蔡程山，白飛榮，許 玲，董喬娟，王鵬輝，姜明慧，張?zhí)熨n，石魯博，孫澤青，姚 粟*

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；2.山東扳倒井股份有限公司，山東 淄博 256300）

中國白酒釀造已有悠久的歷史，其品種繁多、香型各異、工藝更是各有不同[1]。發(fā)酵過程中，窖池中各種微生物生化代謝及其相互作用、互相影響、協(xié)調(diào)發(fā)展共同構(gòu)成了窖池特定的微生態(tài)系統(tǒng)，微生物多樣性一定程度上決定了白酒品質(zhì)[2]。針對特定釀酒企業(yè)解析窖池微生物多樣性，分離發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌株具有重要意義。長期以來，人們利用傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)對窖池中的微生物組分進(jìn)行分析，揭示了不同窖池中的優(yōu)勢菌群的種屬與分布特點，如劉雯雯[3]應(yīng)用傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術(shù)分離到328株霉菌，其中優(yōu)勢真菌屬為交鏈孢屬（Alternaria）、地絲菌屬（Geotrichum）、孢霉屬（Cladosprium）、曲霉屬（Aspergillus）、散囊菌屬（Eurotium）和紅曲霉屬（Monascus）等；CHEN B等[4]研究發(fā)現(xiàn)，醬香型白酒發(fā)酵窖池優(yōu)勢真菌為宛氏擬青霉（Paecilomyces variotii）、米曲霉（Aspergillus oryzae）和土曲霉（Aspergillus terreus）?？膳囵B(yǎng)技術(shù)雖然促進(jìn)酒企生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展，但不能對非培養(yǎng)微生物進(jìn)行分析，無法全面解析窖池微生物群落結(jié)構(gòu)及生長規(guī)律。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，高通量測序技術(shù)以其靈敏度高、重復(fù)性好、可分析不可培養(yǎng)微生物等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用到微生物群落多樣性的分析[5]。如胡小霞等[6-7]采用高通量技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，窖池微生物優(yōu)勢細(xì)菌屬包括乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、埃希氏菌屬（Escherichia-Shigella）和芽孢桿菌屬（Bacillus）；優(yōu)勢真菌屬為交鏈孢屬（Alternaria）、曲霉屬（Aspergillus）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）等。同時白酒風(fēng)味獨(dú)特，種類繁多，采用常規(guī)化學(xué)方法測定如白酒中總酸、總酯、總?cè)?、甲醇和雜醇油等成分已經(jīng)滿足不了白酒工作者的工作需求。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）技術(shù)可對白酒微量成分準(zhǔn)確剖析，但僅依據(jù)化學(xué)含量難以評估風(fēng)味物質(zhì)的特征貢獻(xiàn)，還需結(jié)合感官閾值指標(biāo)，評價白酒風(fēng)味物質(zhì)貢獻(xiàn)和白酒品質(zhì)[8]。

本研究以山東扳倒井股份有限公司國井白酒窖池發(fā)酵中酒醅為研究對象，通過可培養(yǎng)技術(shù)，將優(yōu)勢功能微生物進(jìn)行分離、篩選、鑒定及應(yīng)用；應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，深入了解國香型白酒酒醅的微生物群落結(jié)構(gòu)及演變過程，明確酒醅發(fā)酵過程中的優(yōu)勢真菌和細(xì)菌種類；結(jié)合GC-MS技術(shù)，分析原酒中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對樣品總體香氣的貢獻(xiàn)；通過對發(fā)酵過程酒醅中水分、酸度、還原糖、淀粉含量以及原酒酒精度、總酸、總酯等理化性質(zhì)測定，進(jìn)一步認(rèn)識微生物群落代謝對酒質(zhì)的影響，為提升國井白酒的品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

本研究酒醅樣品取自山東扳倒井股份有限公司，收集窖池不同時間點7個酒醅樣品（入窖堆積、發(fā)酵0 d、6 d、12 d、18 d、24 d、30 d），采樣時間為2021年11月15日～2021年12月14日，每次采集樣品覆蓋不同位置（窖池對角線兩個點，同一位點上層和下層糟醅）通過四分法采集兩份等同樣品（每份500 g）分別用于可培養(yǎng)法和非培養(yǎng)法的測定。

