運(yùn)用已優(yōu)化的PCR方法確定不同引物對分枝桿菌復(fù)合群基因組的最低檢測限。

1.5 特異性試驗(yàn)

1.5.1 菌液培養(yǎng)及核酸提取

將牛分支桿菌C68001株、牛分支桿菌AN5株、禽分枝桿菌C68202株、胞內(nèi)分枝桿菌C68226株和副結(jié)核分枝桿菌C68681株按1.4.1方法培養(yǎng)并提取細(xì)菌基因組。牛種布魯菌2308株、羊種布魯菌Rev.1株分別接種大豆酪蛋白瓊脂平板(TSA)，37 ℃培養(yǎng)3 d后，用5 mL生理鹽水洗下，80 ℃水浴滅活2 h，用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取核酸，并用NanoDrop檢測細(xì)菌基因組濃度。

1.5.2 PCR特異性檢測

使用已優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件和程序分別對上述菌株核酸進(jìn)行檢測，并設(shè)置陰性對照，以檢測各個(gè)引物的特異性。

1.6 對人工模擬臨床樣品檢測限的測定

1.6.1 人工模擬感染組織樣本(肺臟/淋巴結(jié))檢測

將牛分枝桿菌AN5單菌落接種至10 mL 7H9液體培養(yǎng)基(含10% OADC)，置37 ℃靜置培養(yǎng)14 d，6 000 r/min離心10 min，棄去上清液，無菌PBS溶液重懸菌體，測定OD600值，并用無菌PBS溶液將OD600值調(diào)至1.0(約1×108CFU/mL)。用PBS溶液進(jìn)行10倍倍比稀釋，80 ℃滅活2 h，分別加入到肺臟和淋巴結(jié)組織勻漿液(100 μL)中，每份勻漿加入10 μL稀釋菌液混勻。用組織核酸提取試劑盒，提取基因組作為模板，然后運(yùn)用已優(yōu)化的PCR方法進(jìn)行檢測，確定不同引物對組織中核酸的最低檢測限。

1.6.2 人工模擬感染牛奶樣本檢測

將1.6.1步中稀釋的各濃度菌液，分別加入到1 mL全脂牛奶中，每份加入10 μL稀釋菌液，80 ℃滅活2 h，12 000 r/min離心10 min，棄掉上層乳脂層，用組織核酸提取試劑盒提取基因組后作為模板，運(yùn)用已優(yōu)化的PCR方法，確定不同引物對牛奶中核酸的最低檢測限。

2 結(jié)果

2.1 最佳退火溫度(Tm)的確定

經(jīng)Primer 5軟件分析顯示，設(shè)計(jì)的4對引物Tm范圍在53～63 ℃之間。以牛分枝桿菌C68001基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，4對引物在退火溫度53～63 ℃范圍內(nèi)均能擴(kuò)出目的條帶(圖1)。綜合考慮，選擇溫度適中的60 ℃作為最佳退火溫度，PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 延伸10 min。

2.2 特異性試驗(yàn)

將提取的牛分枝桿菌C68001、牛分枝桿菌AN5、牛種布魯菌2308株、羊種布魯菌Rev.1株、禽分枝桿菌C68202、副結(jié)核分枝桿菌C68681和胞內(nèi)分枝桿菌C68226的核酸作為模板，并設(shè)置陰性對照，進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果顯示：1號引物均能夠檢測牛分枝桿菌、禽分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌；2號、3號和4號引物雖然亦均可檢測牛分枝桿菌，但禽分枝桿菌檢測條帶顯示均較弱。鑒于牛結(jié)核病主要由牛分枝桿菌引起，而禽分枝桿菌可感染牛但不致病，因此2號、3號和4號引物可以用于牛結(jié)核病的檢測(圖2)。由于3號引物在PCR檢測分枝桿菌反應(yīng)中雜帶較多，易產(chǎn)生非特異性，因此不適用于臨床樣品的檢測。

2.3 敏感性試驗(yàn)

提取牛分枝桿菌AN5基因組，經(jīng)NanoDrop檢測其濃度為21 ng/μL，用TE將核酸稀釋至10-3ng/μL，依次進(jìn)行10倍倍比稀釋(10-3～10-10ng/μL)，運(yùn)用已優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖3所示，2號和3號引物對牛分枝桿菌AN5的基因組檢測靈敏度最高，均可達(dá)10-10ng/μL，而1號引物和4號引物對基因組的檢測限分別為10-4ng/μL和10-3ng/μL。

2.4 在模擬臨床樣本中的應(yīng)用

2.4.1 人工模擬感染牛組織樣本(肺臟/淋巴結(jié))的檢測

將10 μL稀釋后的牛分枝桿菌的菌液(1×108CFU/mL)分別加入到健康牛肺臟和淋巴結(jié)組織勻漿(100 μL)中，用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取基因組后進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果顯示：1號引物對牛淋巴結(jié)和肺組織勻漿中牛分枝桿菌的檢測靈敏度最高，可達(dá)1 CFU/mL；2號、3號和4號引物對淋巴結(jié)和肺組織勻漿的牛分枝桿菌檢測靈敏度為105～106CFU/mL (圖4、圖5)。

