表達(dá)PRRSV N蛋白穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建與鑒定

付寧寧，肖長(zhǎng)廣，陳夢(mèng)莉，2，邱亞峰，李宗杰，李蓓蓓，劉珂，邵東華，馬志永，魏建超*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，最早出現(xiàn)在20世紀(jì)80年代末，幾乎同時(shí)出現(xiàn)在北美和歐洲并迅速傳播到世界上大多數(shù)豬生產(chǎn)國(guó)[1-2]，被認(rèn)為是世界上最具經(jīng)濟(jì)意義的豬病原體之一。PRRSV能感染所有年齡階段的豬，但妊娠母豬和仔豬的臨床癥狀更為嚴(yán)重。懷孕母豬在妊娠晚期感染PRRSV可能導(dǎo)致死胎、胎兒部分自溶和產(chǎn)木乃伊胎兒，而感染PRRSV的仔豬可能出現(xiàn)臨床癥狀，包括發(fā)燒、嚴(yán)重呼吸困難、厭食、嗜睡、眼瞼水腫、耳根變藍(lán)或變紅[3-5]。1996年，我國(guó)郭寶清首次從流產(chǎn)死胎中分離到該病的病原[6]。自2006年暴發(fā)以豬高熱、食欲減退為主要癥狀的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征 (HP-PRRS)之后，到目前為止，該病一直在我國(guó)肆虐流行，區(qū)域性暴發(fā)時(shí)有發(fā)生[7-9]。PRRSV是有囊膜的不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，根據(jù)病原學(xué)分類，其屬于動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬[10]，病毒基因組全長(zhǎng)約15.5 kb，包含至少10個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORFs)，ORF1a與ORF1b編碼PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2至ORF7編碼結(jié)構(gòu)蛋白，其中N蛋白是由ORF7編碼的結(jié)構(gòu)蛋白[11-12]。

N蛋白與病毒基因組相互作用形成PRRSV的核衣殼蛋白[13]，N蛋白的編碼基因缺失會(huì)導(dǎo)致病毒的傳染性完全消失。然而，有研究表明，通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)N蛋白的互補(bǔ)細(xì)胞系可以拯救出單輪感染性PRRSV復(fù)制子顆粒[14]。N蛋白由PRRSV ORF7編碼，分子量約為14～15 kDa。該蛋白在病毒粒子中含量最高[15]，約占病毒粒子蛋白質(zhì)含量40%，其主要功能是包裝病毒基因組RNA[16]。N蛋白還包含一個(gè)核定位信號(hào)，引導(dǎo)N蛋白易位到感染細(xì)胞的核仁，研究表明N蛋白核定位信號(hào)(NLS)與PRRSV致病性有關(guān)[17-18]。 N蛋白在自然宿主中具有高度的免疫原性[19]，在PRRSV感染機(jī)體1周后，就能檢測(cè)到針對(duì)N蛋白的抗體，并且抗體的水平很高，能在體內(nèi)持續(xù)存在半年以上，所以其通常被用于作為病原檢測(cè)時(shí)的靶蛋白。然而，其抗體不是中和抗體，不具有保護(hù)性[20-22]。由于該蛋白在整個(gè)PRRSV中高度保守，因此N蛋白作為病毒檢測(cè)以及疾病的診斷具有很好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞和毒株

猴腎細(xì)胞(Marc-145)、人胚腎細(xì)胞(293T)、慢病毒載體pSin-Ires-Puro、pRSV-Rev質(zhì)粒、pSPAX2質(zhì)粒、pMD2.G質(zhì)粒及PRRSV SH1毒株均由上海獸醫(yī)研究所豬傳染病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警與阻斷和防控團(tuán)隊(duì)保存，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自TIANGEN公司。