1.1.2 化學(xué)試劑

氯化鈉、葡萄糖、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、乙二胺四乙酸、十六烷基三甲基溴化銨、氯仿、異戊醇、異丙醇、醋酸鈉、鹽酸、無水乙醇、4-甲基-2-戊醇（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸（分析純）、Tris-飽和酚：上海源葉生物科技有限公司；0.85%生理鹽水：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；瓊脂糖（分析純）：北京全式金生物技術(shù)有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物：生工生物工程（北京）股份有限公司；DL2000脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker、核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）、蛋白酶K：寶生物工程（大連）有限公司；DNA純化試劑盒、真菌DNA提取試劑盒：美國Omega Bio-Tek公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯浸粉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂20.0 g/L。121 ℃高壓滅菌20 min。

大豆酪蛋白瓊脂（trypticase soy agar，TSA）培養(yǎng)基：胰蛋白胨15.0 g/L，大豆胨5.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，瓊脂15.0 g/L，pH值7.3±0.2。121 ℃高壓滅菌15 min。

強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基（reinforcedClostridiummedium，RCM）：蛋白胨10.0 g/L，牛肉粉10.0 g/L，酵母粉3.0 g/L，葡萄糖5.0 g/L，可溶性淀粉1.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，醋酸鈉3.0 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L，瓊脂0.5 g/L，pH值6.8±0.1。121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

AC2-6S1生物安全柜、GHP-9160隔水式培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；5424 R高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf 公司；TRIO48聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀：德國Biometra公司；BioDrop-μLite微量核酸蛋白分析儀：英國Biochrom有限公司；DT-401A電子天平：常熟市佳衡天平儀器有限公司；HG-50高壓滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司；Votex 2000旋渦振蕩儀：美國Coleparmer公司；Microflex LRF基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）儀：意大利BRUKER公司；EC250-90電泳儀、Gel DoCqM EZ凝膠成像儀：美國BIO-RAD公司。

1.3 方法

1.3.1 可培養(yǎng)微生物分離

取樣品25 g至225 mL生理鹽水中，稀釋至10-1～10-4濃度，不同濃度稀釋液吸取100 μL分別涂布到PDA、TSA和RCM平板上，PDA平板置于培養(yǎng)箱中28 ℃好氧培養(yǎng)5 d，TSA平板置于培養(yǎng)箱中37 ℃好氧培養(yǎng)3 d，RCM平板置于培養(yǎng)箱中37 ℃厭氧培養(yǎng)3 d。

1.3.2 酒醅樣品中可培養(yǎng)微生物的菌種鑒定

真菌鑒定：利用真菌基因組提取試劑盒提取分離菌株的脫氧核糖核酸（DNA），再利用核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）、核糖體rDNA大亞基（26SD1/D2）[9-10]等分子標(biāo)記引物對絲狀真菌和酵母菌的核酸序列進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：2×PCR MasterMix21μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，DNA 30 ng，雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)足至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃10 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃40 s，共35個循環(huán)；72 ℃7 min。擴(kuò)增后獲得約600 bp的DNA片段，并進(jìn)行測序。根據(jù)測序結(jié)果，用菌株的26S rDNA和ITS rDNA基因作為靶序列，在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）程序搜索同源序列，挑選與靶序列最相近的參考菌株系列，以99%序列相似性為判定標(biāo)準(zhǔn)完成菌種鑒定。

細(xì)菌鑒定：利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取分離菌株的DNA，再利用16S rRNA基因通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：2×PCRMasterMix25μL，10μmol/L上、下游引物各1 μL，DNA 2 μL，雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)足至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃5 min；94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃10 min。擴(kuò)增后獲得約1 500 bp的DNA片段，并進(jìn)行測序。根據(jù)測序結(jié)果，在EzBio Cloud數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，獲得目標(biāo)菌株及其近緣種的序列相似性，以98.65%序列相似性為判定標(biāo)準(zhǔn)完成菌種鑒定。

1.3.3 樣品宏基因組提取與高通量測序分析

利用溴化十六烷基三甲銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取樣品的宏基因組DNA。以質(zhì)檢合格的宏基因組DNA為模板，使用16S rRNA基因V4區(qū)通用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：5×FastPfu緩沖液8 μL，2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphates，dNTPs）4 μL，10 μmol/L上、下游引物各2 μL，F(xiàn)astPfu酶1 μL，DNA 30 ng，雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)足至40 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃5 min；95 ℃30 s，55 ℃45 s，72 ℃45 s，共27個循環(huán)；72 ℃10 min[11]。使用Agencourt AMPure XP磁珠對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并溶于洗脫緩沖液中，完成文庫的構(gòu)建。使用Agilent 2100 Bioanalyzer對構(gòu)建文庫的片段范圍及濃度進(jìn)行檢測，檢測合格的文庫利用HiSeq2500平臺進(jìn)行擴(kuò)增子測序。

