布力布·吉力斯?jié)h,賽福丁·柯尤木,劉春暉,王培紅

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院消化內(nèi)科,新疆 烏魯木齊 836000)

胃癌的發(fā)生與既往胃部手術(shù)史、幽門(mén)螺桿菌感染、飲酒、基因異常表達(dá)、遺傳變異、攝入過(guò)多腌制食品等因素存在聯(lián)系,為發(fā)病、致死率較高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,早期臨床多表現(xiàn)為消化不良、上腹痛等,隨病情的發(fā)展可誘發(fā)惡病質(zhì)、嘔血、上腹部明顯疼痛等,進(jìn)而導(dǎo)致患者多臟器功能衰竭,最終死亡[1-2]。近年來(lái),胃癌預(yù)后因治療技術(shù)進(jìn)步而有所提升,但5年生存率仍舊較低。隨著研究深入,發(fā)現(xiàn)胃癌發(fā)生、發(fā)展中抑癌及原癌基因具有關(guān)鍵作用,因此從分子層面闡明胃癌進(jìn)展機(jī)制對(duì)患者診斷、治療、5年生存率的提高具有重要意義[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在胃癌細(xì)胞凋亡、侵襲、致瘤性、凋亡等過(guò)程中均發(fā)揮著調(diào)控作用,而lncRNA核富集轉(zhuǎn)錄子 1(Nuclear enriched abundant transcript 1,NEAT1)被報(bào)道在胃癌中呈高表達(dá),且與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、預(yù)后等密切相關(guān)[4]。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPK)通路包括p38、c-Jun氨基末端激酶(C-jun amino terminal kinase,JNK)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK),可參與細(xì)胞凋亡、增殖、分化等過(guò)程[5]?；诖?本研究分析lncRNA NEAT1通過(guò)調(diào)控MAPK通路對(duì)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲及自噬的影響,以期為胃癌靶向治療提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人胃癌SGC7901細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基(批號(hào):20170153)購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司;lncRNA NEAT1沉默載體和上調(diào)載體(批號(hào):20200369)購(gòu)自深圳市豪地華拓生物科技有限公司;PCR試劑盒(批號(hào):20100789)購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司;四唑鹽(MTT)試劑盒(批號(hào):20211137)購(gòu)自深圳子科生物科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒(批號(hào):20160739)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司;GAPDH(批號(hào):ab8241)、上皮性鈣黏附素(E-cadherin,批號(hào):ab4679)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9,批號(hào):ab6648)、MMP-2(批號(hào):ab3769)、Beclin-1(批號(hào):ab4078)、Ⅱ型/Ⅰ型微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ,批號(hào):ab7642)、p38(批號(hào):ab7089)、JNK(批號(hào):ab4012)、ERK抗體(批號(hào):ab8579)均購(gòu)自(Abcam公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:采用RPMI-1640培養(yǎng)液(含10% FBS)培養(yǎng)SGC7901細(xì)胞,在6孔板上接種對(duì)數(shù)期SGC7901細(xì)胞,2.5×105個(gè)/孔,培養(yǎng)液每3天更換1次,待濃度達(dá)到80%時(shí),采用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染,分為沉默組(轉(zhuǎn)染lncRNA NEAT1沉默質(zhì)粒)、過(guò)表達(dá)組(轉(zhuǎn)染lncRNA NEAT1上調(diào)質(zhì)粒),轉(zhuǎn)染后12 h內(nèi)更換培養(yǎng)液,再培養(yǎng)24 h后對(duì)SGC7901細(xì)胞進(jìn)行收集備用。

1.3.2 轉(zhuǎn)染效率測(cè)定:細(xì)胞lncRNA NEAT1表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測(cè)。采用TRIzol試劑盒對(duì)待檢細(xì)胞RNA進(jìn)行提取和純化,后行反轉(zhuǎn)錄處理獲取總cDNA,采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列,啟動(dòng)PCR儀,采用2-ΔΔCt方法計(jì)算lncRNA NEAT1表達(dá)量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 細(xì)胞遷移、侵襲力檢測(cè):細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,取轉(zhuǎn)染、未轉(zhuǎn)染后的SGC7901細(xì)胞接種至6孔板上(2.5×105個(gè)/孔)。培養(yǎng)4 h后將培養(yǎng)液棄去,后對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行收集,將細(xì)胞密度調(diào)整至5.0×104個(gè)/ml。24孔板中放置Transwell小室,上室放置基質(zhì)膠,自然晾干后加入細(xì)胞懸液(100 μl),下室加培養(yǎng)基500 μl,培養(yǎng)24 h后取出,用4%多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色,顯微鏡下觀察,拍照計(jì)數(shù)。遷移能力檢測(cè)時(shí)采用未鋪有基質(zhì)膠的Transwell小室,其余操作同侵襲檢測(cè)。