A.1號引物；B.2號引物；C.3號引物；D.4號引物；M. DNA Marker(DL2000)；1～8. 牛分枝桿菌AN5的菌液濃度依次是107、106、105、104、103、102、10、1 CFU/mL。

A.1號引物；B.2號引物；C.3號引物；D. 4號引物；M. DNA Marker(DL2000)；1～8. 牛分枝桿菌AN5的菌液濃度分別是107、106、105、104、103、102、10、1 CFU/mL。

2.4.2 人工模擬感染牛奶樣品的檢測

將10 μL稀釋后的菌液分別加入到1 mL全脂牛奶中(1×106CFU/mL)，用組織核酸提取試劑盒提取基因組后進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果如圖6所示。1號和3號引物對人工模擬奶樣中牛分枝桿菌的檢測靈敏度都可以達(dá)到10 CFU/mL，4號引物檢測奶樣的靈敏度為102CFU/mL，2號引物僅能檢出106CFU/mL。

A.1號引物；B.2號引物；C.3號引物；D.4號引物；M. DNA Marker(DL2000)；P. 陽性對照(牛分枝桿菌AN5的DNA)；N.陰性對照；1～6.牛分枝桿菌AN5的菌液濃度分別是106、105、104、103、102、10 CFU/mL。

3 討論

牛結(jié)核病是由牛分枝桿菌引起的一種慢性、消耗性人畜共患傳染病[1]，我國將其列為二類動(dòng)物疫病。牛分枝桿菌感染動(dòng)物機(jī)體后分布于各個(gè)器官病灶內(nèi)，以組織器官結(jié)節(jié)性肉芽腫和干酪樣、鈣化的壞死病灶為典型特征，可隨病畜的糞便、乳汁、尿液及呼吸道分泌物等排出。肺臟和淋巴結(jié)作為牛分枝桿菌感染的主要靶器官，病原檢出率最高，而牛乳是牛結(jié)核病風(fēng)險(xiǎn)評估中最易采集、最容易監(jiān)測的樣本[11-12]。雖然目前有針對不同牛分枝桿菌靶基因所建立的PCR檢測方法，但不同PCR檢測方法對不同組織的檢測效果存在差異性。因此，本研究以不同PCR檢測方法的特異性、敏感性以及樣品可適性為研究指標(biāo)，以期篩選出針對不同組織樣品和牛奶樣品的最適牛分枝桿菌特異性基因PCR檢測體系。

本研究針對牛分枝桿菌相對保守的4個(gè)基因片段(16S rRNA、IS6110、 IS1081、Mpb64)分別設(shè)計(jì)引物，建立PCR檢測方法，并系統(tǒng)評價(jià)不同引物對牛分枝桿菌檢測的敏感性和特異性。特異性是準(zhǔn)確檢測目的病原的必要條件，通過比較發(fā)現(xiàn)，3號引物在檢測時(shí)，雜帶較多，易干擾檢測結(jié)果；1號引物均能檢測出牛分枝桿菌、禽分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌，僅可用于分枝桿菌群的檢測；2號和4號引物均能夠特異性檢測牛分枝桿菌，可用于臨床診斷牛結(jié)核病。此外，感染后不同階段動(dòng)物機(jī)體所攜帶的牛分枝桿菌不同，臨床采集的不同樣品之間存在一定差異，提取的核酸含量或高或低。因此，敏感性成為評價(jià)PCR檢測方法的另一重要參數(shù)。在評價(jià)過程中，雖然1號引物檢測牛的肺組織和淋巴結(jié)中牛分枝桿菌的檢測靈敏度可達(dá)1 CFU/mL，但其不能用于牛結(jié)核病的特異性診斷；2號引物對牛分枝桿菌基因組的檢測靈敏度可達(dá)10-10ng/μL，對牛的肺組織和淋巴結(jié)中牛分枝桿菌的檢測靈敏度可達(dá)106和105CFU/mL，對牛奶中的牛分枝桿菌檢測靈敏度可達(dá)106CFU/mL；4號引物雖然對牛的肺組織和淋巴結(jié)中牛分枝桿菌的檢測靈敏度可達(dá)105和106CFU/mL，對奶中的牛分枝桿菌檢測靈敏度可達(dá)102CFU/mL，但是其對牛分枝桿菌基因組的檢測靈敏度較低，僅為10-3ng/μL。因此，在牛結(jié)核病的病原學(xué)檢測中，2號引物較適合于肉用牛肺組織和淋巴結(jié)的牛分枝桿菌和禽分枝桿菌的PCR檢測，4號引物較適合于奶樣中病原菌的PCR檢測。

總之，本研究系統(tǒng)地優(yōu)化了4種常見牛分枝桿菌特異性基因PCR檢測體系，并比較分析了其特異性、敏感性、樣品可適性等參數(shù)，對開展牧場結(jié)核病的檢測和凈化具有一定的參考價(jià)值。