將高通量測序數(shù)據(jù)與已知數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，對獲得的操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）進(jìn)行物種分類，使用軟件R（v3.4.1），在種水平繪制樣品的物種豐度圖，直觀的展示樣品中物種的組成及豐度，反映樣品間微生物物種的變化情況。

1.3.4 酒醅樣品及原酒理化指標(biāo)測定

水分的測定[12]：采用電熱烘箱干燥法；酸度的測定[12]：采用中和滴定法；淀粉含量的測定：采用滴定法；還原糖的測定[12]：采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）-分光光度計法[12]；原酒總酸、總酯的測定：采用中和滴定（指示劑）法；原酒酒精度的測定：參考國標(biāo)GB 5009.225—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測定》；原酒綜合品評：參考國標(biāo)GB/T10345—2007《白酒分析方法》。

1.3.5 原酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測及氣味活度值分析

原酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的檢測采用GC-MS法。

樣品預(yù)處理：取待分析的酒樣0.5 mL，置于10 mL 固相微萃取儀采樣瓶中，加入5 mL去離子水、1.5 g氯化鈉及20 μL 2.005 g/L的4-甲基-2-戊醇，35 ℃頂空萃取40 min，熱解吸3 min進(jìn)樣。

氣相色譜條件：CP-WAX57CB毛細(xì)管柱（50m×0.25mm×0.2 μm），柱溫采用程序升溫，初溫35 ℃，保持3 min后以3 ℃/min 升至80 ℃，再以9 ℃/min升至200 ℃，保持20 min。載氣為高純氦氣（He）（純度99.999%），流速1.0 mL/min，進(jìn)口溫度230 ℃，不分流進(jìn)樣1 μL。質(zhì)譜條件：電子電離（elctronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質(zhì)譜掃描范圍50～500 amu。

采用氣味活度值（odor activity value，OAV）評價各化合物對樣品總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)，OAV=物質(zhì)濃度/閾值，OAV＜1，說明該物質(zhì)對總體風(fēng)味無實際作用；OAV＞1，說明該物質(zhì)可能對總體風(fēng)味有較大影響；且在一定范圍內(nèi)，OAV越大，說明該物質(zhì)對總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)越大[13-14]。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析主要包括測序數(shù)據(jù)過濾、序列標(biāo)簽（Tag）拼接、OTU聚類、物種注釋和物種復(fù)雜度分析等流程。利用QIIME 2[15]的DADA2方法[16]對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，去除低質(zhì)量序列、嵌合體并得到Clean Data。使用FLASH軟件（v1.2.11），利用重疊關(guān)系將雙末端測序得到的成對Reads組裝成一條序列，得到高變區(qū)的Tags。利用USEARCH軟件（v7.0.1090）將拼接好的Trags聚類為OTU，并采用RDP classifier 貝葉斯算法對OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并在界、門、綱、目、科、屬和種水平統(tǒng)計分析各樣本的群落組成。利用QIIME2中q2-diversity方法進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)分析，Chao1、Ace、Shannon和Simpson指數(shù)共同表征樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)的豐富度和多樣性。實驗數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，樣品差異分析采用單因素方差法，差異顯著（P＜0.05）時通過Duncan氏法進(jìn)行多重比較，分析由SPSS 27.0軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵時間酒醅樣品中可培養(yǎng)微生物分離結(jié)果