1.2 主要試劑

T4 DNA Ligase 購(gòu)自 NEB 公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ和蛋白Marker購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；TIANamp Genomic DNA Kit 購(gòu)自天根生化科技有限責(zé)任公司；TurboFect Transfections Reagent購(gòu)自Invitrogen公司；高糖DMEM購(gòu)自上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清FBS購(gòu)自Biosera公司；PRRSV N蛋白多克隆抗體與單克隆抗體均由上海獸醫(yī)研究所豬傳染病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警與阻斷和防控團(tuán)隊(duì)保存；HRP標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse購(gòu)自Invitrogen公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)慢病毒載體pSin-Ires-Puro和PRRSV SH1株的基因序列用SnapGene軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性物，由上海睿勉生物科技有限公司合成，其序列如下(斜體加下劃線為限制性內(nèi)切酶位點(diǎn))：

EcoRⅠ F：gGAATTCgccaccatgccaaataacaacg，

BamHⅠ R：cgGGATCCtcatgctgagggtg。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以PRRSV SH1株感染性克隆質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增N蛋白基因序列，將PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后純化回收，將回收后的目的片段與慢病毒載體pSin-Ires-Puro分別用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，純化回收后使用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板、搖菌后抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定后的陽(yáng)性質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，并將測(cè)序正確的重組慢病毒質(zhì)粒命名為pSin-Ires-Puro-N。

1.5 慢病毒包裝

使用TurboFect Transfections Reagen轉(zhuǎn)染試劑，將重組慢病毒質(zhì)粒pSin-Ires-Puro-N及包裝輔助質(zhì)粒psPAS2、pMD2.G、pRSV-Rev共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，分別于24 h、48 h、72 h收集病毒上清液，4 000 r/min離心10 min去除細(xì)胞沉淀，暫時(shí)置于4 ℃保存。

1.6 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞篩選

分階段將1.5中24 h、48 h、72 h收集的慢病毒液感染Marc-145細(xì)胞(6孔板)，同時(shí)設(shè)置未感染細(xì)胞作為陰性對(duì)照，待細(xì)胞單層長(zhǎng)滿后，將細(xì)胞以1∶2傳至2個(gè)6孔板中，并加入嘌呤霉素篩選。每隔2 d更換1次新鮮的含有嘌呤霉素的10% DMEM篩選液，直至陰性對(duì)照細(xì)胞全部死亡后停止篩選。對(duì)初篩后的Marc-145細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光(IFA)和蛋白免疫印跡(Western blot)鑒定。將初步鑒定后的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，分別用有限稀釋法和終點(diǎn)稀釋法將細(xì)胞以1個(gè)/100 μL的密度轉(zhuǎn)移至96孔板中進(jìn)行單克隆篩選。1周后，細(xì)胞會(huì)明顯聚縮成團(tuán)生長(zhǎng)，挑選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單一細(xì)胞克隆繼續(xù)孵育培養(yǎng)，每隔3 d更換一次新鮮的15% DMEM，將單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并傳至10代后，對(duì)所篩選的細(xì)胞系進(jìn)行鑒定。

1.7 嘌呤霉素初篩后Western blot鑒定

將嘌呤霉素初步篩選后的細(xì)胞進(jìn)行Western blot鑒定，設(shè)置空載轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照。收集細(xì)胞，提取蛋白后經(jīng)5×SDS-PAGE loading buffer處理，12%聚丙烯凝膠進(jìn)行SDS-PAGE，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜，5%脫脂乳室溫?fù)u床封閉3 h。以PRRSV N蛋白多克隆抗體作為一抗，4 ℃搖床孵育過(guò)夜，TBST洗滌15 min，共洗3次。以HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG多抗作為二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗滌15 min，共洗3次。用凝膠成像系統(tǒng)曝光并分析結(jié)果。

1.8 嘌呤霉素初篩后IFA鑒定

將嘌呤霉素初步篩選后的細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板過(guò)夜培養(yǎng)，設(shè)置正常細(xì)胞作為對(duì)照。用預(yù)冷4%多聚甲醛4 ℃固定30 min；用1×NP40室溫孵育15 min，使細(xì)胞膜通透。加入封閉液室溫封閉30 min。以PRRSV N蛋白單克隆抗體作為一抗室溫孵育1 h，以羊抗鼠Alexa Fluor488作為二抗室溫避光孵育1 h，DAPI室溫避光孵育15 min。置于熒光顯微鏡下觀察蛋白表達(dá)情況。