1.3.4 相關(guān)蛋白表達(dá)量檢測(cè):通過(guò)Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。SDS-PDGE電泳于每孔加入80 μg蛋白后進(jìn)行,電泳結(jié)束后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂奶粉對(duì)PVDF膜進(jìn)行封閉,E-cadherin、MMP-9、MMP-2、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p38、JNK、ERK一抗(1∶1000)于搖床上室溫孵育,共孵育120 min,完成后采用TBST洗膜3次,5 min/次,后將E-cadherin、MMP-9、MMP-2、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p38、JNK、ERK二抗(1∶1000)于搖床上室溫孵育,共孵育60 min,完成后采用TBST洗膜3次,10 min/次。化學(xué)發(fā)光顯影采用ECL,以GAPDH為內(nèi)參,相對(duì)條帶灰度光密度值采用Image J軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1 三組細(xì)胞lncRNA NEAT1表達(dá)量比較 對(duì)照組、過(guò)表達(dá)組、沉默組lncRNA NEAT1表達(dá)量依次為1.17±0.15、1.82±0.17、0.81±0.10。與對(duì)照組比較,過(guò)表達(dá)組lncRNA NEAT1表達(dá)量增加,沉默組lncRNA NEAT1表達(dá)量下降(均P<0.05)。與過(guò)表達(dá)組比較,沉默組lncRNA NEAT1表達(dá)量下降(P<0.05)。

2.2 三組細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)比較 見(jiàn)表1(圖1、2)。與對(duì)照組比較,過(guò)表達(dá)組細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)增加,沉默組細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)下降(均P<0.05)。與過(guò)表達(dá)組比較,沉默組細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)下降(均P<0.05)。

表1 三組細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)比較(個(gè))

2.3 三組細(xì)胞遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)量比較 見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較,過(guò)表達(dá)組E-cadherin蛋白表達(dá)量降低,MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)量升高;沉默組E-cadherin蛋白表達(dá)量升高,MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)量降低(均P<0.05)。與過(guò)表達(dá)組比較,沉默組E-cadherin蛋白表達(dá)量升高,MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)量降低(均P<0.05)。

表2 三組細(xì)胞遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)量比較

2.4 三組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量比較 見(jiàn)表3。與對(duì)照組比較,過(guò)表達(dá)組Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)量降低,沉默組Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)量升高(均P<0.05)。與過(guò)表達(dá)組比較,沉默組Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)量升高(均P<0.05)。

表3 三組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量比較

2.5 三組細(xì)胞MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)量比較 見(jiàn)表4。與對(duì)照組比較,過(guò)表達(dá)組p38、JNK蛋白表達(dá)量降低,ERK蛋白表達(dá)量升高;沉默組p38、JNK蛋白表達(dá)量升高,ERK蛋白表達(dá)量降低(均P<0.05)。與過(guò)表達(dá)組比較,沉默組p38、JNK蛋白表達(dá)量升高,ERK蛋白表達(dá)量降低(均P<0.05)。

表4 三組細(xì)胞MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)量比較

3 討 論

胃癌是由多基因、多因素共同誘發(fā)的臨床常見(jiàn)惡性腫瘤,近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì),對(duì)患者生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重影響[6-7]。胃壁表層黏膜上皮細(xì)胞為胃癌起源,可進(jìn)展到胃的各部位,具有較高的轉(zhuǎn)移及侵襲特性,多數(shù)胃癌患者早期癥狀并不明顯,確診時(shí)多為局部晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期,錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)機(jī),遠(yuǎn)期生存率較低,故對(duì)胃癌的發(fā)生遷移和侵襲的機(jī)制進(jìn)行探討對(duì)于患者個(gè)體化治療、生存期延長(zhǎng)、預(yù)后改善具有重要意義[8-10]。

lncRNA為近年來(lái)胃癌的研究熱點(diǎn)。lncRNA是可在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)基因表達(dá)進(jìn)行改變的轉(zhuǎn)錄物,其表達(dá)失調(diào)可改變胃癌細(xì)胞相關(guān)表型,進(jìn)而參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展[11-12]。lncRNA NEAT1在乳腺癌、甲狀腺癌、胃癌、口腔鱗癌等多種腫瘤細(xì)胞系及組織中均呈高表達(dá),在胃癌中l(wèi)ncRNA NEAT1與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、預(yù)后生存等密切相關(guān),可通過(guò)激活絲切蛋白2(CFL2)而促進(jìn)癌細(xì)胞增殖,最終發(fā)揮促癌作用[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn),胃癌細(xì)胞經(jīng)沉默lncRNA NEAT1干預(yù)后遷移、侵襲數(shù)量減少,自噬增強(qiáng),表明lncRNA NEAT1可對(duì)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲、自噬進(jìn)行調(diào)控。