不同發(fā)酵時間酒醅樣品中可培養(yǎng)微生物分離結(jié)果見表1。由表1可知，通過可培養(yǎng)技術(shù)在不同發(fā)酵時期酒醅樣品中共分離出155株，獲得14種微生物，涵蓋11個屬，其中真菌5種[謝瓦曲霉（Aspergillus chevalieri）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）、橫梗霉（Lichtheimiasp.）和Trichomonascus ciferrii]；細(xì)菌9種[解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、布氏慢生乳桿菌（Lentilactobacillus buchneri）、啄木鳥腸球菌（Enterococcus phoeniculicola）、成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短發(fā)酵乳桿菌（Levilactobacillus brevis）、希爾加德慢生乳桿菌（Lentilactobacillus hilgardii）和高原芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）]。所有樣品都分離到解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。隨著發(fā)酵時間增長，可培養(yǎng)微生物種類變化較大。入窖堆積樣品中分離到釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、Trichomonascus ciferrii、謝瓦曲霉（Aspergillus chevalieri）、橫梗霉（Lichtheimiasp.）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、啄木鳥腸球菌（Enterococcus phoeniculicola）和成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans），入窖池樣品分離到發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans），發(fā)酵12 d、發(fā)酵18 d和發(fā)酵24 d均分離到布氏慢生乳桿菌（Lentilactobacillus buchneri），發(fā)酵12 d樣品還分離到短發(fā)酵乳桿菌（Levilactobacillus brevis），發(fā)酵18 d分離到希爾加德慢生乳桿菌（Lentilactobacillus hilgardii）和高原芽孢桿菌（Bacillus altitudinis），發(fā)酵30 d樣品分離到枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

表1 不同發(fā)酵時間酒醅樣品中可培養(yǎng)微生物分離結(jié)果Table 1 Isolation results of culturable microorganism of fermented grains samples at different fermentation time

2.2 不同發(fā)酵時間酒醅樣品微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 真菌群落組成分析

在屬水平上，基于高通量測序技術(shù)對7個不同發(fā)酵時間樣品真菌的種類和相對豐度進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1。由圖1可知，7個不同發(fā)酵時間樣品共測序獲得真菌435 114個OTUs，種水平上共有224種OTUs，優(yōu)勢菌種（相對豐度＞1%）主要有發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）、橙色嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus）、謝瓦曲霉（Aspergillus chevalieri）、棉毛狀嗜熱霉（Thermomyces lanuginosus）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）同物異名為庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、少孢畢赤酵母（Pichia exigua）與臭曲霉（Aspergillus foetidus）。入窖堆積樣品中主要有橙色嗜熱子囊菌（Thermoascusaurantiacus）、謝瓦曲霉（Aspergillus chevalieri）和棉毛狀嗜熱（Thermomyces lanuginosus）3種菌，入窖池發(fā)酵樣品中主要包含發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）、橙色嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus）、謝瓦曲霉（Aspergillus chevalieri）、棉毛狀嗜熱霉（Thermomyces lanuginosus）4種菌，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）、謝瓦曲霉（Aspergillus chevalieri）、棉毛狀嗜熱霉（Thermomyces lanuginosus）和少孢畢赤酵母（Pichia exigua）比例逐漸減小，東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）逐漸增多。發(fā)酵時間在18～30 d時，微生物多樣性增多，相對豐度增大。

圖1 基于屬水平不同發(fā)酵時間酒醅樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)Fig.1 Fungal community structure of fermented grains samples at different fermentation time based on genus level

2.2.2 細(xì)菌群落組成分析

在屬水平上，基于高通量測序技術(shù)對7個不同發(fā)酵時間樣品細(xì)菌的種類和相對豐度進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知，7個不同發(fā)酵時間樣品共測序獲得細(xì)菌422 720個OTUs，種水平上共有304種OTUs，發(fā)酵起始細(xì)菌種類較多，優(yōu)勢菌種（相對豐度＞1%）主要有金山醋酸乳桿菌（Acetilactobacillus jinshanensis）、耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、考氏科薩克氏菌（Kosakonia cowanii）、魏斯氏菌（Weissella confuse）、乳桿菌屬（Lactobacillussp.）、雞葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum）、巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）、小片球菌（Pediococcus parvulus）、橋乳桿菌（Lactobacillus pontis）和發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）。入窖堆積樣品中優(yōu)勢菌種有10種，分別為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、考氏科薩克氏菌（Kosakonia cowanii）、魏斯氏菌（Weissella confuse）、雞葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum）、斯氏泛菌（Pantoea stewartii）、戊糖片球菌（Pediococcus pen tosaceus）、橋乳桿菌（Lactobacillus pontis）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、直桿糖多孢菌（Saccharopolyspora rectivirgula）和類食品乳桿菌（Lactobacillus paralimentarius）。入窖池發(fā)酵樣品中主要包含金山醋酸乳桿菌（Acetilactobacillus jinshanensis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、考氏科薩克氏菌（Kosakonia cowanii）、魏斯氏菌（Weissellaconfuse）、雞葡萄球菌（Staphylococcusgallinarum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）、橋乳桿菌（Lactobacillus pontis）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、直桿糖多孢菌（Saccharopolyspora rectivirgula）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、玫瑰色葡糖桿菌（Gluconobacter roseus）、舊金山乳酸菌（Lactobacillus sanfranciscensis）和解糖腸球菌（Enterococcus saccharolyticus）。隨著發(fā)酵時間延長，金山醋酸乳桿菌（Acetilactobacillus jinshanensis）快速增加，發(fā)酵18～30 d時，樣品中金山醋酸乳桿菌（Acetilactobacillus jinshanensis）和耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）相對豐度＞97%。