1.9 細(xì)胞系的PCR鑒定

為鑒定N蛋白基因是否整合到Marc-145細(xì)胞基因組中，用TIA Namp Genomic DNA Kit提取篩選得到的細(xì)胞系DNA，PCR擴(kuò)增N蛋白基因序列，1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)觀察分析結(jié)果。

1.10 細(xì)胞系的IFA鑒定

按照1.8 的操作步驟，將篩選出的不同的單克隆細(xì)胞系進(jìn)行IFA，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.11 細(xì)胞系的Western blot鑒定

按照1.7的操作步驟，將篩選出的不同的單克隆細(xì)胞系進(jìn)行Western blot試驗(yàn)，分析試驗(yàn)結(jié)果。

1.12 N蛋白表達(dá)灰度值分析

使用ImageJ軟件對(duì)Western blot的結(jié)果條帶進(jìn)行灰度值分析，通過(guò)將目的蛋白的灰度值除于內(nèi)參的灰度值，以校正誤差，得到所篩選出的不同單克隆細(xì)胞中N蛋白表達(dá)的相對(duì)含量，從而篩選出N蛋白表達(dá)量相對(duì)較高的單克隆細(xì)胞系。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒質(zhì)粒pSin-Ires-Puro-N的構(gòu)建與鑒定

以PRRSV SH1株感染性克隆質(zhì)粒模板，PCR擴(kuò)增PRRSV N蛋白基因序列，長(zhǎng)度為372 bp，純化回收后，用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切并克隆到pSin-Ires-Puro慢病毒載體上，PCR鑒定后(圖1)送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，將測(cè)序正確的重組慢病毒質(zhì)粒命名為pSin-Ires-Puro-N。

A. N基因PCR擴(kuò)增(M. DL2000；1. N基因擴(kuò)增產(chǎn)物)；

2.2 慢病毒包裝與轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的初步篩選與鑒定

將重組慢病毒質(zhì)粒pSin-Ires-Puro-N與psPAS2、pMD2.G、pRSV-Rev 3個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染393T細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h的慢病毒上清液。將收集的慢病毒上清液感染Marc-145細(xì)胞，加入嘌呤霉素篩選細(xì)胞，Western blot檢測(cè)到初步篩選的細(xì)胞在14.5 kDa處有目的條帶(圖2)，與N蛋白預(yù)期條帶大小相符。IFA鑒定結(jié)果顯示(圖3)，初篩后的Marc-145細(xì)胞中有特異性綠色熒光信號(hào)，證明已經(jīng)初步篩選出表達(dá)N蛋白的Marc-145細(xì)胞。

M.26616蛋白Marker；1. 表達(dá)N蛋白的Marc-145細(xì)胞；2. 陽(yáng)性對(duì)照；3. 轉(zhuǎn)染慢病毒空載。

圖3 IFA鑒定初篩后Marc-145細(xì)胞中N蛋白表達(dá)

M.DL2000；1～5. 篩選出的5個(gè)表達(dá)N蛋白(N1、N2、N3、N4、N5)的Marc145細(xì)胞系。

2.3 細(xì)胞系的篩選及鑒定

將嘌呤霉素初步篩選后的細(xì)胞分別用有限稀釋法和終點(diǎn)稀釋法進(jìn)行單克隆篩選，成功篩選得到5個(gè)表達(dá)N蛋白的Marc-145細(xì)胞系。將細(xì)胞傳至10代后，提取N1～N5細(xì)胞系的基因組DNA，分別用PCR 擴(kuò)增N蛋白基因片段，凝膠電泳結(jié)果顯示在372 bp左右有特異性條帶(圖4)，證明N蛋白基因已成功整合到Marc-145細(xì)胞基因組中。IFA結(jié)果顯示，篩選的單細(xì)胞克隆中有特異性綠色熒光信號(hào)(圖5)。提取N1～N5細(xì)胞系總蛋白，Western blot結(jié)果顯示，篩選的細(xì)胞系均在14.5 kDa處有目的條帶(圖6)，且根據(jù)灰度值分析結(jié)果顯示，N1-Marc-145和N5-Marc-145細(xì)胞系中N蛋白表達(dá)量相對(duì)較高(圖7)。這些結(jié)果表明成功獲得穩(wěn)定表達(dá)PRRSV N蛋白的Marc-145細(xì)胞系。