胃癌的發(fā)生和發(fā)展與細(xì)胞遷移、侵襲等存在聯(lián)系。E-cadherin是具有維持組織上皮完整性、細(xì)胞間黏附連結(jié)的黏附分子家族成員之一,在多種腫瘤中缺失或表達(dá)下調(diào),進(jìn)而破壞了腫瘤細(xì)胞間黏附功能,使得原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞脫離并轉(zhuǎn)移,最終對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展起到了促進(jìn)作用[15-16]。腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)重塑在腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用,而基質(zhì)金屬酶可參與腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)重塑,其中MMP-9、MMP-2為Ⅳ型膠原的特異性水平解酶,MMP-9、MMP-2過(guò)表達(dá)可造成病變組織周圍Ⅳ型膠原分解,進(jìn)而促進(jìn)胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移,且Ⅳ型膠原分解產(chǎn)生的脯氨酸可為胃癌能量代謝提供營(yíng)養(yǎng),有利于細(xì)胞存活[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)沉默lncRNA NEAT1干預(yù)后胃癌細(xì)胞E-cadherin表達(dá)量上升,MMP-9、MMP-2表達(dá)量下降,提示lncRNA NEAT1可通過(guò)調(diào)控E-cadherin、MMP-9、MMP-2表達(dá)而減弱腫瘤細(xì)胞侵襲。

自噬是可參與代謝調(diào)節(jié)、生物體發(fā)育、細(xì)胞衰老及凋亡的程序性細(xì)胞死亡方式,放射線、化療藥物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、放射線等均可激活細(xì)胞自噬,在饑餓或應(yīng)激狀態(tài)下自噬可通過(guò)分解胞質(zhì)內(nèi)生物大分子而提供自身生存所需營(yíng)養(yǎng),此外自噬可對(duì)衰老細(xì)胞器及受損結(jié)構(gòu)、細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)半衰期蛋白進(jìn)行清除,自噬水平變化可改變細(xì)胞功能,進(jìn)而對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展造成影響,而B(niǎo)eclin-1、LC3為自噬標(biāo)志物,可以對(duì)自噬水平的高低進(jìn)行反映[19]。Beclin-1為自噬特異性基因,可與/磷酸酰肌醇3-激酶(PI3K)結(jié)合形成復(fù)合物,進(jìn)而對(duì)胞質(zhì)中的FYVE基序進(jìn)行募集,促進(jìn)自噬體膜形成且可誘導(dǎo)自噬體膜上自噬蛋白定位。細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的Beclin-1對(duì)自噬具有誘導(dǎo)作用,但在多種惡性腫瘤中Beclin-1均呈缺失狀態(tài),導(dǎo)致其對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的抑制作用減弱。LC3可參與自噬胞膜延伸及成熟,在自噬成熟中發(fā)揮著重要作用,LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ為L(zhǎng)C3兩種存在形式,新合成的細(xì)胞內(nèi)LC3可經(jīng)加工成為L(zhǎng)C3-Ⅰ,而后者則被加工成為L(zhǎng)C3-Ⅱ,LC3-Ⅱ含量隨自噬體膜的增加而增加,故LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ可在一定程度上對(duì)細(xì)胞自噬活性進(jìn)行反映[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn),胃癌細(xì)胞經(jīng)沉默lncRNA NEAT1干預(yù)后Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ上升,提示lncRNA NEAT1可通過(guò)調(diào)控自噬標(biāo)志物表達(dá)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬。

細(xì)胞增殖、凋亡等與腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路改變存在密切聯(lián)系,MAPK通路是細(xì)胞將信號(hào)從細(xì)胞膜傳遞至核內(nèi)的細(xì)胞自噬相關(guān)信號(hào)通路,家族成員包括p38、JNK、ERK,在細(xì)胞增殖、凋亡、自噬、惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要作用[22]。p38、JNK可經(jīng)病理?yè)p傷及細(xì)胞應(yīng)激信號(hào)激活,p38激活后可增加TNF-α表達(dá)、激活c-Jun而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,且激活的p38可造成細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯;JNK激活后可上調(diào)促凋亡蛋白及半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表達(dá),而Caspase-3為凋亡效應(yīng)分子,可加速腫瘤細(xì)胞凋亡;ERK經(jīng)生長(zhǎng)因子等促有絲分裂刺激因素激活后可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,抑制凋亡[23]。本研究發(fā)現(xiàn),胃癌細(xì)胞經(jīng)沉默lncRNA NEAT1干預(yù)后p38、JNK表達(dá)量增加,ERK表達(dá)量降低,提示lncRNA NEAT1可抑制胃癌細(xì)胞遷移、侵襲,增強(qiáng)自噬,其機(jī)制可能與調(diào)控MAPK通路有關(guān)。

綜上所述,抑制lncRNA NEAT1可有效抑制胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲、自噬,其機(jī)制可能與調(diào)控MAPK信號(hào)通路有關(guān),為臨床上靶向治療胃癌提供新的研究方向。