圖2 基于屬水平不同發(fā)酵時間酒醅樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Bacterial community structure of fermented grains samples at different fermentation time based on genus level

2.3 窖池酒醅發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌特性分析

窖池酒醅發(fā)酵過程中細(xì)菌、酵母菌、霉菌之間有相互促進(jìn)也有相互拮抗作用，隨著溫度、酒精濃度、酸度和氧氣含量等因素的變化，微生物群落結(jié)構(gòu)不斷的演化，不同微生物對原料中淀粉和蛋白質(zhì)分解，生成各類代謝產(chǎn)物[17]。這些代謝產(chǎn)物最終進(jìn)入生化反應(yīng)中進(jìn)行大量復(fù)雜的物質(zhì)轉(zhuǎn)化及能量代謝，形成重要風(fēng)味物質(zhì)。謝瓦曲霉（Aspergillus chevalieri）和臭曲霉（Aspergillus foetidus）有產(chǎn)酶和糖化的作用[18-19]，枯草芽孢菌（Bacillus subtilis）、高原芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）和解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）主要具有耐高溫、產(chǎn)酶、產(chǎn)香的功能，與一些風(fēng)味物質(zhì)（如吡嗪類化合物）的形成有關(guān)[20]，發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）在不同底物和不同環(huán)境調(diào)節(jié)下，代謝產(chǎn)物主要有醇、酯、酸[21-23]，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）可將葡萄糖在無氧條件下發(fā)酵成為酒精和二氧化碳，是主要的產(chǎn)酒酵母；Trichomonascus ciferrii具有重要產(chǎn)香功能[24]，橫梗霉屬（Lichtheimiasp.）與芳香類物質(zhì)呈顯著正相關(guān)[25]，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）與釀酒酵母共同作用對酯類、醇類和醛酮類等大部分揮發(fā)性物質(zhì)的形成有明顯促進(jìn)作用[26]，金山醋酸乳桿菌（Acetilactobacillus jinshanensis）有利于有機(jī)酸的產(chǎn)生[27]，耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）具有優(yōu)良的耐酸和產(chǎn)酸特性，有利于其在白酒釀造過程中生長繁殖并豐富白酒風(fēng)味[28]?？际峡扑_克氏菌（Kosakonia cowanii）具有產(chǎn)阿魏酸酯酶功能，能夠增加麩皮、大曲和糟醅中阿魏酸的釋放量，使得樣品中阿魏酸含量增加[29]。魏斯氏菌（Weissella confuse）可以產(chǎn)生酸、醛、酮和酯等風(fēng)味物質(zhì)[30]。

2.4 Alpha多樣性指數(shù)分析

Alpha多樣性指數(shù)是用來分析樣本內(nèi)的微生物群落多樣性，通過對樣本該指數(shù)的分析可以反映樣本內(nèi)微生物群落的豐富度和多樣性。其中，Chao1和Ace指數(shù)是估計樣品中的物種總數(shù)，指數(shù)值越大，表示樣品中群落豐富度越高。Shannon 指數(shù)反映群落的多樣性，Simpson 指數(shù)反映群落中優(yōu)勢種的集中程度，Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，說明樣品中的物種多樣性越高。深度測序指數(shù)Coverage是指各樣品文庫的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣品中序列被測出的概率越高。不同發(fā)酵時期樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)分析結(jié)果見表2。