圖5 IFA鑒定細(xì)胞系N蛋白的表達(dá)

N1～N5. 篩選的5個(gè)表達(dá)N蛋白的Marc-145細(xì)胞系；6. 正常Marc-145細(xì)胞對(duì)照；7. 陽(yáng)性對(duì)照。

圖7 N蛋白表達(dá)灰度值分析

3 討論

慢病毒包裝是目前應(yīng)用最廣的用于構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白細(xì)胞系的方法，該病毒包裝系統(tǒng)的基本原理是將攜帶目的基因的慢病毒載體整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中，以實(shí)現(xiàn)目的基因在宿主細(xì)胞中長(zhǎng)久表達(dá)。慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，同時(shí)也屬于復(fù)制缺陷型病毒，具有穩(wěn)定、高效等特點(diǎn)，是細(xì)胞分子生物學(xué)上用于篩選穩(wěn)定細(xì)胞系的理想工具[23-24]。PRRSV的體外增殖主要在Marc-145細(xì)胞中進(jìn)行，通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白的Marc-145細(xì)胞系，對(duì)PRRSV的基因功能、疫苗研發(fā)等生物學(xué)研究具有重要作用。

針對(duì)PRRSV相關(guān)細(xì)胞系的研究中，Sagong等[25]分別構(gòu)建了表達(dá)歐洲型(PRRSV-Ⅰ型)和北美型(PRRSV-Ⅱ型)核衣殼(N)蛋白的BHK細(xì)胞系，該細(xì)胞系能與N蛋白特異性抗體以及針對(duì)兩種PRRSV基因型的豬高免血清反應(yīng)良好?；谶@些觀察，作者認(rèn)為表達(dá)N蛋白的細(xì)胞系可以作為一種有價(jià)值的研究工具，用于檢測(cè)豬的PRRSV抗體。此外，基于細(xì)胞系IFA和過(guò)氧化物酶單層(IPMA)試驗(yàn)的敏感性和特異性，作者表示該細(xì)胞系也可以作為ELISA診斷抗原的潛在來(lái)源。Lee等[26]構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)CD163的豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)系，該細(xì)胞系能夠高水平表達(dá)CD163，不僅不會(huì)影響Ⅰ型和Ⅱ型 PRRSV毒株的復(fù)制，而且可以促進(jìn)PRRSV增殖，該細(xì)胞系的獲取有利于促進(jìn)病毒致病機(jī)理的研究。Wu等[27]構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)豬pCD163受體蛋白的Marc-145細(xì)胞系，證實(shí)PRRSV的增殖速度及病毒滴度在表達(dá)pCD163的Marc-145細(xì)胞中均有所提高，該細(xì)胞系的構(gòu)建為促進(jìn)病毒繁殖和疫苗生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。Welch等[28]分別缺失PRRSV基因組中的ORF2和ORF4基因，并構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)PRRSV GP2蛋白與GP4蛋白的Marc-145細(xì)胞系，將兩種缺失突變體分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)的互補(bǔ)細(xì)胞系后，均能成功拯救出病毒，拯救的缺陷病毒雖然在正常Marc-145細(xì)胞和PAM細(xì)胞中只能進(jìn)行單輪感染，證明其有良好的生物安全性。因此，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白的互補(bǔ)細(xì)胞系可以作為PRRSV新型疫苗研發(fā)的一個(gè)有用工具。

綜上，本研究通過(guò)慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)PRRSV N蛋白的Marc-145細(xì)胞系，并驗(yàn)證了該細(xì)胞系與PRRSV N蛋白特異性抗體有良好的反應(yīng)性。穩(wěn)定表達(dá)PRRSV N蛋白的細(xì)胞系是一種有價(jià)值的研究工具，可以作為PRRSV血清學(xué)診斷試劑的潛在研究工具，也能為研制PRRS新型復(fù)制缺陷型疫苗奠定基礎(chǔ)。