由表2可知，7個樣品真菌的Chao1指數(shù)在37.143～111.111，呈現(xiàn)先增大后降低趨勢；Ace指數(shù)在48.370～105.176，豐富度最高的是發(fā)酵12 d樣品，但與發(fā)酵6 d和發(fā)酵24 d不具有顯著差異（P＞0.05），入窖堆積樣品顯著低于其他樣品（P＜0.05）。樣品的Shannon指數(shù)在1.052～2.235；Simpson 指數(shù)在0.172～0.536，多樣性最高的是發(fā)酵18 d樣品，最低的是發(fā)酵6 d樣品。

由表2可知，7個樣品細(xì)菌的Chao1 指數(shù)在17.0 ～211.091之間，呈逐漸降低趨勢；Ace指數(shù)在19.303～213.195，豐富度最高的是發(fā)酵0 d樣品，但與發(fā)酵6 d樣品不具有顯著差異（P＞0.05），發(fā)酵24 d與發(fā)酵30 d樣品顯著低于其他樣品（P＜0.05），但二者之間不具有顯著差異（P＞0.05）。樣品的Shannon指數(shù)在0.184～2.569；Simpson指數(shù)在0.139～0.932，發(fā)酵0 d與入窖堆積樣品多樣性最高， 但二者不具有顯著差異（P＞0.05），發(fā)酵18 d顯著低于其他樣品（P＜0.05）。所有樣品的Coverage均＞0.999， 表明測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣本中所有的物種。

2.5 不同發(fā)酵時期酒醅樣品及原酒理化指標(biāo)測定

不同發(fā)酵時期酒醅樣品理化指標(biāo)測定結(jié)果見圖3。 由圖3a可知，隨著發(fā)酵時間的增加，酒醅中的水分含量逐漸增加，增幅10.54%，微生物的生長繁殖和物質(zhì)代謝都伴隨著水分的生成和消耗，水分在整個測量過程呈上升趨勢，由此可見發(fā)酵過程中產(chǎn)生的水分要大于消耗的水分。發(fā)酵前6 d水分含量由56.2%增加至58.8%，主要由于菌群快速繁殖，產(chǎn)生較多的代謝水，水的含量增加較快。 發(fā)酵6～24 d，水分含量增加減緩，主要由于氧氣的消耗，酒精度的增加，導(dǎo)致部分微生物死亡，代謝產(chǎn)生的水有所減少。發(fā)酵后6 d酒醅中水分含量上升最快，可以推測微生物在這段時間活動比較旺盛。

圖3 不同發(fā)酵時間酒醅樣品的理化指標(biāo)測定結(jié)果Fig.3 Determination results of physicochemical indexes of fermented grains samples at different fermentation time

酒醅中酸度主要來源于部分微生物產(chǎn)酸代謝和脂肪、淀粉、蛋白質(zhì)的降解。酸度是決定白酒質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一。窖池中適當(dāng)?shù)乃岫瓤梢砸种撇糠钟泻﹄s菌的生長繁殖，促進(jìn)呈香呈味物質(zhì)的形成，參與酯化過程。然而，窖池酸度過高，會使發(fā)酵緩慢，產(chǎn)酒率降低[31]。 由圖3b可知，發(fā)酵過程中酸度呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，酸度由入窖時的1.25 mmol/10 g增加到出窖的3.2 mmol/10 g，酸度增幅1.95 mmol/10 g。發(fā)酵前期霉菌、酵母菌大量增殖在酒醅中占據(jù)主導(dǎo)地位，產(chǎn)酸菌利用前期生成的還原糖和乙醇產(chǎn)生較多的酸，中后期隨著營養(yǎng)物質(zhì)及氧的消耗，酵母菌逐漸衰亡，此時部分厭氧及兼性厭氧細(xì)菌大量增殖產(chǎn)生多種有機(jī)酸，使得酒醅酸度持續(xù)升高。

白酒釀造過程中，糟醅中淀粉和還原糖含量的動態(tài)變化既間接反映了乙醇生成和發(fā)酵狀態(tài)，也顯示了糟醅中微生物代謝活性。由圖3c可知，隨著發(fā)酵的時間增加，酒醅中的還原糖含量逐漸減少，還原糖降幅2.9%。發(fā)酵前6 d，還原糖減少很快，可見在發(fā)酵的前期還原糖被酵母菌和一些產(chǎn)酸菌大量利用導(dǎo)致產(chǎn)糖的減少，使還原糖快速下降；發(fā)酵6～18 d還原糖有少量增加，說明酒醅中的菌群糖化作用非常明顯，產(chǎn)生的還原糖略高于消耗的。 發(fā)酵18～30 d，還原糖快速降低，推測酒精的積累對糖化酶的抑制作用，消耗量明顯大于產(chǎn)生量。由圖3d可知，隨著發(fā)酵的時間增加，酒醅中的淀粉含量逐漸減少，淀粉消耗12.64%。淀粉在發(fā)酵前6 d由20.8%降至16.1%，消耗量比較大，這是因為菌群的糖化作用消耗了大量的淀粉；發(fā)酵6～24 d下降趨勢減緩，由16.1%下降至11.3%，一方面因為酸度以及酒精度的增大，抑制了淀粉酶的作用，另一方面可能是由于窖池氧氣的減少導(dǎo)致霉菌大量死亡，糖化作用減弱。發(fā)酵24～30 d，淀粉含量繼續(xù)快速下降，推測可能由于厭氧菌或兼性厭氧菌的繁殖，加速了淀粉的消耗。

原酒理化指標(biāo)測定結(jié)果為總酸1.42 g/L，總酯3.81 g/L，酒精度66.7%vol。山東扳倒井股份有限公司評酒團(tuán)隊對酒樣進(jìn)行品評：聞香帶糟香，稍帶青味，較醇和，后味較長，帶甜香，較細(xì)膩。

2.6 原酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析結(jié)果

通過GC-MS對原酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測，結(jié)果見表3。由表3可知，原酒酒樣中共檢測出56種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類27種，酸類9種，醇類11種，烷類3種，其他6種。參考相關(guān)文獻(xiàn)，其中具有揮發(fā)性風(fēng)味的物質(zhì)41種，OAV＞1的有兩種，正己酸乙酯OAV為6.326 2，辛酸乙酯OAV為1.725 7。正己酸乙酯具有甜香，水果香，窖香，青瓜香；辛酸乙酯具有梨子香，荔枝香，水果香，甜香，百合花香等氣味。此兩種物質(zhì)為原酒中關(guān)鍵風(fēng)味化合物，對樣品總體香氣貢獻(xiàn)較大。

表3 原酒樣品中揮發(fā)性風(fēng)味成分GC-MS檢測結(jié)果Table 3 GC-MS determination results of volatile flavor components in original liquor samples

3 結(jié)論

本研究對國井白酒窖池發(fā)酵中微生物群落結(jié)構(gòu)及風(fēng)味物質(zhì)的進(jìn)行了研究，通過可培養(yǎng)技術(shù)共分離獲得14種微生物，涵蓋11個屬，其中真菌5種，分別為謝瓦曲霉（Aspergillus chevalieri）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）、橫梗霉屬（Lichtheimiasp.）和Trichomonascus ciferrii；細(xì)菌9種，分別為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、布氏慢生乳桿菌（Lentilactobacillus buchneri）、啄木鳥腸球菌（Enterococcus phoeniculicola）、成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、短發(fā)酵乳桿菌（Levilactobacillus brevis）、希爾加德慢生乳桿菌（Lentilactobacillus hilgardii）和高原芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）。通過高通量測序發(fā)現(xiàn)真菌優(yōu)勢菌主要有發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）、橙色嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus）、謝瓦曲霉（Aspergillus chevalieri）、棉毛狀嗜熱霉（Thermomyces lanuginosus）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）同物異名為庫德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、少孢畢赤酵母（Pichia exigua）與臭曲霉（Aspergillus foetidus）；細(xì)菌優(yōu)勢菌主要有金山醋酸乳桿菌（Acetilactobacillus jinshanensis）、耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefa ciens）、考氏科薩克氏菌（Kosakonia cowanii）、魏斯氏菌（Weissella confuse）、乳桿菌屬（Lactobacillussp.）、雞葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum）、巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）、小片球菌（Pediococcus parvulus）、橋乳桿菌（Lactobacillus pontis）和發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）。通過對不同發(fā)酵時間樣品理化指標(biāo)測定，水分含量增幅10.54%，酸度增幅1.95，還原糖降幅2.9%，淀粉消耗12.64%。通過GC-MS分析，共檢測出56種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類27種，酸類9種，醇類11種，烷類3種，其他類6種。采用氣味活度值評價了各化合物對樣品總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)正己酸乙酯和辛酸乙酯OVA較大，是原酒中關(guān)鍵風(fēng)味化合物，對總體風(fēng)味起到主要貢獻(xiàn)。